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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo describe la recolección, expansión y diferenciación de células epiteliales nasales a modelos organotípicos de células epiteliales de las vías respiratorias y la cuantificación de la frecuencia de latidos de los cilios a través de imágenes de células vivas y guiones personalizados.

Resumen

Las mediciones de la función de los cilios (frecuencia de latido, patrón) se han establecido como herramientas de diagnóstico para enfermedades respiratorias como la discinesia ciliar primaria. Sin embargo, la aplicación más amplia de estas técnicas está limitada por la extrema susceptibilidad de la función ciliar a los cambios en los factores ambientales, por ejemplo, temperatura, humedad y pH. En las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (FQ), la acumulación de moco impide el latido de los cilios. La función de los cilios se ha investigado en modelos de células primarias de las vías respiratorias como un indicador de la actividad del canal CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR). Sin embargo, se ha encontrado una considerable variabilidad de paciente a paciente en la frecuencia de latidos de los cilios en respuesta a los fármacos moduladores de CFTR, incluso para pacientes con las mismas mutaciones de CFTR . Además, el impacto de la secreción disfuncional de cloruro regulada por CFTR en la función ciliar es poco conocido. Actualmente no existe un protocolo integral que demuestre la preparación de muestras de modelos de vías respiratorias in vitro , la adquisición de imágenes y el análisis de la frecuencia de latido de los cilios (CBF). Las condiciones de cultivo estandarizadas y la adquisición de imágenes realizadas en una condición ambientalmente controlada permitirían una cuantificación consistente y reproducible de CBF entre individuos y en respuesta a fármacos moduladores de CFTR. Este protocolo describe la cuantificación de CBF en tres sistemas diferentes de modelos de células epiteliales de las vías respiratorias: 1) láminas epiteliales nativas, 2) modelos de interfaz aire-líquido fotografiados en insertos de soporte permeables y 3) organoides tridimensionales incrustados en matriz extracelular. Los dos últimos replican la fisiología pulmonar in vivo , con cilios batidos y producción de moco. La función ciliar se captura utilizando una cámara de vídeo de alta velocidad en una cámara controlada por el entorno. Se utilizan scripts personalizados para el análisis de CBF. Se prevé que la traducción de las mediciones de CBF a la clínica sea una herramienta clínica importante para predecir la respuesta a los fármacos moduladores de CFTR por paciente.

Introducción

Las mediciones de la frecuencia de latido de los cilios (CBF) y el patrón se han establecido como herramientas de diagnóstico para enfermedades respiratorias como la discinesia ciliar primaria (PCD)1. En la fibrosis quística (FQ), la disfunción del canal de cloruro del regulador de conductancia transmembrana (CFTR) de la FQ causa deshidratación del líquido de la superficie de las vías respiratorias y alteración del aclaramiento mucociliar2. La función ciliar ha sido investigada in vitro en modelos de células primarias de la vía aérea como indicador de la actividad del canal CFTR3. Sin emb....

Protocolo

Se recibió la aprobación del estudio de la Junta de Revisión Ética de la Red del Hospital de Niños de Sydney (HREC/16/SCHN/120). Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes (o del tutor de los participantes) antes de la recolección de muestras biológicas.

1. Preparativos para establecer modelos de células epiteliales de la vía aérea

  1. Prepare los medios de recolección de células nasales combinando 80% de medio de águila modificado de Dulbecco y 20% de suero bovino fetal. Suplemento con 1 μL/mL de Penicilina/Estreptomicina. Conservar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
  2. Cubra los matr....

Resultados

Para demostrar la eficiencia de este protocolo en la cuantificación de CBF, se presentan los resultados de CBF medidos en modelos de ALI de células epiteliales de la vía aérea derivados de tres participantes con FQ y tres participantes control sanos. En el día 14 de diferenciación del cultivo, los cilios batidos estaban presentes (Figura 6). Del día 14 al 21 de diferenciación de cultivos, se observó un aumento estadísticamente significativo (P < 0,0345) en CBF dentro de ambas cohor.......

Discusión

Existen múltiples factores que podrían oscurecer la cuantificación de CBF en láminas epiteliales nasales. Las hojas epiteliales deben ser fotografiadas dentro de las 3-9 horas de la recolección de la muestra, ya que la función ciliar es más estable durante este tiempo37. Menos glóbulos rojos y desechos son los más óptimos para obtener imágenes, ya que interfieren con la adquisición de datos. Al seleccionar un ROI para la obtención de imágenes, es importante seleccionar una hoja epite.......

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a los participantes del estudio y sus familias por sus contribuciones. Agradecemos la asistencia del departamento respiratorio de Randwick de Sydney Children's Hospitals (SCH) en la organización y recolección de muestras biológicas de pacientes, un agradecimiento especial al Dr. John Widger, la Dra. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson y Rhonda Bell. Reconocemos la asistencia de Iveta Slapetova y Renee Whan del Centro de Microscopía de Luz Katharina Gaus dentro del Centro Analítico Mark Wainwright en UNSW Sydney. Este trabajo cuenta con el apoyo del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (NHMRC) Australia (GNT1188987), CF Foundation Aus....

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineSigma-AldrichA278610 mg/mL
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634-010
Alanyl-glutamineSigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford InstrumentsFast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter systemSigma-AldrichCLS431098
Ceftazidime hydrateSigma-AldrichA698750 mg/mL
Cell Culture MicroscopeOlympusCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCNikon Instruments Inc.MRH08230Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxinSigma-AldrichC8052-1MG200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UMSigma-AldrichCLS431750Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)Corning356231Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter systemSigma-AldrichCLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing ContainerSigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture insertsSigma-AldrichCLS3470Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher ScientificAMQAX1000Automated cell counter
Cytology brushesMcFarlane Medical33009
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM-High GlucoseThermo Fisher Scientific11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-ENikonLive-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United StatesThermo Fisher Scientific10082147
Fungizone (Amphotericin B)Thermo Fisher Scientific15290018250 µg/mL
Gentamicin solutionSigma-AldrichG139750 mg/mL
Graphpad PrismGraphpadScientific analysis software
Greiner Cryo.s vialsSigma-AldrichV3135Cryogenic vials
HEPES solutionSigma-AldrichH08871 M
HI-FBSThermo Fisher Scientific10082-147
HydrocortisoneSigma-AldrichH08883.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000PeConMicroscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
InsulinSigma-AldrichI26432 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6LJohn Morris Group74220 706Bead bath
Lab Armor BeadsThermo Fisher ScientificA1254302Thermal beads
MATLABMathWorksComputing software
Microsoft ExcelMicroscoftSpreadsheet software
NIH/3T3American Type Culture CollectionCRL-1658Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements ARNikon Instruments Inc.Image acquisition software
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP433310,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
PneumaCult Airway Organoid KitStemCell Technologies5060Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI MediumStemCell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus MediumStemCell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture ReagentsLonzaCC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)Sigma-AldrichE964425 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)SelleckchemS104910 mM
TobramycinSigma-AldrichT4014100 mg/mL
Trypan blue solutionSigma-AldrichT81540.4%
UNO Stage Top IncubatorOkolabMicroscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning

Referencias

  1. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  2. Cutting, G. R.

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