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Ce protocole décrit la collecte, l’expansion et la différenciation des cellules épithéliales nasales en modèles organotypiques de cellules épithéliales des voies respiratoires et la quantification de la fréquence des battements de cils via l’imagerie de cellules vivantes et des scripts personnalisés.
Les mesures de la fonction des cils (fréquence des battements, modèle) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive. Cependant, l’application plus large de ces techniques est limitée par l’extrême susceptibilité de la fonction ciliaire aux changements de facteurs environnementaux, par exemple la température, l’humidité et le pH. Dans les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose (FK), l’accumulation de mucus empêche les cils battants. La fonction des cils a été étudiée dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité du canal CFTR (Transmembrane Conductance Regulator) de la FC. Cependant, une variabilité considérable d’un patient à l’autre dans la fréquence des battements de cils a été observée en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR, même pour les patients présentant les mêmes mutations CFTR . De plus, l’impact de la sécrétion de chlorure régulée par le CFTR sur la fonction ciliaire est mal compris. Il n’existe actuellement aucun protocole complet démontrant la préparation d’échantillons de modèles de voies respiratoires in vitro , l’acquisition d’images et l’analyse de la fréquence de battement des cils (CBF). Des conditions de culture normalisées et l’acquisition d’images effectuées dans des conditions environnementales contrôlées permettraient une quantification cohérente et reproductible du FBC entre les individus et en réponse aux médicaments modulateurs du CFTR. Ce protocole décrit la quantification du CBF dans trois systèmes différents de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires : 1) les feuilles épithéliales natives, 2) les modèles d’interface air-liquide imagés sur des inserts de support perméables et 3) les organoïdes tridimensionnels intégrés dans la matrice extracellulaire. Les deux derniers reproduisent la physiologie pulmonaire in vivo , avec des cils battants et la production de mucus. La fonction ciliaire est capturée à l’aide d’une caméra vidéo haute vitesse dans une chambre contrôlée par l’environnement. Des scripts personnalisés sont utilisés pour l’analyse des CBF. L’application des mesures de la FBC à la clinique est envisagée comme un outil clinique important pour prédire la réponse aux médicaments modulateurs du CFTR par patient.
Les mesures de la fréquence et du profil des battements des cils (CBF) ont été établies comme outils de diagnostic pour les maladies respiratoires telles que la dyskinésie ciliaire primitive (DCP)1. Dans la mucoviscidose (FK), le dysfonctionnement du canal chlorure du régulateur de conductance transmembranaire (CFTR) de la mucoviscidose provoque une déshydratation du liquide de surface des voies respiratoires et une altération de la clairance mucociliaire2. La fonction ciliaire a été étudiée in vitro dans des modèles de cellules des voies respiratoires primaires en tant qu’indicateur de l’activité des canaux CFT....
L’étude a été approuvée par le Sydney Children’s Hospital Network Ethics Review Board (HREC/16/SCHN/120). Le consentement écrit de tous les participants (ou de leur tuteur) a été obtenu avant le prélèvement des échantillons biologiques.
1. Préparations pour l’établissement de modèles de cellules épithéliales des voies respiratoires
Pour démontrer l’efficacité de ce protocole dans la quantification de la FBC, les résultats de la FBC mesurée dans des modèles d’ALI sur les cellules épithéliales des voies respiratoires dérivés de trois participants atteints de mucoviscidose et de trois participants témoins sains sont présentés. Au jour 14 de la différenciation de la culture, des cils battants étaient présents (Figure 6). Du jour 14 au jour 21 de la différenciation par culture, une augmentation statistiq.......
Il existe de multiples facteurs qui pourraient obscurcir la quantification du CBF dans les feuillets épithéliaux nasaux. Les feuilles épithéliales doivent être imagées dans les 3 à 9 heures suivant le prélèvement de l’échantillon, car la fonction ciliaire est la plus stable pendant cette période37. Moins de globules rouges et de débris sont les plus optimaux pour l’imagerie, car ils interfèrent avec l’acquisition de données. Lors de la sélection d’un retour sur investissemen.......
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont rien à divulguer.
Nous remercions les participants à l’étude et leurs familles pour leurs contributions. Nous apprécions l’aide du service respiratoire de Randwick des hôpitaux pour enfants de Sydney (SCH) dans l’organisation et la collecte des échantillons biologiques des patients - un merci spécial au Dr John Widger, à la Dre Yvonne Belessis, à Leanne Plush, à Amanda Thompson et à Rhonda Bell. Nous remercions Iveta Slapetova et Renee Whan de l’installation de microscopie optique Katharina Gaus du Centre d’analyse Mark Wainwright de l’UNSW Sydney. Ce travail est soutenu par le National Health and Medical Research Council (NHMRC) Australia (GNT1188987), la CF Foundation Australia et la....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
MATLAB | MathWorks | Computing software | |
Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
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