Primer İnsan Nazal Epitel Hücre Modellerinin Silia Beat Sıklığının Ölçülmesi İçin Toplanması, Genleştirilmesi ve Farklılaştırılması

Özet

Bu protokol, nazal epitel hücresi toplanmasını, genişlemesini ve organotipik hava yolu epitel hücre modellerine farklılaşmasını ve canlı hücre görüntüleme ve özel yapım senaryolar yoluyla kirpik vuruş sıklığının nicelleştirilmesini açıklar.

Özet

Kirpik fonksiyonunun ölçümleri (atım sıklığı, patern) primer siliyer diskinezi gibi solunum yolu hastalıkları için tanı araçları olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin daha geniş bir şekilde uygulanması, siliyer fonksiyonun sıcaklık, nem ve pH gibi çevresel faktörlerdeki değişikliklere aşırı duyarlılığı ile sınırlıdır. Kistik Fibrozisli (KF) hastaların hava yolunda, mukus birikimi kirpiklerin dövülmesini engeller. Primer hava yolu hücre modellerinde CF Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) kanal aktivitesinin bir göstergesi olarak silia fonksiyonu araştırılmıştır. Bununla birlikte, aynı CFTR mutasyonlarına sahip hastalar için bile, CFTR modüle edici ilaçlara yanıt olarak, kirpik atma sıklığında hastadan hastaya önemli değişkenlik bulunmuştur. Ayrıca, işlevsiz CFTR regüle klorür sekresyonunun siliyer fonksiyon üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Şu anda in vitro hava yolu modellerinin numune hazırlanmasını, görüntü alımını ve Cilia Beat Frekansı'nın (CBF) analizini gösteren kapsamlı bir protokol yoktur. Standartlaştırılmış kültür koşulları ve çevre kontrollü bir durumda gerçekleştirilen görüntü elde etme, bireyler arasında ve CFTR modüle edici ilaçlara yanıt olarak CBF'nin tutarlı, tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlayacaktır. Bu protokol, CBF'nin üç farklı hava yolu epitel hücre modeli sisteminde nicelleştirilmesini açıklar: 1) doğal epitel tabakaları, 2) geçirgen destek uçlarında görüntülenen hava-sıvı arayüz modelleri ve 3) hücre dışı matrise gömülü üç boyutlu organoidler. Son ikisi, kirpiklerin dövülmesi ve mukus üretimi ile in vivo akciğer fizyolojisini çoğaltır. Siliyer fonksiyonu, ortam kontrollü bir odada yüksek hızlı bir video kamera kullanılarak yakalanır. CBF'nin analizi için özel olarak oluşturulmuş komut dosyaları kullanılır. CBF ölçümlerinin kliniğe çevrilmesinin, hasta bazında CFTR modüle edici ilaçlara yanıtı tahmin etmek için önemli bir klinik araç olması öngörülmektedir.

Giriş

Silia Beat Sıklığı (CBF) ve paterninin ölçümleri, Primer Siliyer Diskinezi (PCD)¹ gibi solunum yolu hastalıkları için tanı araçları olarak belirlenmiştir. Kistik Fibrozis'te (KF), KF Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) klorür kanalının işlev bozukluğu, hava yolu yüzey sıvısının dehidrasyonuna ve mukosiliyer klirensin bozulmasına neden olur². Siliyer fonksiyon, CFTR kanal aktivitesinin bir göstergesi olarak primer hava yolu hücre modellerinde in vitro olarak araştırılmıştır³. Bununla birlikte, CBF'de, aynı CFTR mutasyonlarına sahip hastalar için bile, CFTR modüle edici ilaçlara yanıt olarak önemli ölçüde hastadan hastaya değişkenlik vardır³. Ayrıca, işlevsiz CFTR regüle klorür sekresyonunun siliyer fonksiyon üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Şu anda in vitro hava yolu modellerinin numune hazırlanmasını, görüntü alımını ve CBF'nin analizini gösteren kapsamlı bir protokol yoktur.

Nazal mukozal fırçalamalardan izole edilen nazal epitel tabakaları, PCD tanısı için siliyer fonksiyon ölçümlerinde doğrudan kullanılır⁴. Bununla birlikte, elde edilen nazal epitel tabakalarının boyutu veya kalitesi üzerinde bir kontrol bulunmamakla birlikte, CBF, tek hücreler veya hücre tabakaları üzerinde ve bozulmuş veya bozulmamış epitel tabakası siliye kenarlarında ölçülüp ölçülmediğine bağlı olarak değişir⁵. Bu nedenle, burun mukozal fırçalamalarının toplanması sırasında hücrelere verilen hasarın neden olduğu ikincil diskineziler CBF'yi etkileyebilir. Nazal epitel hücrelerinin primer hücre kültürü ve Hava-Sıvı Arayüzünde (ALI) veya üç boyutlu bazal membran matriksinde siliyer hava yolu epitel organoidlerine farklılaşması, sekonder diskinezilerden arındırılmış kirpiklere yol açar 4,6,7,8. ALI'da farklılaşan hava yolu epitel hücreleri (bundan böyle ALI modelleri olarak adlandırılacaktır), siliyer atım paternlerini ve ex vivo nazal mukozal fırçalamaların sıklığını kopyalayan önemli bir ikincil tanı yardımcısı olarak kabul edilmiştir⁶ ve hastaya özgü kusurları korurken siliyer ultrayapı, vuruş paterni ve vuruş sıklığının analizini mümkün kılmaktadır⁹ . Bununla birlikte, bu psödostratifiye, mukosiliyer farklılaşmış hücre modellerini oluşturmak için kullanılan metodolojilerde tutarsızlıklar mevcuttur. Farklı kültür genişlemesi veya farklılaşma protokolleri, farklı epitel fenotiplerini (siliye veya sekretuar)¹⁰ indükleyebilir ve CBF^11'de önemli farklılıklara neden olabilir. CBF, nazal epitel fırçalamalarında 4,6,12,13,14,15,16, hava yolu epitel organoidlerinde 14,17,18 ve ALI modellerinde 3,4,6,13,19,20^{, 21}. Yine de, bu protokoller arasında büyük değişkenlikler vardır ve çoğu zaman birçok parametre kontrol edilmez. Örneğin, bazı çalışmalarda, ALI modelinin hücreleri geçirgen destek eki ^{3,19,20,21'de} kalırken, CBF in situ olarak ^{görüntülenirken,} diğerleri hücreleri geçirgen destek ekinden kazır ve ^4,6,13 numaralı medyada asılı olarak görüntüler.

Ayrıca, siliyer fonksiyonu ölçen tekniklerin daha geniş bir şekilde uygulanması, siliyer fonksiyonun çevresel faktörlerdeki değişikliklere aşırı duyarlılığı ile sınırlıdır. Sıcaklık 22, nem 23,24 ve pH ^25,26 gibi çevresel faktörler siliyer fonksiyonu etkiler ve CBF'yi doğru bir şekilde ölçmek için düzenlenmelidir. Farklı laboratuvarlarda kullanılan çeşitli fizyolojik parametreler ve CBF'yi nasıl etkiledikleri daha önce gözden geçirilmiştir²⁷.

Literatürde çeşitli görüntüleme teknolojileri ve CBF ölçümlerine yaklaşımlar bildirilmiştir. PCD teşhisi için, siliyer fonksiyon ^28,29'u ölçmek için video mikroskopi kullanılır. Son zamanlarda, hava yolu epitel hücresi ALI modellerinde hem CBF hem de kirpik koordinasyonunu ölçmek için diferansiyel dinamik mikroskopiye dayalı bir video analiz algoritması kullanılmıştır ^3,30. Bu yöntem, hava yolu epitel hücrelerinde siliyer atımın, bölgeleri segmentlere ayırmaya veya seçmeye gerek kalmadan hızlı ve tam otomatik bir şekilde karakterizasyonunu sağlar. CBF'nin görüntülenmesi ve nicelleştirilmesi için çeşitli yöntemler literatürde CBF'de bildirilen farklılıklara katkıda bulunabilir (Ek Dosya 1).

Mevcut yöntemleri düzene sokmak için kültürden nicelemeye, kültür koşullarının standardizasyonuna ve sıkı çevre kontrollü koşullarda gerçekleştirilen görüntü elde etmeye yönelik bir protokol, CBF'nin bireyler içinde ve arasında tutarlı, tekrarlanabilir bir şekilde nicelleştirilmesini sağlayacaktır.

Bu protokol, epitel hücrelerinin toplanmasının, genleşme ve farklılaşma kültürü koşullarının ve CBF'nin nazal kökenli üç farklı hava yolu epitel hücre modeli sisteminde nicelleştirilmesinin tam bir tanımını sağlar: 1) doğal epitel tabakaları, 2) geçirgen destek ekleri üzerinde görüntülenen ALI modelleri ve 3) Hücre Dışı Matriks (ECM) gömülü üç boyutlu organoidler (Şekil 1 ). Nazal inferior konka fırçalamalarından elde edilen nazal epitel hücreleri, bronşiyal epitel hücreleri için etkili bir vekil oldukları için hava yolu epitelinin temsilcileri olarak kullanılırlar³¹ bronşiyal fırçalamaların toplanmasıyla ilişkili invaziv prosedürün üstesinden gelirler. Koşullu Yeniden Programlama Hücresi (CRC) yöntemi, ALI modellerinin ve üç boyutlu organoidlerin oluşturulması için birincil hava yolu epitel hücrelerini genişletmek için kullanılır. Hava yolu epitel hücrelerinin kök hücre benzeri bir duruma koşullu olarak yeniden programlanması, büyüme durdurucu fibroblast besleyici hücre sistemi ve Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü³² ile ortak kültür tarafından indüklenir. Önemli olarak, CRC yöntemi, hava yolu epitel hücrelerinde popülasyonun iki katına çıkmasını artırırken, dokuya özgü farklılaşma potansiyelini korur^33,34. Tüm hava yolu epitel hücresi modellerinde, siliyer fonksiyon, standartlaştırılmış görüntü yakalama ayarlarına sahip yüksek hızlı bir video kamera kullanılarak sıcaklık kontrollü bir odada yakalanır. CBF'nin nicelleştirilmesi için özel olarak oluşturulmuş komut dosyaları kullanılır.

Şekil 1: İş akışının şeması. Katılımcıların nazal inferior konkasını fırçaladıktan sonra, hava yolu epitel hücreleri iki yoldan biriyle kullanılır. Ya hava yolu epitel tabakaları izole edilir ve kirpik vuruş frekansı hemen görüntülenir ya da hava yolu epitel hücreleri koşullu yeniden programlama hücre yöntemi ile genişletilir. CRC-genleşmiş hava yolu epitel hücreleri, bir hava-sıvı arayüzünde veya hava yolu epitel organoid kültürlerinde hava yolu epitel hücreleri oluşturmak için farklılaşır. Siliyer atış frekansının görüntülenmesi, ısıtma ve nem çevre odasına ve hızlı kare hızına (>100Hz) sahip bir bilimsel kameraya sahip canlı hücre görüntüleme mikroskobu kullanılarak elde edilir. Veri analizi, özel olarak oluşturulmuş komut dosyaları kullanılarak gerçekleştirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Protokol

Çalışma onayı Sydney Çocuk Hastanesi Ağı Etik İnceleme Kurulu'ndan (HREC/16/SCHN/120) alınmıştır. Biyoörneklerin toplanmasından önce tüm katılımcılardan (veya katılımcıların vasisi) yazılı onay alınmıştır.

1. Hava yolu epitel hücre modellerinin oluşturulması için hazırlıklar

1. %80 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ve %20 Fetal Sığır Serumunu birleştirerek burun hücresi toplama ortamı hazırlayın. 1 μL / mL Penisilin / Streptomisin ile takviye edin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
2. Şişeleri veya geçirgen destek eklerini, 1.2.1-1.2.4 adımlarını izleyerek ihtiyaç başına Kollajen çözeltisi ile kaplayın. Kollajen kaplı kapları uzun süre saklamayın.
   1. Tip I Kollajen çözeltisinin (3 mg / mL stok) fosfat tamponlu salin (PBS) ile 0.03 mg / mL'lik bir son konsantrasyona 1:100 seyreltilmesini sağlayın. İyice karıştırın.
   2. Hücre kültürü şişelerini (bölüm 4) hazırlanan Kollajen çözeltisinin 160 μL/cm2 (yani T25 şişe başına 4 mL) ve geçirgen destek uçlarını (bölüm 5) 455 μL/^cm2 (yani 6,5 mm kesici uç başına 150 μL) ile kaplayın.
   3. 2-24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   4. Kollajen çözeltisini, hücreleri tohumlamadan önce pipet veya vakum aspiratörü ile çıkarın. Tohumlama hücrelerinden önce kabı yıkamayın.
3. Tablo 1'de listelenen³² numaralı bileşenleri birleştirerek Koşullu Yeniden Programlama Hücresi (CRC) ortamını hazırlayın. Şişe üstü vakum filtre sistemi kullanarak filtre sterilizasyonu. 4 °C'de 2 aya kadar saklayın.
4. Kullanım gününde, Tablo 1'de belirtildiği gibi insan epidermal büyüme faktörü, ROCK inhibitörü ve antibiyotikleri ekleyin.

Parça	Hacim
DMEM, yüksek glikoz	156,7 milyon H
DMEM/F-12, HEPES	313,3 milyon L
Hidrokortizon	55,6 μL
Insülin	1,25 mL
Kolera toksini	21 μL
Arjantin	1,2 mL
MERHABA-FBS	25 mL
Penisilin-Streptomisin	5 mL
İnsan epidermal büyüme faktörü	1 μL/mL
ROCK inhibitörü	1 μL/mL
Mantar bölgesi	2 μl/ml
Tobramisin	2 μL/mL
Seftazidim hidrat	4 μL/mL
Gentamisin çözeltisi	1 μL/mL

Tablo 1: 500 mL koşullu yeniden programlama hücre ortamı için bileşenler

2. Nazal inferior konka fırçalamalarının toplanması

NOT: Protokolün bu bölümü, burun hücresi toplama ortamı, sitoloji fırçaları, dokular ve uygun Kişisel Koruyucu Ekipman içeren bir toplama tüpü (50 mL) gerektirir. Üst solunum yolu enfeksiyonu sırasında fırçalamaktan kaçının. Enflamasyon varsa artmış olan küçük bir kanama riski vardır. Fırçalamanın amacı ex vivo CBF ölçümleri için hava yolu epitel tabakaları elde etmekse, fırçalama herhangi bir üst solunum yolu enfeksiyonundan en az 6 hafta sonra gerçekleşmelidir; İdeal olarak, enfeksiyondan 10 haftadan fazla bir süre sonra³⁵.

1. Burun hücresi toplama ortamını hazırlayın (bölüm 1) ve tüpü buz üzerinde tutun.
2. Prosedürü katılımcıya rahatsız edici olarak tanımlayın. Fırçalama sırasında burun deliğinde, okyanusa / havuza atlamaya ve burun pasajına akan suya benzer şekilde tam bir his hissedildiğini açıklayın. Katılımcılara, prosedürün bir refleks olarak gözyaşı üretimini indükleyeceğini söyleyin.
3. Katılımcı için hangi konumlandırmanın uygun olduğunu değerlendirin. Sırtüstü pozisyon, işlem sırasında katılımcının başının fırçadan uzaklaşmasını önlediğinden, bir muayene kanepesi mevcutsa katılımcıyı sırtüstü pozisyonda yatırın. Alternatif olarak, katılımcıyı başını geriye doğru bastırabilecekleri bir duvarın yanına oturtun.
4. Burun pasajını kontrol edin. Septal deviasyon, polipler ve fırçanın burun pasajındaki geçişini etkileyebilecek ve kanama riskini artırabilecek diğer anatomik anormalliklere dikkat edin.
5. Katılımcılardan burunlarını bir dokuya üflemelerini isteyerek aşırı mukus burnunu temizleyin.
6. Katılımcıdan ağzından nefes almasını isteyin. Baskın elinize bir sitoloji fırçası alın. Elini sabitlemek için beşinci basamağı katılımcının çenesine yaslarken, sitoloji fırçasını katılımcının burun pasajına yerleştirin (Şekil 2). Burun meatusundan geçmek için fırçayı ~ 45 ° C'de katılımcının yüzüne yerleştirin.
7. Fırçayı katılımcının yüzüne dik olacak şekilde dik olarak döndürün. Fırçayı, inferior konkanın ortasından arka kısmına gelene kadar burnun lateral duvarına nazikçe ama sıkıca ilerletin.
   NOT: Aşırı yerleştirmeyi önleyin; dirençte ani bir düşüş hissedilirse, burun farenksine girilmiştir ve prosedürcü tarafından direnç tekrar hissedilene kadar fırça geri çekilmelidir.
8. Fırçayı 360° üç defaya kadar döndürün. Fırçayı, yerleştirme manevrasının tersinden yavaşça çıkarın, böylece hücreler fırçadan çıkarılmaz.
9. Fırçayı hazırlanan toplama tüpüne nazal hücre toplama ortamı ile yerleştirin. Toplama tüpünü buzun üzerine yerleştirin.
10. Katılımcı kabul edilebilirse / çok sayıda hücre gerekiyorsa (örneğin, hücre kültürünü başlatmak için) ikinci burun deliğinde fırçalamayı tekrarlayın.
    NOT: Fırça üzerinde görünür kan hücresi yoksa aynı burun deliği tekrar fırçalanabilir, ancak aynı burun deliğinde ikinci bir fırçalama ile kanama riskinin biraz arttığını unutmayın.

Şekil 2: Nazal epitel hücrelerinin toplanması. Sitoloji fırçasının inferior konkanın orta-arka kısmındaki yerinin çizimi. Bu pozisyona, fırçanın tırnaklardan sokulması, fırçanın yüze 90°'lik bir açıyla döndürülmesi ve fırçanın alt konkanın altındaki burun pasajı boyunca yönlendirilmesiyle ulaşılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Hava yolu epitel tabakalarının hazırlanması

NOT: Protokolün bu bölümü toplama tüpü (sitoloji fırçası/fırçaları) + 1 mL burun hücresi toplama ortamı) (bölüm 2) ve 96 kuyucuklu düz tabanlı plaka gerektirir. Hava yolu epitel tabakalarını görüntülemek amacıyla burun konka fırçaları topluyorsanız, sadece 1 mL antibiyotiksiz burun hücresi toplama ortamı kullanın; aksi takdirde, epitel tabakaları görüntüleme için çok dağınık olacaktır.

1. Hava yolu epitel tabakalarını fırça(lar)dan çıkarmak için sitoloji fırçalarını içeren toplama tüpünü nazikçe döndürün.
2. Tüm ortamları ve hücreleri P1000 pipetle toplayın. 5-6 damlayı 96 kuyucuklu düz tabanlı bir plakanın kuyusuna dağıtın. Yaklaşık yedi kuyucuk için tekrarlayın.
3. Plakayı 7.1.4 adımına göre mikroskopa aktarın ve görüntü kirpikleri vuruş frekansına göre bölüm 7'nin geri kalanını takip edin.
4. Görüntü epitel tabakaları (Şekil 1) ve siliyer fonksiyonun epitel tabakaları ile tek bağlanmamış hücreler arasında farklılık gösterdiği gösterildiğinden beri tek bir bağlanmamış hücre^{değildir 5}.

4. Hava yolu epitel hücresi genişlemesi ve bakımı

1. Hava yolu epitelyal koşullu yeniden programlama hücre genişleme kültürü
   NOT: Kollajen çözeltisi kaplı damar (bölüm 1), Işınlanmış fare embriyonik besleyici hücreleri (NIH-3T3), Koşullu Yeniden Programlama Hücresi (CRC) ortamı (bölüm 1), burun hücresi toplama ortamındaki sitoloji fırçaları (bölüm 2).
   1. Hazırlanan Kollajen çözeltisi kaplı kültür kaplarına ışınlanmış çiplenmiş besleyici hücreler, hava yolu epitel hücreleri ile ortak kültürden en az 2 saat önce ve en fazla⁷² saat önce 8.000 hücre / cm2 tohumlama yoğunluğunda kaplanmıştır (besleyici hücre kültürü ve ışınlama için bkz.³⁶ ).
   2. Toplama tüpündeki fırçalanmış hücreleri (sitoloji fırçaları + burun hücresi toplama ortamı) buz üzerindeki girdaba aktarın. Düşük hızda, vorteks tüpü 10 s açık, 10 s kapalı (aralarında buz üzerinde tutun) hücreleri fırça (lar) dan çıkarmak için. Güçlü vorteks, hücre canlılığını azaltabilir. Mukusun hala yapışıp yapışmadığını kontrol etmek için fırçaları kontrol edin. Eğer öyleyse, girdabı tekrarlayın.
   3. Buz üzerindeki tüpleri biyogüvenlik kabinine geri aktarın. Medyayı toplama tüpünden yeni bir tüpe (Tüp B) aktarmak için sitoloji fırçalarını geride bırakarak serolojik bir pipet kullanın. 4 °C'de 7 dakika boyunca 300 × g'de Santrifüj Tüp B.
   4. B Tüpünü santrifüjden çıkarın, süpernatanı atın. Mukus görülebiliyorsa, peleti başka bir 5 mL burun hücresi toplama ortamı ile yıkayın ve tekrar santrifüj yapın.
   5. Tüp B'deki hücre peletini yeniden askıya almak için 1 mL CRC ortamı ekleyin 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, hücreleri dairesel bir hareketle 50 mL'lik bir tüpün (Tüp C) üzerine yerleştirilmiş bir hücre eleğinden geçirin.
   6. Tek bir hücre süspansiyonu oluşturmak için birden çok kez tekrarlayın. Eleğin altından kalan medyayı toplayın ve ortamla birleştirin. Hücre eleğini atın.
   7. 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, C Tüpünden 1 mL ortam alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   8. Bu hücre süspansiyonunun 10 μL'sini alın ve 10 μL tripan mavisi ile önceden alıntılanmış mikrosantrifüj tüpüne ekleyin. İyice karıştırın ve hücre sayısını ve canlılığını kaydetmek için hemen otomatik bir hücre sayacı kullanın.
   9. Hava yolu epitel hücrelerini, ışınlanmış besleyici hücrelerle önceden tohumlanmış T25 şişesine tohumlayın.
2. Hava yolu epitel hücre bakımı ve ayrışması
   NOT: CRC ortamı, hücrelere eklenmeden önce sıcaklık kontrollü bir laboratuvar su banyosuna veya boncuk banyosu cihazına yerleştirilerek 37 °C'ye ısıtılmalıdır.
   1. Hücre kültürü mikroskobu (4× objektif lens) altındaki hücreleri düzenli olarak bağlanma, kontaminasyon, morfoloji ve birleşme açısından kontrol edin.
   2. CRC medyasını her iki günde bir değiştirin. Yeniden programlanmış hücreler gözlendiğinde (Şekil 1) ve kontaminasyon olmadığında, antibiyotikleri azaltın veya geri çekin.
   3. Hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında, hücreleri ayırmak ve adım 4.1.8'de açıklandığı gibi bir hücre sayımı gerçekleştirmek için çift tripsin yöntemi^32'yi kullanın (hücre ayrışması ve donması için Ek Dosya 2'ye bakın).

5. Hava yolu epitel hücrelerinin tohumlanması ve farklılaştırılması ve farklılaştırılmış ALI modellerinin bakımı

1. Hava yolu epitel hücrelerinin geçirgen destek uçlarına tohumlanması
   1. Kollajen çözeltisi kaplı geçirgen destek eklerini (bölüm 1) CO₂ inkübatöründen biyogüvenlik kabinine aktarın. Kollajen çözeltisini aspire edin ve atın. Geçirgen destek uçlarının bazal bölmesine 750 μL genleşme ortamı (antibiyotiksiz) ekleyin.
   2. Ayrışmış hücreleri veya buz üzerindeki çözülmüş hücreleri biyogüvenlik kabinine aktarın. 200.000-250.000 hücreyi 150 μL'de tohumlamak için gereken genleşme ortamının hacmini, her geçirgen destek ekinin apikal bölmesine ekleyin.
   3. Kabarcık oluşturmamaya dikkat etmek; hücrelerin homojen ve süspansiyonda olmasını sağlamak için iyice karıştırın. Her geçirgen destek ekinin apikal tarafına hücre süspansiyonunun 150 μL'sini ekleyin.
   4. Homojen bir hücre süspansiyonunu korumak için her üç geçirgen destek ekini tohumladıktan sonra hücreleri yeniden askıya alın.
   5. Bir birleşik hücre monokatmanı oluşana kadar her iki günde bir (genellikle tohumlama sonrası 4. Gün), ortamı atın ve oda sıcaklığına (RT, 15-25 ° C) ısıtılmış taze genleşme ortamı ekleyin.
2. Hava-sıvı arayüzünde hava yolu epitel hücrelerinin farklılaşması
   1. Sıcak ALI ortamı (antibiyotiksiz) RT'ye (15-25 °C) kadar.
   2. Genleşme ortamını çıkarın ve hem apikal hem de bazal bölmelerde farklılaşma ortamına (ALI) geçin.
   3. Batık ALI ortamında 2 günlük kültürden sonra, medyayı aspire edin ve atın.
   4. Sadece hava-sıvı arayüzü oluşturmak için bazal bölmeye 750 μL ALI ortamı ekleyin.
      NOT: 1 haftalık kültürden sonra, tek katman akıcılık değilse ve delikler hala gözleniyorsa, hücreler artık boşluk bölgelerine genişleme kapasitesine sahip olmayabilir, hava yolu epitel hücrelerinin atılmasını düşünün.
3. Farklılaştırılmış ALI modelinin bakımı ve mukus giderimi
   1. Apikal ve bazal medyayı tam farklılaşmaya kadar her iki günde bir değiştirin (21-25. gün hava-sıvı arayüz kurulumundan sonra).
   2. Haftada bir kez, 5.3.3-5.3.4 adımlarını izleyerek mukusları apikal taraftan yıkayın.
   3. PBS'den RT'ye (15-25 °C) sıcak basın.
   4. Apikal bölmeye 200 μL PBS ekleyin. CO₂ inkübatöründe 10 dakika boyunca inkübe edin. PBS'yi çıkarmak için bir aspirasyon cihazı veya pipet kullanın.

6. Üç boyutlu hava yolu epitel organoidleri

1. Hava yolu epitel organoid kültürü için preparatlar
   1. Gece boyunca 37 ° C'ye ısınmak için bir CO 2 inkübatörüne₂₄ kuyucuklu plakalar yerleştirin.
   2. Üreticinin talimatlarına göre buz üzerinde 10 mL'lik bir ECM şişesini (Malzeme Tablosu) çözün. Donma-çözülme döngülerinin sayısını en aza indirmek için 500 μL alikot (tek seferlik kullanım) hazırlayın.
      NOT: En iyi kültür sonuçları için ECM'yi protein konsantrasyonu >10.5 mg/mL ile birlikte kullanmanız önerilir. Düşük konsantrasyon, ECM kubbesinin parçalanmasını hızlandıracak ve apikal-dışa bakan organoidlerin oluşumunu artıracaktır.
   3. Havayolu Organoid Tohumlama Ortamını (AOSM) ve Farklılaştırma Ortamını (AODM) üreticinin talimatlarına göre hazırlamak için Hava Yolu Organoid Kitini (Malzeme Tablosu) kullanın.
   4. Hava yolu organoid bazal ortamını Tablo 2'ye göre hazırlayın.

Parça	Hacim
Gelişmiş DMEM/F-12	500 mL
HEPES	5 mL
Alanil-glutamin	5 mL
Penisilin-Streptomisin	5 mL

Tablo 2: Hava yolu organoid bazal ortamının bileşenleri

5. Bölüm 4.2'de ayrışmış canlı hava yolu epitel hücrelerinin sayısını, 10.000 hücrelik bir tohumlama yoğunluğunda kaç kuyunun tohumlanabileceğini hesaplamak için kullanın (bkz. Tablo 3).
6. Kuyu başına 1 x 50 μL %90 ECM kubbe (45 μL ECM ve 5 μL AOSM) oluşturmak için gereken toplam ECM ve AOSM hacmini hesaplayın.
   NOT: Kuyucuk başına 10.000 hücrelik önerilen tohumlama yoğunluğu, geçiş 1'deki CRC genişlemiş burun epitel hücreleri içindir. Daha sonraki geçiş hücreleri, aynı sayıda organoidin oluşumunu sağlamak için daha yüksek tohumlama yoğunluğu gerektirebilir.

Kuyu sayısı	Hücre sayısı	Kubbe sayısı	Vol of Matrigel ECM	AOSM'nin Vol
1	10.000 hücre	1	45 μL x 1,1	5 μL x 1,1
2	20.000 hücre	2	90 μL x 1,1	10 μL x 1,1
5	50.000 hücre	5	225 μL x 1,1	25 μL x 1,1
.........	......... Hücre	.........	.........μL x 1.1	.........μL x 1.1

Tablo 3: ECM kubbelerinde hava yolu epitel hücrelerinin tohumlanması için hesaplamalar

2. ECM kubbelerinde hava yolu epitel hücrelerinin tohumlanması
   NOT: ECM'yi her zaman buz üzerinde tutun ve ECM buz üzerinde ECM ile ilgili tüm adımları gerçekleştirin, çünkü ECM >10 ° C sıcaklıklarda katılaşmaya başlayacaktır.
   1. Bölüm 4.2'de ayrışmış hava yolu epitel hücrelerini, Tablo 3'e göre hesaplanan %90 ECM hacmi ile yeniden askıya alın.
   2. Pipetin kuyunun dibine mümkün olduğunca yakın 90° açıyla (dikey) tutularak, ECM hücresi süspansiyonunun 50 μL'sini (kabarcıklar oluşmaması için ilk durağa) kuyunun ortasına dağıtın. Kuyunun duvarına dokunmaktan kaçının.
   3. ECM katılaşana kadar plakayı 37 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin. ECM katılaşırken, ekleme üzerine ECM kubbesinin yeniden sıvılaşmasına ve parçalanmasına neden olmasını önlemek için AOSM'yi RT'ye (15-25 ° C) ısıtın.
   4. Kuyunun duvarını dağıtarak her bir kuyuya 500 μL ısıtılmış AOSM ekleyin. Pipetleri doğrudan ECM kubbesinin üzerine koymayın.
   5. Medyayı 4-7 gün boyunca her 2 günde bir değiştirin. Ortamları aspire etmek için, plakayı 45° açıyla eğin ve kuyunun alt kenarından ECM kubbesinden uzağa aspire edin.
   6. 4-7 gün sonra, her bir kuyucuğa 500 μL AODM (15-25 ° C) ekleyerek organoid farklılaşmayı başlatın ve 7 gün boyunca her 2 günde bir ortam değiştirin.
3. Farklılaşmanın 7. Gününde hava yolu epitelyal organoidlerinin replatlanması
   NOT: Hava yolu epitel organoidlerinin kaplanması gereklidir, çünkü ECM kubbelerinin kenarı 2 haftalık kültür süresi boyunca yavaş yavaş parçalanır. Kubbenin kenarındaki hava yolu epitel organoidleri kaybolabilir (ortama yerinden çıkabilir) veya ECM'ye tam olarak gömülmediğinde apikal görünümlü dışa doğru oryantasyona sahip olabilir. Yeniden kaplama adımı aynı zamanda organoidleri başarılı bir şekilde oluşturmayan hücreleri / kalıntıları temizleyerek ECM kubbesini "temizler".
   1. Medyayı her kuyudan aspire edin. Her bir kuyucuğa 500 μL soğuk hava yolu organoid bazal ortamı (bundan böyle bazal medya olarak adlandırılacaktır) ekleyin.
   2. P1000 pipetini kullanın, çünkü bu pipet ucu en büyük deliğe sahiptir ve pipetleme sırasında organoidlerin patlama olasılığını azaltır. Kabarcıklar oluşmasını önlemek için pipeti 350 μL'ye ayarlayın, ardından her bir kuyucuktaki ECM kubbesini bozmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Tüm ECM/bazal ortamları 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
   3. Her bir oyuğa 500 μL soğuk bazal medya ile durulayın. Kalan ECM ve organoidleri içeren bazal ortamı, yukarıdaki gibi aynı 15 mL santrifüj tüpünde toplayın.
   4. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj. Santrifüjlemeyi takiben görülebilen üç katmandan - (1) süpernatant, (2) hücresel enkaz içeren ECM (kabarık) ve (3) organoidler içeren pelet - süpernatant ve ECM tabakasını atın ve organoid peleti koruyun.
   5. Kalan ECM'yi ayırmak için organoid pelet ve pipete 1 mL soğuk bazal ortam ekleyin. Tüpe 6 mL soğuk bazal ortam ekleyin ve yavaşça karıştırın.
   6. 4 °C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüj. Süper natantı atın.
   7. ECM fazlalığı hala görülebiliyorsa, başka bir yıkama işlemi gerçekleştirmek için 6.3.5- 6.3.6 arasındaki adımları tekrarlayın.
   8. Organoid peleti% 90 ECM'lik uygun bir hacimle (AOSM yerine AODM kullanın) kubbenin 50 μL'si başına ~ 30 organoid plakalamak için yeniden askıya alın.
   9. İlk kubbeyi kapladıktan sonra hücre kültürü mikroskobu (4x objektif lens) altındaki organoidlerin yoğunluğunu kontrol edin. Çok yoğunsa, istenen ~ 30 organoid yoğunluğunu elde etmek için% 90 ECM daha ekleyin.
   10. ECM'yi katılaştırmak ve hücreleri her iki günde bir 500 μL ısıtılmış AODM ile beslemek için 6.2.3- 6.2.4 adımlarını izleyin ve bazal hücreler, siliyer hücreler ve kadeh hücreleri içeren içe dönük psödostratifiye epitel ile çevrili lümen oluşumu ile olgunluğa ulaşana kadar (21 günlük farklılaşmadan sonra) 14 gün daha her bir kuyucuğa besleyin.
       NOT: Burada tarif edilen hava yolu epitel organoidleri terminal olarak farklılaşmıştır ve pasajlı veya kriyoprezerve edilemez.

7. Görüntüleme kirpikleri frekansını yendi

NOT: Protokolün bu bölümü, ısıtma ve nem çevre odasına sahip bir canlı hücre görüntüleme mikroskobu, hızlı kare hızı (>100 Hz) bilimsel kamera, 20x uzun çalışma mesafesi hedefi ve görüntüleme yazılımı gerektirir (bu protokolde kullanılan önerilen ekipman için Malzeme Tablosuna bakınız).

1. Mikroskop kurulumu
   1. Mikroskop ısıtma sisteminin açık olduğundan ve 37 ° C'ye dengelendiğinden emin olun. Mikroskobu açın. CO₂ /hava gazı karıştırıcısı ile gazı %5 CO_2'ye ayarlayın.
   2. CO_2'nin içinden geçtiği nem modülü şişesini arıtılmış suyla doldurun. Suyun ısıtılması ve hücrelere nemlendirilmiş hava sağlanması için sahne üst kontrolörü aracılığıyla bağıl nemi %85'e ayarlayın. Odayı 30 dakika boyunca dengeleyin.
   3. Mikroskop plakası ekini mikroskop tutucuya yerleştirin.
   4. Hava yolu epitel hücresi modellerini, numuneyi fizyolojik bir sıcaklıkta tutmak için inkübatörden mikroskopa, bir ısı bloğu veya 37 ° C'ye eşit termal boncuklar üzerinde aktarın.
   5. Hava yolu epitel hücresi modellerini içeren kültür plakasını mikroskop plakası ekine yerleştirin. Mikroskop çevre odasını kapatın.
   6. Numunenin önceden ısıtılmış 37 °C,% 5 CO₂ dolu mikroskop odasında 30 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
      NOT: Daha kısa bir denge süresi yeterli olabilir. Bu, CBF'nin stabilizasyonu için gereken süreyi tanımlamak için bir deney yapılarak belirlenebilir ( Şekil 3'e bakınız).

Şekil 3: Canlı hücre görüntüleme mikroskobunda siliyer atım frekansının stabilizasyonu. Çevresel odacıklı canlı hücre görüntüleme mikroskobuna aktarıldıktan sonra hava-sıvı arayüzündeki (ALI modelleri) hava yolu epitel hücrelerinde ortalama kirpik vuruş frekansının (CBF) nokta grafikleri. Oda, hazne kapısını açmadan ve kültür plakasını mikroskop plakası ekine yerleştirmeden önce 30 dakika boyunca 37 °C, %5 CO₂ ve %85 bağıl nemde dengelendi ve muhafaza edildi. Hücre modelleri belirtilen aralıklarla 60 dakika boyunca görüntülendi. ALI modelleri CF'li iki katılımcıdan türetilmiştir. ALI modeli başına altı görüş alanı (FOV) görüntüsü elde edilmiştir. Her nokta (mavi), 12-36 FOV görüntüsünde ortalama CBF'yi temsil eder. Veriler, ortalama ± SEM olarak temsil edilir ve ortalama noktalı bir çizgiyle bağlanır. İstatistiksel farklılıkları belirlemek için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı. P < 0.0001, ns: anlamsız. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

7. Denge döneminde, bilgisayarda, satın alma yazılımını açın. 20x uzun çalışma mesafesi objektif lensini seçin.
8. Mikroskop göz merceğinde, hücre modeline odaklanın (~Z = 8000 μm).
9. Mikroskopun Kohler aydınlatması için kurulduğundan emin olun, böylece iletim ışık kaynağı ampul filamentleri örnek düzleme odaklanmaz ve görüntülemedeki eserlerden kaçınır. Bunun için 7.1.10-7.1.13 adımlarını izleyin
10. Kondenserin üzerindeki alan iris diyaframını tamamen kapatın. Alan iris diyaframını yavaşça açın ve bir sekizgen şekli görünene kadar kondenseri yukarı/aşağı hareket ettirin.
11. Alan iris diyaframı hizalanmazsa (yani, sekizgen görüş alanının merkezinde değilse (FOV)), Allen tuşlarını kullanarak merkeze hizalayın.
12. Alan iris diyaframı hizalandıktan sonra, sekizgeni keskin netliğe getirmek için kondenser odağını ayarlayın.
13. FOV içinde artık görülemeyecek hale gelene kadar alan iris diyaframını açın.
14. Edinme yazılımını kullanarak, ışık yolunu kameranın monte edildiği bağlantı noktasına geçirmek için L100'e tıklayın. Mikroskop FOV'u yazılım aracılığıyla görselleştirmek için yeşil oynat (Çalıştır) düğmesine tıklayın. Kirpiklerin odakta olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse ayarlayın.
15. Edinme yazılımını kullanarak, mikroskopu aşağıdaki ayarlarla ayarlayın: Filtreler: boş; Kondenser: boş; Biçim: ciltleme yok; Pozlama süresi: 0.003 s; Okuma modu: panjur; ROI: 512 × 512 piksel.
    NOT: Maruz kalma süresi, ölçülmesi gereken en yüksek frekansa dayanır, çünkü 1/maruz kalma süresi bu frekansın en az iki katı olmalıdır. Örneğin, kirpiklerin maksimum fizyolojik aralığı = 30 Hz ise, 1/pozlama süresi = 60 ve pozlama süresi 0,016 s≤ olmalıdır. Kare hızlarını >100 Hz yakalayan bir yatırım getirisi seçin.

2. Görüntü alma
   1. Menüden hızlandırılmış görüntüler elde etmek için, Edin'e ve ardından Hızlı Zaman Atlaması'na tıklayın. Açılır pencerede, bir kaydetme konumu ve dosya adı seçin. 1000 kare edinin.
   2. Uygula'ya tıklayın. Kirpikleri mikroskop FOV'da önizlemek ve gerekirse Z odağını ayarlamak için yeşil oynat (Çalıştır) düğmesine tıklayın. Hızlı hızlandırılmış çekimi yakalamak için Şimdi Çalıştır'ı tıklatın.
   3. Hızlı hızlandırılmış çekim yakalandıktan sonra, mikroskop FOV'unu görselleştirmek için yeşil oynat (Çalıştır) düğmesine tıklayın. Mikroskop joystickini kullanarak, X / Y ekseni boyunca başka bir FOV'a geçin.
   4. Kirpikleri netlemek için Z odağını ayarlayın. Başka bir hızlı hızlandırılmış çekim yakalamak için Şimdi Çalıştır'a tıklayın.
   5. 7.2.3-7.2.4 arasındaki adımları yineleyin. ALI modelleri ve hava yolu organoidleri için, 3x numunelerin her birinde 6x FOV görüntüsü çoğaltır. Hava yolu epitel tabakaları için, görüntü katılımcı başına en az 4x kopya görüntüler.

8. CBF'nin veri analizi ve nicelleştirilmesi

1. Veri analizi için hazırlıklar
   NOT: Protokolün bu bölümü, özel analiz komut dosyaları (Ek Dosya 3), ham görüntü dosyaları (bölüm 7.2'de edinilmiştir), bir bilgi işlem yazılımı ve analiz yazılımı gerektirir.
   1. Bilgi işlem yazılımını, tercihen en son sürümü analiz bilgisayarına yükleyin. Standart bilgi işlem yazılımı araç kutularının (elmat, ops, datafun, uitools, veri türleri, iofun, iotools, audiovideo) ve Görüntü ve Sinyal İşleme araç kutularının yüklü olduğundan emin olun.
   2. Özel analiz komut dosyaları 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' ve 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' ve 'destek komut dosyaları' klasörünü bilgisayarın yerel sürücüsüne kopyalayın.
   3. Bilgisayar yazılımında, Giriş sekmesine tıklayın. Ardından Yolu Ayarla'ya tıklayın (Şekil 4A-B).
   4. Açılır pencerede, Alt Klasörlerle Ekle'ye tıklayın (Şekil 4C). 'MATLAB arama yolu' altında, Şekil 4B'de gösterilen klasörleri seçin, ardından Kaydet ve Kapat'ı tıklayın (Şekil 4E-F).
   5. Sol panelde görünüp görünmediklerini kontrol ederek analiz komut dosyalarının bilgi işlem yazılımına bağlı olduğunu onaylayın (Şekil 4G).
   6. Bölüm 7.2'de edinilen ham görüntü dosyalarını (açık mikroskopi ortamı (OME) biçimi) bilgisayarın yerel sürücüsüne aktarın.
      NOT: Örnek ham görüntü dosyalarına şu adresten erişilebilir: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649878.v1.

Şekil 4: Veri analizi için bilgi işlem yazılımı kurma. (A) Giriş sekmesini açın. (B) Yolu Ayarla'yı seçin. (C) Alt klasörlerle ekle'yi seçin. (D) Analiz komut dosyalarını içeren klasörleri seçin. (E) Kaydet'i seçin. (F) Kapat'ı seçin. (G) Analiz komut dosyaları sol panelde görünecektir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Tek piksellerin yoğunluk spektrumunun tepe noktası tespiti ile CBF'nin nicelleştirilmesi
   1. Bilgi işlem yazılımını açın. 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' analiz komut dosyasına tıklayın (Şekil 5A).
   2. Düzenleyici sekmesine tıklayın ve ardından komut dosyasını çalıştırmak için yeşil oynat (Çalıştır) düğmesine tıklayın (Şekil 5B-C). İstem penceresinde, analiz edilecek ham görüntü dosyalarını seçin (Şekil 5D).
   3. 7.1.15 adımındaki pozlama süresini, kare başına alma süresi için istem penceresine girin, ardından Tamam'a tıklayın (Şekil 5E).
   4. Komut dosyası CBF'yi hesaplarken ve ham görüntü dosyalarıyla aynı klasöre otomatik olarak kaydedilen 'AveSpectrum' dosyasında (Ek Dosya 4) çıktısını alırken dosya başına ~ 15 dakika bekleyin. İlerleme çubuğu aracılığıyla ilerlemeyi görselleştirin (Şekil 5F).

Şekil 5: Bilgi işlem yazılımı kullanarak analiz komut dosyalarını çalıştırma . (A) CBF'nin analizi ('BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m') veya kirpik döven filmin oluşturulması ('LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m') için komut dosyasını açın. (B) Düzenleyici sekmesini açın. (C) Analiz komut dosyasını çalıştırmak için yeşil oynat (Çalıştır) düğmesini seçin. (D) Bir istem penceresi, analiz veya film oluşturma için dosya seçimini gerektirecektir. (E) 'BeatingCiliaBatchOMEfiles_JOVE.m' komut dosyasını çalıştırırken, dosya okuma komut dosyasının meta verileri düzgün okumaması durumunda kare başına edinme süresini manuel olarak girmek için bir istem görünecektir. (F) Hesaplanan kirpik vuruş frekansını gösteren ilerleme çubuğu. (G) 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' komut dosyasını çalıştırırken, çıktısı alınacak filmin türünü (mp4 veya avi), film kare hızını (fps), hareketsiz bileşenin film verilerinden kaldırılıp kaldırılmadığını ('y' veya 'n'), kare sürelerini ve filme dışa aktarılan verilerin piksel boyutunu (mikron) manuel olarak girmek için bir istem görünecektir. Hareketsiz filtreleme için 'y' kullanılması önerilir, çünkü mukus veya verilerdeki diğer engelleyici hareketsiz katmanları kaldıracaktır. (H) Dışa aktarılan filmi gösteren ilerleme çubuğu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

5. 8.2.1-8.2.2 adımlarındaki işlemi kullanarak 'AveSpectrum' dosyalarını içeren klasörde 'GetFirstAmplitude.m' komut dosyasını çalıştırın. Komut dosyasının, en yüksek genliğe sahip olan ve hava yolu epitel kirpiklerinin fizyolojik aralığında, .xlsx 3 ve ≥30 Hz olan frekansı içeren 'FirstAmplitudeStacked<' dosyasının çıktısını almasını bekleyin.
6. 'FirstAmplitudeStacked.xlsx' dosyasından frekans değerlerini kopyalayın ve bilimsel bir analiz yazılımı kullanarak çizin.
   NOT: Özel analiz komut dosyasının CBF'yi nasıl ölçtüğüne ilişkin bir açıklama Ek Dosya 5'te verilmiştir. Örnek analiz edilen veri kümelerine şu adresten erişilebilir: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.16649815.

3. Kirpik dövülmesinin bir videosunu dışa aktarma
   1. Bilgi işlem yazılımını açın. Komut dosyasını yüklemek için 'LoadRawDataExportFilteredMovies_JOVE.m' komut dosyasına tıklayın (Şekil 5A).
   2. Düzenleyici sekmesine tıklayın ve ardından komut dosyasını çalıştırmak için yeşil oynat (Çalıştır) düğmesine tıklayın (Şekil 5C). İstem penceresinde, film dosyalarına dışa aktarılacak ham görüntü dosyalarını seçin (Şekil 5D).
   3. Tablo 4'te ayrıntılı olarak açıklanan ayarları 'Film Yap' açılır penceresine girin (Şekil 5G).
   4. Komut dosyası film dosyalarını oluştururken ve bunları ham görüntü dosyalarının konumuna çıkarırken dosya başına ~8 dakika bekleyin. İlerleme çubuğu aracılığıyla ilerlemeyi görselleştirin (Şekil 5H).

Film girişleri	Tarif
Dosya türü	Dışa aktarmak istediğiniz dosya türünü girin (mp4 veya avi).
Kare hızı	Filmin dışa aktarılması gereken kare hızını girin. Elde edilen zaman serisi başına ~1000 kareniz varsa, kare hızını ~30 fps olarak ayarlamanız önerilir.
Hareketsiz filtreleme	Seçenekler 'y' veya 'n'dir. Varsayılan değer 'y'dir ve zaman filtreleme komut dosyası, Fourier alanını kullanarak film verilerindeki hareketsiz bileşenleri kaldırır. Tipik olarak, kirpikler veya hareketsiz mukus altındaki herhangi bir hücre katmanı, filtrelenebilen sinyalde sıfır frekanslı bir ofset bileşenine veya zaman değişmez bileşenine katkıda bulunacaktır.
Kare başına edinme süresi	Alınan verilerin kare başına edinme süresi. Filmde saniye cinsinden bir zaman damgası görüntülemek için kullanılır.
Piksel boyutu	Mikrometre cinsinden piksel boyutu, filmdeki bir ölçek çubuğunu mikrometre cinsinden görüntülemek için kullanılır.

Tablo 4: Film oluşturma için giriş ayarları

Sonuçlar

Bu protokolün CBF'yi ölçmedeki etkinliğini göstermek için, KF'li üç katılımcıdan ve üç sağlıklı kontrol katılımcısından türetilen hava yolu epitel hücresi ALI modellerinde ölçülen CBF'nin sonuçları sunulmuştur. Kültür farklılaşmasının 14. gününde, dövülen kirpikler mevcuttu (Şekil 6). Kültür farklılaşmasının 14. gününden 21. gününe kadar, her iki kohortta da CBF'de istatistiksel olarak anlamlı (P < 0.0345) bir artış gözlenmiştir. Kültür...

Tartışmalar

Nazal epitel tabakalarında CBF'nin miktarını gizleyebilecek birçok faktör vardır. Epitel tabakaları numune toplandıktan sonraki 3-9 saat içinde görüntülenmelidir, çünkü siliyer fonksiyon bu süre zarfında en stabildir³⁷. Daha az kırmızı kan hücresi ve döküntü, görüntüleme için en uygun olanıdır, çünkü bunlar veri toplamaya müdahale eder. Görüntüleme için bir ROI seçerken, numunenin toplanması sırasında kenarın hasar görmediği veya bozulmadığı ve tek b...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	10 mg/mL
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634-010
Alanyl-glutamine	Sigma-Aldrich	G8541	200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOS	Oxford Instruments		Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Ceftazidime hydrate	Sigma-Aldrich	A6987	50 mg/mL
Cell Culture Microscope	Olympus	CKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC	Nikon Instruments Inc.	MRH08230	Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052-1MG	200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UM	Sigma-Aldrich	CLS431750	Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)	Corning	356231	Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter system	Sigma-Aldrich	CLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container	Sigma-Aldrich	CLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts	Sigma-Aldrich	CLS3470	Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Automated cell counter
Cytology brushes	McFarlane Medical	33009
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM/F12-Ham	Thermo Fisher Scientific	11330032
DMEM-High Glucose	Thermo Fisher Scientific	11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
Eclipse Ti2-E	Nikon		Live-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States	Thermo Fisher Scientific	10082147
Fungizone (Amphotericin B)	Thermo Fisher Scientific	15290018	250 µg/mL
Gentamicin solution	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL
Graphpad Prism	Graphpad		Scientific analysis software
Greiner Cryo.s vials	Sigma-Aldrich	V3135	Cryogenic vials
HEPES solution	Sigma-Aldrich	H0887	1 M
HI-FBS	Thermo Fisher Scientific	10082-147
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	3.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000	PeCon		Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
Insulin	Sigma-Aldrich	I2643	2 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L	John Morris Group	74220 706	Bead bath
Lab Armor Beads	Thermo Fisher Scientific	A1254302	Thermal beads
MATLAB	MathWorks		Computing software
Microsoft Excel	Microscoft		Spreadsheet software
NIH/3T3	American Type Culture Collection	CRL-1658	Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements AR	Nikon Instruments Inc.		Image acquisition software
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537
PneumaCult Airway Organoid Kit	StemCell Technologies	5060	Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI Medium	StemCell Technologies	5001
PneumaCult-Ex Plus Medium	StemCell Technologies	5040
PureCol-S	Advanced BioMatrix	5015	Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture Reagents	Lonza	CC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)	Sigma-Aldrich	E9644	25 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)	Selleckchem	S1049	10 mM
Tobramycin	Sigma-Aldrich	T4014	100 mg/mL
Trypan blue solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
UNO Stage Top Incubator	Okolab		Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning