Collecte, expansion et différenciation de modèles de cellules épithéliales nasales nasales humaines primaires pour la quantification de la fréquence des battements de cils

Résumé

Ce protocole décrit la collecte, l’expansion et la différenciation des cellules épithéliales nasales en modèles organotypiques de cellules épithéliales des voies respiratoires et la quantification de la fréquence des battements de cils via l’imagerie de cellules vivantes et des scripts personnalisés.

Résumé

Les mesures de la fonction des cils (fréquence des battements, modèle) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive. Cependant, l’application plus large de ces techniques est limitée par l’extrême susceptibilité de la fonction ciliaire aux changements de facteurs environnementaux, par exemple la température, l’humidité et le pH. Dans les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose (FK), l’accumulation de mucus empêche les cils battants. La fonction des cils a été étudiée dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité du canal CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) de la FC. Cependant, une variabilité considérable d’un patient à l’autre dans la fréquence des battements de cils a été observée en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR, même pour les patients présentant les mêmes mutations CFTR . De plus, l’impact de la sécrétion de chlorure régulée par le CFTR sur la fonction ciliaire est mal compris. Il n’existe actuellement aucun protocole complet démontrant la préparation d’échantillons de modèles de voies respiratoires in vitro , l’acquisition d’images et l’analyse de la fréquence de battement des cils (CBF). Des conditions de culture normalisées et l’acquisition d’images effectuées dans des conditions environnementales contrôlées permettraient une quantification cohérente et reproductible du FBC entre les individus et en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR. Ce protocole décrit la quantification du CBF dans trois systèmes différents de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires : 1) les feuilles épithéliales natives, 2) les modèles d’interface air-liquide imagés sur des inserts de support perméables et 3) les organoïdes tridimensionnels intégrés dans la matrice extracellulaire. Les deux derniers reproduisent la physiologie pulmonaire in vivo , avec des cils battants et la production de mucus. La fonction ciliaire est capturée à l’aide d’une caméra vidéo haute vitesse dans une chambre contrôlée par l’environnement. Des scripts personnalisés sont utilisés pour l’analyse des CBF. L’application des mesures de la FBC à la clinique est envisagée comme un outil clinique important pour prédire la réponse aux médicaments modulateurs du CFTR par patient.

Introduction

Les mesures de la fréquence et du profil des battements des cils (CBF) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive (DCP)¹. Dans la mucoviscidose (FK), le dysfonctionnement du canal chlorure du régulateur de conductance transmembranaire (CFTR) de la mucoviscidose provoque une déshydratation du liquide de surface des voies respiratoires et une altération de la clairance mucociliaire². La fonction ciliaire a été étudiée in vitro dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité des canaux CFT....

Protocole

L’étude a été approuvée par le Sydney Children’s Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Le consentement écrit de tous les participants (ou de leur tuteur) a été obtenu avant le prélèvement des échantillons biologiques.

1. Préparations pour l’établissement de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires

1. Préparer le milieu de prélèvement des cellules nasales en combinant 80 % de milieu aigle modifié de Dulbecco et 20 % de sérum bovin fœtal. Compléter avec 1 μL/mL de pénicilline/streptomycine. Conserver à 4 °C jusqu’à 3 mois.
2. Enduisez les flacons ou les inserts de support permé....

Résultats

Pour démontrer l’efficacité de ce protocole dans la quantification de la FBC, les résultats de la FBC mesurée dans des modèles d’ALI sur les cellules épithéliales des voies respiratoires dérivés de trois participants atteints de mucoviscidose et de trois participants témoins sains sont présentés. Au jour 14 de la différenciation de la culture, des cils battants étaient présents (Figure 6). Du jour 14 au jour 21 de la différenciation par culture, une augmentation statistiq.......

Discussion

Il existe de multiples facteurs qui pourraient obscurcir la quantification du CBF dans les feuillets épithéliaux nasaux. Les feuilles épithéliales doivent être imagées dans les 3 à 9 heures suivant le prélèvement de l’échantillon, car la fonction ciliaire est la plus stable pendant cette période³⁷. Moins de globules rouges et de débris sont les plus optimaux pour l’imagerie, car ils interfèrent avec l’acquisition de données. Lors de la sélection d’un retour sur investissemen.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	10 mg/mL
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Alanyl-glutamine	Sigma-Aldrich	G8541	200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOS	Oxford Instruments		Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Ceftazidime hydrate	Sigma-Aldrich	A6987	50 mg/mL
Cell Culture Microscope	Olympus	CKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC	Nikon Instruments Inc.	MRH08230	Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052-1MG	200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UM	Sigma-Aldrich	CLS431750	Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)	Corning	356231	Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container	Sigma-Aldrich	CLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts	Sigma-Aldrich	CLS3470	Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Cytology brushes	McFarlane Medical	33009
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM-High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Eclipse Ti2-E	Nikon		Live-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Thermo Fisher Scientific	10082147
Fungizone (Amphotericin B)	Thermo Fisher Scientific	15290018	250 µg/mL
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL
Graphpad Prism	Graphpad		Scientific analysis software
Greiner Cryo.s vials	Sigma-Aldrich	V3135	Cryogenic vials
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M
HI-FBS	Thermo Fisher Scientific	10082-147
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	3.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000	PeCon		Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643	2 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L	John Morris Group	74220 706	Bead bath
Lab Armor Beads	Thermo Fisher Scientific	A1254302	Thermal beads
MATLAB	MathWorks		Computing software
Microsoft Excel	Microscoft		Spreadsheet software
NIH/3T3	American Type Culture Collection	CRL-1658	Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements AR	Nikon Instruments Inc.		Image acquisition software
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
PneumaCult Airway Organoid Kit	StemCell Technologies	5060	Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI Medium	StemCell Technologies	5001
PneumaCult-Ex Plus Medium	StemCell Technologies	5040
PureCol-S	Advanced BioMatrix	5015	Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)	Sigma-Aldrich	E9644	25 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)	Selleckchem	S1049	10 mM
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014	100 mg/mL
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
UNO Stage Top Incubator	Okolab		Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning