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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit la collecte, l’expansion et la différenciation des cellules épithéliales nasales en modèles organotypiques de cellules épithéliales des voies respiratoires et la quantification de la fréquence des battements de cils via l’imagerie de cellules vivantes et des scripts personnalisés.

Résumé

Les mesures de la fonction des cils (fréquence des battements, modèle) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive. Cependant, l’application plus large de ces techniques est limitée par l’extrême susceptibilité de la fonction ciliaire aux changements de facteurs environnementaux, par exemple la température, l’humidité et le pH. Dans les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose (FK), l’accumulation de mucus empêche les cils battants. La fonction des cils a été étudiée dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité du canal CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) de la FC. Cependant, une variabilité considérable d’un patient à l’autre dans la fréquence des battements de cils a été observée en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR, même pour les patients présentant les mêmes mutations CFTR . De plus, l’impact de la sécrétion de chlorure régulée par le CFTR sur la fonction ciliaire est mal compris. Il n’existe actuellement aucun protocole complet démontrant la préparation d’échantillons de modèles de voies respiratoires in vitro , l’acquisition d’images et l’analyse de la fréquence de battement des cils (CBF). Des conditions de culture normalisées et l’acquisition d’images effectuées dans des conditions environnementales contrôlées permettraient une quantification cohérente et reproductible du FBC entre les individus et en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR. Ce protocole décrit la quantification du CBF dans trois systèmes différents de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires : 1) les feuilles épithéliales natives, 2) les modèles d’interface air-liquide imagés sur des inserts de support perméables et 3) les organoïdes tridimensionnels intégrés dans la matrice extracellulaire. Les deux derniers reproduisent la physiologie pulmonaire in vivo , avec des cils battants et la production de mucus. La fonction ciliaire est capturée à l’aide d’une caméra vidéo haute vitesse dans une chambre contrôlée par l’environnement. Des scripts personnalisés sont utilisés pour l’analyse des CBF. L’application des mesures de la FBC à la clinique est envisagée comme un outil clinique important pour prédire la réponse aux médicaments modulateurs du CFTR par patient.

Introduction

Les mesures de la fréquence et du profil des battements des cils (CBF) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive (DCP)1. Dans la mucoviscidose (FK), le dysfonctionnement du canal chlorure du régulateur de conductance transmembranaire (CFTR) de la mucoviscidose provoque une déshydratation du liquide de surface des voies respiratoires et une altération de la clairance mucociliaire2. La fonction ciliaire a été étudiée in vitro dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité des canaux CFT....

Protocole

L’étude a été approuvée par le Sydney Children’s Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Le consentement écrit de tous les participants (ou de leur tuteur) a été obtenu avant le prélèvement des échantillons biologiques.

1. Préparations pour l’établissement de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires

  1. Préparer le milieu de prélèvement des cellules nasales en combinant 80 % de milieu aigle modifié de Dulbecco et 20 % de sérum bovin fœtal. Compléter avec 1 μL/mL de pénicilline/streptomycine. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
  2. Enduisez les flacons ou les inserts de support permé....

Résultats

Pour démontrer l’efficacité de ce protocole dans la quantification de la FBC, les résultats de la FBC mesurée dans des modèles d’ALI sur les cellules épithéliales des voies respiratoires dérivés de trois participants atteints de mucoviscidose et de trois participants témoins sains sont présentés. Au jour 14 de la différenciation de la culture, des cils battants étaient présents (Figure 6). Du jour 14 au jour 21 de la différenciation par culture, une augmentation statistiq.......

Discussion

Il existe de multiples facteurs qui pourraient obscurcir la quantification du CBF dans les feuillets épithéliaux nasaux. Les feuilles épithéliales doivent être imagées dans les 3 à 9 heures suivant le prélèvement de l’échantillon, car la fonction ciliaire est la plus stable pendant cette période37. Moins de globules rouges et de débris sont les plus optimaux pour l’imagerie, car ils interfèrent avec l’acquisition de données. Lors de la sélection d’un retour sur investissemen.......

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions les participants à l’étude et leurs familles pour leurs contributions. Nous apprécions l’aide du service respiratoire de Randwick des hôpitaux pour enfants de Sydney (SCH) dans l’organisation et la collecte des échantillons biologiques des patients - un merci spécial au Dr John Widger, à la Dre Yvonne Belessis, à Leanne Plush, à Amanda Thompson et à Rhonda Bell. Nous remercions Iveta Slapetova et Renee Whan de l’installation de microscopie optique Katharina Gaus du Centre d’analyse Mark Wainwright de l’UNSW Sydney. Ce travail est soutenu par le National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), la CF Foundation Australia et la....

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineSigma-AldrichA278610 mg/mL
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634-010
Alanyl-glutamineSigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford InstrumentsFast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter systemSigma-AldrichCLS431098
Ceftazidime hydrateSigma-AldrichA698750 mg/mL
Cell Culture MicroscopeOlympusCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCNikon Instruments Inc.MRH08230Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxinSigma-AldrichC8052-1MG200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UMSigma-AldrichCLS431750Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)Corning356231Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter systemSigma-AldrichCLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing ContainerSigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture insertsSigma-AldrichCLS3470Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher ScientificAMQAX1000Automated cell counter
Cytology brushesMcFarlane Medical33009
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM-High GlucoseThermo Fisher Scientific11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-ENikonLive-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United StatesThermo Fisher Scientific10082147
Fungizone (Amphotericin B)Thermo Fisher Scientific15290018250 µg/mL
Gentamicin solutionSigma-AldrichG139750 mg/mL
Graphpad PrismGraphpadScientific analysis software
Greiner Cryo.s vialsSigma-AldrichV3135Cryogenic vials
HEPES solutionSigma-AldrichH08871 M
HI-FBSThermo Fisher Scientific10082-147
HydrocortisoneSigma-AldrichH08883.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000PeConMicroscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
InsulinSigma-AldrichI26432 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6LJohn Morris Group74220 706Bead bath
Lab Armor BeadsThermo Fisher ScientificA1254302Thermal beads
MATLABMathWorksComputing software
Microsoft ExcelMicroscoftSpreadsheet software
NIH/3T3American Type Culture CollectionCRL-1658Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements ARNikon Instruments Inc.Image acquisition software
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP433310,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
PneumaCult Airway Organoid KitStemCell Technologies5060Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI MediumStemCell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus MediumStemCell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture ReagentsLonzaCC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)Sigma-AldrichE964425 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)SelleckchemS104910 mM
TobramycinSigma-AldrichT4014100 mg/mL
Trypan blue solutionSigma-AldrichT81540.4%
UNO Stage Top IncubatorOkolabMicroscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning

Références

  1. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  2. Cutting, G. R.

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