Recopilación, expansión y diferenciación de modelos primarios de células epiteliales nasales humanas para la cuantificación de la frecuencia de latido de los cilios

Resumen

Este protocolo describe la recolección, expansión y diferenciación de células epiteliales nasales a modelos organotípicos de células epiteliales de las vías respiratorias y la cuantificación de la frecuencia de latidos de los cilios a través de imágenes de células vivas y guiones personalizados.

Resumen

Las mediciones de la función de los cilios (frecuencia de latido, patrón) se han establecido como herramientas de diagnóstico para enfermedades respiratorias como la discinesia ciliar primaria. Sin embargo, la aplicación más amplia de estas técnicas está limitada por la extrema susceptibilidad de la función ciliar a los cambios en los factores ambientales, por ejemplo, temperatura, humedad y pH. En las vías respiratorias de los pacientes con fibrosis quística (FQ), la acumulación de moco impide el latido de los cilios. La función de los cilios se ha investigado en modelos de células primarias de las vías respiratorias como un indicador de la actividad del canal CF Transmembrane conductance Regulator (CFTR). Sin embargo, se ha encontrado una considerable variabilidad de paciente a paciente en la frecuencia de latidos de los cilios en respuesta a los fármacos moduladores de CFTR, incluso para pacientes con las mismas mutaciones de CFTR . Además, el impacto de la secreción disfuncional de cloruro regulada por CFTR en la función ciliar es poco conocido. Actualmente no existe un protocolo integral que demuestre la preparación de muestras de modelos de vías respiratorias in vitro , la adquisición de imágenes y el análisis de la frecuencia de latido de los cilios (CBF). Las condiciones de cultivo estandarizadas y la adquisición de imágenes realizadas en una condición ambientalmente controlada permitirían una cuantificación consistente y reproducible de CBF entre individuos y en respuesta a fármacos moduladores de CFTR. Este protocolo describe la cuantificación de CBF en tres sistemas diferentes de modelos de células epiteliales de las vías respiratorias: 1) láminas epiteliales nativas, 2) modelos de interfaz aire-líquido fotografiados en insertos de soporte permeables y 3) organoides tridimensionales incrustados en matriz extracelular. Los dos últimos replican la fisiología pulmonar in vivo , con cilios batidos y producción de moco. La función ciliar se captura utilizando una cámara de vídeo de alta velocidad en una cámara controlada por el entorno. Se utilizan scripts personalizados para el análisis de CBF. Se prevé que la traducción de las mediciones de CBF a la clínica sea una herramienta clínica importante para predecir la respuesta a los fármacos moduladores de CFTR por paciente.

Introducción

Las mediciones de la frecuencia de latido de los cilios (CBF) y el patrón se han establecido como herramientas de diagnóstico para enfermedades respiratorias como la discinesia ciliar primaria (PCD)¹. En la fibrosis quística (FQ), la disfunción del canal de cloruro del regulador de conductancia transmembrana (CFTR) de la FQ causa deshidratación del líquido de la superficie de las vías respiratorias y alteración del aclaramiento mucociliar². La función ciliar ha sido investigada in vitro en modelos de células primarias de la vía aérea como indicador de la actividad del canal CFTR³. Sin emb....

Protocolo

Se recibió la aprobación del estudio de la Junta de Revisión Ética de la Red del Hospital de Niños de Sydney (HREC/16/SCHN/120). Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los participantes (o del tutor de los participantes) antes de la recolección de muestras biológicas.

1. Preparativos para establecer modelos de células epiteliales de la vía aérea

1. Prepare los medios de recolección de células nasales combinando 80% de medio de águila modificado de Dulbecco y 20% de suero bovino fetal. Suplemento con 1 μL/mL de Penicilina/Estreptomicina. Conservar a 4 °C durante un máximo de 3 meses.
2. Cubra los matr....

Resultados

Para demostrar la eficiencia de este protocolo en la cuantificación de CBF, se presentan los resultados de CBF medidos en modelos de ALI de células epiteliales de la vía aérea derivados de tres participantes con FQ y tres participantes control sanos. En el día 14 de diferenciación del cultivo, los cilios batidos estaban presentes (Figura 6). Del día 14 al 21 de diferenciación de cultivos, se observó un aumento estadísticamente significativo (P < 0,0345) en CBF dentro de ambas cohor.......

Discusión

Existen múltiples factores que podrían oscurecer la cuantificación de CBF en láminas epiteliales nasales. Las hojas epiteliales deben ser fotografiadas dentro de las 3-9 horas de la recolección de la muestra, ya que la función ciliar es más estable durante este tiempo³⁷. Menos glóbulos rojos y desechos son los más óptimos para obtener imágenes, ya que interfieren con la adquisición de datos. Al seleccionar un ROI para la obtención de imágenes, es importante seleccionar una hoja epite.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	10 mg/mL
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Alanyl-glutamine	Sigma-Aldrich	G8541	200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOS	Oxford Instruments		Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Ceftazidime hydrate	Sigma-Aldrich	A6987	50 mg/mL
Cell Culture Microscope	Olympus	CKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC	Nikon Instruments Inc.	MRH08230	Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052-1MG	200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UM	Sigma-Aldrich	CLS431750	Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)	Corning	356231	Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container	Sigma-Aldrich	CLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts	Sigma-Aldrich	CLS3470	Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Cytology brushes	McFarlane Medical	33009
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM-High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Eclipse Ti2-E	Nikon		Live-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Thermo Fisher Scientific	10082147
Fungizone (Amphotericin B)	Thermo Fisher Scientific	15290018	250 µg/mL
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL
Graphpad Prism	Graphpad		Scientific analysis software
Greiner Cryo.s vials	Sigma-Aldrich	V3135	Cryogenic vials
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M
HI-FBS	Thermo Fisher Scientific	10082-147
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	3.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000	PeCon		Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643	2 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L	John Morris Group	74220 706	Bead bath
Lab Armor Beads	Thermo Fisher Scientific	A1254302	Thermal beads
MATLAB	MathWorks		Computing software
Microsoft Excel	Microscoft		Spreadsheet software
NIH/3T3	American Type Culture Collection	CRL-1658	Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements AR	Nikon Instruments Inc.		Image acquisition software
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
PneumaCult Airway Organoid Kit	StemCell Technologies	5060	Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI Medium	StemCell Technologies	5001
PneumaCult-Ex Plus Medium	StemCell Technologies	5040
PureCol-S	Advanced BioMatrix	5015	Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)	Sigma-Aldrich	E9644	25 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)	Selleckchem	S1049	10 mM
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014	100 mg/mL
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
UNO Stage Top Incubator	Okolab		Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning