Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Bu protokol, nazal epitel hücresi toplanmasını, genişlemesini ve organotipik hava yolu epitel hücre modellerine farklılaşmasını ve canlı hücre görüntüleme ve özel yapım senaryolar yoluyla kirpik vuruş sıklığının nicelleştirilmesini açıklar.
Kirpik fonksiyonunun ölçümleri (atım sıklığı, patern) primer siliyer diskinezi gibi solunum yolu hastalıkları için tanı araçları olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin daha geniş bir şekilde uygulanması, siliyer fonksiyonun sıcaklık, nem ve pH gibi çevresel faktörlerdeki değişikliklere aşırı duyarlılığı ile sınırlıdır. Kistik Fibrozisli (KF) hastaların hava yolunda, mukus birikimi kirpiklerin dövülmesini engeller. Primer hava yolu hücre modellerinde CF Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) kanal aktivitesinin bir göstergesi olarak silia fonksiyonu araştırılmıştır. Bununla birlikte, aynı CFTR mutasyonlarına sahip hastalar için bile, CFTR modüle edici ilaçlara yanıt olarak, kirpik atma sıklığında hastadan hastaya önemli değişkenlik bulunmuştur. Ayrıca, işlevsiz CFTR regüle klorür sekresyonunun siliyer fonksiyon üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Şu anda in vitro hava yolu modellerinin numune hazırlanmasını, görüntü alımını ve Cilia Beat Frekansı'nın (CBF) analizini gösteren kapsamlı bir protokol yoktur. Standartlaştırılmış kültür koşulları ve çevre kontrollü bir durumda gerçekleştirilen görüntü elde etme, bireyler arasında ve CFTR modüle edici ilaçlara yanıt olarak CBF'nin tutarlı, tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlayacaktır. Bu protokol, CBF'nin üç farklı hava yolu epitel hücre modeli sisteminde nicelleştirilmesini açıklar: 1) doğal epitel tabakaları, 2) geçirgen destek uçlarında görüntülenen hava-sıvı arayüz modelleri ve 3) hücre dışı matrise gömülü üç boyutlu organoidler. Son ikisi, kirpiklerin dövülmesi ve mukus üretimi ile in vivo akciğer fizyolojisini çoğaltır. Siliyer fonksiyonu, ortam kontrollü bir odada yüksek hızlı bir video kamera kullanılarak yakalanır. CBF'nin analizi için özel olarak oluşturulmuş komut dosyaları kullanılır. CBF ölçümlerinin kliniğe çevrilmesinin, hasta bazında CFTR modüle edici ilaçlara yanıtı tahmin etmek için önemli bir klinik araç olması öngörülmektedir.
Silia Beat Sıklığı (CBF) ve paterninin ölçümleri, Primer Siliyer Diskinezi (PCD)1 gibi solunum yolu hastalıkları için tanı araçları olarak belirlenmiştir. Kistik Fibrozis'te (KF), KF Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) klorür kanalının işlev bozukluğu, hava yolu yüzey sıvısının dehidrasyonuna ve mukosiliyer klirensin bozulmasına neden olur2. Siliyer fonksiyon, CFTR kanal aktivitesinin bir göstergesi olarak primer hava yolu hücre modellerinde in vitro olarak araştırılmıştır3. Bununla birlikte, CBF'de, aynı CFTR mutasyonlarına sahip hastalar için bile, CFTR modüle edici ilaçl....
Çalışma onayı Sydney Çocuk Hastanesi Ağı Etik İnceleme Kurulu'ndan (HREC/16/SCHN/120) alınmıştır. Biyoörneklerin toplanmasından önce tüm katılımcılardan (veya katılımcıların vasisi) yazılı onay alınmıştır.
1. Hava yolu epitel hücre modellerinin oluşturulması için hazırlıklar
Bu protokolün CBF'yi ölçmedeki etkinliğini göstermek için, KF'li üç katılımcıdan ve üç sağlıklı kontrol katılımcısından türetilen hava yolu epitel hücresi ALI modellerinde ölçülen CBF'nin sonuçları sunulmuştur. Kültür farklılaşmasının 14. gününde, dövülen kirpikler mevcuttu (Şekil 6). Kültür farklılaşmasının 14. gününden 21. gününe kadar, her iki kohortta da CBF'de istatistiksel olarak anlamlı (P < 0.0345) bir artış gözlenmiştir. Kültür.......
Nazal epitel tabakalarında CBF'nin miktarını gizleyebilecek birçok faktör vardır. Epitel tabakaları numune toplandıktan sonraki 3-9 saat içinde görüntülenmelidir, çünkü siliyer fonksiyon bu süre zarfında en stabildir37. Daha az kırmızı kan hücresi ve döküntü, görüntüleme için en uygun olanıdır, çünkü bunlar veri toplamaya müdahale eder. Görüntüleme için bir ROI seçerken, numunenin toplanması sırasında kenarın hasar görmediği veya bozulmadığı ve tek b.......
Yazarlar açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.
Araştırmaya katılanlara ve ailelerine katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Sydney Çocuk Hastaneleri (SCH) Randwick solunum departmanının hasta biyoörneklerinin organizasyonu ve toplanmasındaki yardımını takdir ediyoruz - Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson ve Rhonda Bell'e özel teşekkürler. UNSW Sidney'deki Mark Wainwright Analitik Merkezi'ndeki Katharina Gaus Işık Mikroskobu Tesisi'nden Iveta Slapetova ve Renee Whan'ın yardımlarını kabul ediyoruz. Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Avustralya (GNT1188987), CF Vakfı Avustralya ve Sidney Çocuk Hastanesi Vakfı tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, Luminesce All....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | 10 mg/mL |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634-010 | |
Alanyl-glutamine | Sigma-Aldrich | G8541 | 200 mM |
Andor Zyla 4.2 sCMOS | Oxford Instruments | Fast frame rate (>100 Hz) scientific camera | |
Bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
Ceftazidime hydrate | Sigma-Aldrich | A6987 | 50 mg/mL |
Cell Culture Microscope | Olympus | CKX53 | |
CFI S Plan Fluor ELWD 20XC | Nikon Instruments Inc. | MRH08230 | Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9 |
Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052-1MG | 200 µg/mL |
Corning Gel Strainer 40 UM | Sigma-Aldrich | CLS431750 | Pore size 40 μm |
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free) | Corning | 356231 | Extracellular matrix (ECM) |
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS431098 | |
Corning CoolCell LX Cell Freezing Container | Sigma-Aldrich | CLS432002 | |
Corning Transwell polyester membrane cell culture inserts | Sigma-Aldrich | CLS3470 | Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert. |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
Cytology brushes | McFarlane Medical | 33009 | |
DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
DMEM/F12-Ham | Thermo Fisher Scientific | 11330032 | |
DMEM-High Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11965-092 | |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
Eclipse Ti2-E | Nikon | Live-cell imaging microscope. | |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
Fungizone (Amphotericin B) | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | 250 µg/mL |
Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL |
Graphpad Prism | Graphpad | Scientific analysis software | |
Greiner Cryo.s vials | Sigma-Aldrich | V3135 | Cryogenic vials |
HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M |
HI-FBS | Thermo Fisher Scientific | 10082-147 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 3.6 mg/mL |
Incubator NL Ti2 BLACK 2000 | PeCon | Microscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | 2 mg/mL |
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6L | John Morris Group | 74220 706 | Bead bath |
Lab Armor Beads | Thermo Fisher Scientific | A1254302 | Thermal beads |
MATLAB | MathWorks | Computing software | |
Microsoft Excel | Microscoft | Spreadsheet software | |
NIH/3T3 | American Type Culture Collection | CRL-1658 | Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells |
NIS-Elements AR | Nikon Instruments Inc. | Image acquisition software | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL |
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
PneumaCult Airway Organoid Kit | StemCell Technologies | 5060 | Airway Organoid Kit |
PneumaCult-ALI Medium | StemCell Technologies | 5001 | |
PneumaCult-Ex Plus Medium | StemCell Technologies | 5040 | |
PureCol-S | Advanced BioMatrix | 5015 | Type I Collagen solution |
ReagentPack Subculture Reagents | Lonza | CC-5034 | |
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human) | Sigma-Aldrich | E9644 | 25 µg/mL |
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor) | Selleckchem | S1049 | 10 mM |
Tobramycin | Sigma-Aldrich | T4014 | 100 mg/mL |
Trypan blue solution | Sigma-Aldrich | T8154 | 0.4% |
UNO Stage Top Incubator | Okolab | Microscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır