Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, nazal epitel hücresi toplanmasını, genişlemesini ve organotipik hava yolu epitel hücre modellerine farklılaşmasını ve canlı hücre görüntüleme ve özel yapım senaryolar yoluyla kirpik vuruş sıklığının nicelleştirilmesini açıklar.

Özet

Kirpik fonksiyonunun ölçümleri (atım sıklığı, patern) primer siliyer diskinezi gibi solunum yolu hastalıkları için tanı araçları olarak belirlenmiştir. Bununla birlikte, bu tekniklerin daha geniş bir şekilde uygulanması, siliyer fonksiyonun sıcaklık, nem ve pH gibi çevresel faktörlerdeki değişikliklere aşırı duyarlılığı ile sınırlıdır. Kistik Fibrozisli (KF) hastaların hava yolunda, mukus birikimi kirpiklerin dövülmesini engeller. Primer hava yolu hücre modellerinde CF Transmembran iletkenlik Regülatörü (CFTR) kanal aktivitesinin bir göstergesi olarak silia fonksiyonu araştırılmıştır. Bununla birlikte, aynı CFTR mutasyonlarına sahip hastalar için bile, CFTR modüle edici ilaçlara yanıt olarak, kirpik atma sıklığında hastadan hastaya önemli değişkenlik bulunmuştur. Ayrıca, işlevsiz CFTR regüle klorür sekresyonunun siliyer fonksiyon üzerindeki etkisi tam olarak anlaşılamamıştır. Şu anda in vitro hava yolu modellerinin numune hazırlanmasını, görüntü alımını ve Cilia Beat Frekansı'nın (CBF) analizini gösteren kapsamlı bir protokol yoktur. Standartlaştırılmış kültür koşulları ve çevre kontrollü bir durumda gerçekleştirilen görüntü elde etme, bireyler arasında ve CFTR modüle edici ilaçlara yanıt olarak CBF'nin tutarlı, tekrarlanabilir bir şekilde ölçülmesini sağlayacaktır. Bu protokol, CBF'nin üç farklı hava yolu epitel hücre modeli sisteminde nicelleştirilmesini açıklar: 1) doğal epitel tabakaları, 2) geçirgen destek uçlarında görüntülenen hava-sıvı arayüz modelleri ve 3) hücre dışı matrise gömülü üç boyutlu organoidler. Son ikisi, kirpiklerin dövülmesi ve mukus üretimi ile in vivo akciğer fizyolojisini çoğaltır. Siliyer fonksiyonu, ortam kontrollü bir odada yüksek hızlı bir video kamera kullanılarak yakalanır. CBF'nin analizi için özel olarak oluşturulmuş komut dosyaları kullanılır. CBF ölçümlerinin kliniğe çevrilmesinin, hasta bazında CFTR modüle edici ilaçlara yanıtı tahmin etmek için önemli bir klinik araç olması öngörülmektedir.

Giriş

Silia Beat Sıklığı (CBF) ve paterninin ölçümleri, Primer Siliyer Diskinezi (PCD)1 gibi solunum yolu hastalıkları için tanı araçları olarak belirlenmiştir. Kistik Fibrozis'te (KF), KF Transmembran İletkenlik Regülatörü (CFTR) klorür kanalının işlev bozukluğu, hava yolu yüzey sıvısının dehidrasyonuna ve mukosiliyer klirensin bozulmasına neden olur2. Siliyer fonksiyon, CFTR kanal aktivitesinin bir göstergesi olarak primer hava yolu hücre modellerinde in vitro olarak araştırılmıştır3. Bununla birlikte, CBF'de, aynı CFTR mutasyonlarına sahip hastalar için bile, CFTR modüle edici ilaçl....

Protokol

Çalışma onayı Sydney Çocuk Hastanesi Ağı Etik İnceleme Kurulu'ndan (HREC/16/SCHN/120) alınmıştır. Biyoörneklerin toplanmasından önce tüm katılımcılardan (veya katılımcıların vasisi) yazılı onay alınmıştır.

1. Hava yolu epitel hücre modellerinin oluşturulması için hazırlıklar

  1. %80 Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ve %20 Fetal Sığır Serumunu birleştirerek burun hücresi toplama ortamı hazırlayın. 1 μL / mL Penisilin / Streptomisin ile takviye edin. 4 °C'de 3 aya kadar saklayın.
  2. Şişeleri veya geçirgen destek eklerini, 1.2.1-1.2.4 adımlarını izleyerek ihtiyaç başına Kollajen çözeltisi ile kaplayın. Kollajen....

Sonuçlar

Bu protokolün CBF'yi ölçmedeki etkinliğini göstermek için, KF'li üç katılımcıdan ve üç sağlıklı kontrol katılımcısından türetilen hava yolu epitel hücresi ALI modellerinde ölçülen CBF'nin sonuçları sunulmuştur. Kültür farklılaşmasının 14. gününde, dövülen kirpikler mevcuttu (Şekil 6). Kültür farklılaşmasının 14. gününden 21. gününe kadar, her iki kohortta da CBF'de istatistiksel olarak anlamlı (P < 0.0345) bir artış gözlenmiştir. Kültür.......

Tartışmalar

Nazal epitel tabakalarında CBF'nin miktarını gizleyebilecek birçok faktör vardır. Epitel tabakaları numune toplandıktan sonraki 3-9 saat içinde görüntülenmelidir, çünkü siliyer fonksiyon bu süre zarfında en stabildir37. Daha az kırmızı kan hücresi ve döküntü, görüntüleme için en uygun olanıdır, çünkü bunlar veri toplamaya müdahale eder. Görüntüleme için bir ROI seçerken, numunenin toplanması sırasında kenarın hasar görmediği veya bozulmadığı ve tek b.......

Açıklamalar

Yazarlar açıklayacak hiçbir şeyleri olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Araştırmaya katılanlara ve ailelerine katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Sydney Çocuk Hastaneleri (SCH) Randwick solunum departmanının hasta biyoörneklerinin organizasyonu ve toplanmasındaki yardımını takdir ediyoruz - Dr. John Widger, Dr. Yvonne Belessis, Leanne Plush, Amanda Thompson ve Rhonda Bell'e özel teşekkürler. UNSW Sidney'deki Mark Wainwright Analitik Merkezi'ndeki Katharina Gaus Işık Mikroskobu Tesisi'nden Iveta Slapetova ve Renee Whan'ın yardımlarını kabul ediyoruz. Bu çalışma Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) Avustralya (GNT1188987), CF Vakfı Avustralya ve Sidney Çocuk Hastanesi Vakfı tarafından desteklenmektedir. Yazarlar, Luminesce All....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
AdenineSigma-AldrichA278610 mg/mL
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634-010
Alanyl-glutamineSigma-AldrichG8541200 mM
Andor Zyla 4.2 sCMOSOxford InstrumentsFast frame rate (>100 Hz) scientific camera
Bottle-top vacuum filter systemSigma-AldrichCLS431098
Ceftazidime hydrateSigma-AldrichA698750 mg/mL
Cell Culture MicroscopeOlympusCKX53
CFI S Plan Fluor ELWD 20XCNikon Instruments Inc.MRH08230Long working distance objective lens. NA0.45 WD 8.2-6.9
Cholera toxinSigma-AldrichC8052-1MG200 µg/mL
Corning Gel Strainer 40 UMSigma-AldrichCLS431750Pore size 40 μm
Corning Matrigel Matrix (Phenol red-free)Corning356231Extracellular matrix (ECM)
Corning bottle-top vacuum filter systemSigma-AldrichCLS431098
Corning CoolCell LX Cell Freezing ContainerSigma-AldrichCLS432002
Corning Transwell polyester membrane cell culture insertsSigma-AldrichCLS3470Permeable support inserts. 6.5 mm Transwell with 0.4 μm pore polyester membrane insert.
Countess Cell Counting Chamber SlidesThermo Fisher ScientificC10228
Countess II Automated Cell CounterThermoFisher ScientificAMQAX1000Automated cell counter
Cytology brushesMcFarlane Medical33009
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM/F12-HamThermo Fisher Scientific11330032
DMEM-High GlucoseThermo Fisher Scientific11965-092
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
Eclipse Ti2-ENikonLive-cell imaging microscope.
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United StatesThermo Fisher Scientific10082147
Fungizone (Amphotericin B)Thermo Fisher Scientific15290018250 µg/mL
Gentamicin solutionSigma-AldrichG139750 mg/mL
Graphpad PrismGraphpadScientific analysis software
Greiner Cryo.s vialsSigma-AldrichV3135Cryogenic vials
HEPES solutionSigma-AldrichH08871 M
HI-FBSThermo Fisher Scientific10082-147
HydrocortisoneSigma-AldrichH08883.6 mg/mL
Incubator NL Ti2 BLACK 2000PeConMicroscope environmental chamber. Allows warm air incubation and local CO2 and O2 gassing
InsulinSigma-AldrichI26432 mg/mL
Lab Armor 74220 706 Waterless Bead Bath 6LJohn Morris Group74220 706Bead bath
Lab Armor BeadsThermo Fisher ScientificA1254302Thermal beads
MATLABMathWorksComputing software
Microsoft ExcelMicroscoftSpreadsheet software
NIH/3T3American Type Culture CollectionCRL-1658Irradiated NIH-3T3 mouse embryonic feeder cells
NIS-Elements ARNikon Instruments Inc.Image acquisition software
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP433310,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS)Sigma-AldrichD8537
PneumaCult Airway Organoid KitStemCell Technologies5060Airway Organoid Kit
PneumaCult-ALI MediumStemCell Technologies5001
PneumaCult-Ex Plus MediumStemCell Technologies5040
PureCol-SAdvanced BioMatrix5015Type I Collagen solution
ReagentPack Subculture ReagentsLonzaCC-5034
rhEGF (Epidermal Growth Factor, human)Sigma-AldrichE964425 µg/mL
Y-27632 2HCl (ROCK inhibitor)SelleckchemS104910 mM
TobramycinSigma-AldrichT4014100 mg/mL
Trypan blue solutionSigma-AldrichT81540.4%
UNO Stage Top IncubatorOkolabMicroscope incubator. Allows temperature, humidity and CO2 conditioning

Referanslar

  1. Barbato, A., et al. Primary ciliary dyskinesia: a consensus statement on diagnostic and treatment approaches in children. European Respiratory Journal. 34 (6), 1264-1276 (2009).
  2. Cutting, G. R.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır