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En este artículo

  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El control optogenético del metabolismo microbiano ofrece un control dinámico flexible sobre los procesos de fermentación. El protocolo aquí muestra cómo configurar fermentaciones reguladas por luz azul para la producción química y de proteínas a diferentes escalas volumétricas.

Resumen

Las fábricas de células microbianas ofrecen una alternativa sostenible para producir productos químicos y proteínas recombinantes a partir de materias primas renovables. Sin embargo, sobrecargar un microorganismo con modificaciones genéticas puede reducir la aptitud y la productividad del huésped. Este problema se puede superar mediante el uso de control dinámico: expresión inducible de enzimas y vías, típicamente utilizando aditivos químicos o a base de nutrientes, para equilibrar el crecimiento y la producción celular. Optogenetics ofrece un método no invasivo, altamente ajustable y reversible para regular dinámicamente la expresión génica. Aquí, describimos cómo configurar fermentaciones controladas por la luz de Escherichia coli y Saccharomyces cerevisiae modificadas para la producción de productos químicos o proteínas recombinantes. Discutimos cómo aplicar luz en momentos y dosis seleccionados para desacoplar el crecimiento microbiano y la producción para mejorar el control de la fermentación y la productividad, así como las consideraciones clave de optimización para obtener los mejores resultados. Además, describimos cómo implementar controles de luz para experimentos de biorreactores a escala de laboratorio. Estos protocolos facilitan la adopción de controles optogenéticos en microorganismos diseñados para mejorar el rendimiento de la fermentación.

Introducción

La optogenética, el control de procesos biológicos con proteínas sensibles a la luz, ofrece una nueva estrategia para controlar dinámicamente las fermentaciones microbianas para la producción química y proteica1,2. La carga de las vías metabólicas modificadas y la toxicidad de algunos productos intermedios y productos a menudo perjudican el crecimiento celular3. Tales tensiones pueden conducir a una acumulación deficiente de biomasa y a una reducción de la productividad3. Este desafío puede abordarse dividiendo temporalmente las fermentaciones en una fase de crec....

Protocolo

1. Producción química controlada por la luz utilizando el circuito S. cerevisiae OptoINVRT7

  1. Construcción de tensión
    1. Obtener una distensión con his3 auxotrofia, ya que este marcador es necesario para la mayoría de los plásmidos OptoINVRT existentes5. Si busca la regulación optogenética de un gen que es nativo de S. cerevisiae, construya una cepa en la que se elimine cualquier copia endógena del gen.
    2. Linealizar el plásmido que contiene el circuito OptoINVRT7, como EZ-L4395, e integrarlo en el his3-locus de la cepa auxotrófica utilizando métodos estándar de transfor....

Resultados

La regulación optogenética del metabolismo microbiano se ha implementado con éxito para producir una variedad de productos, incluidos biocombustibles, productos químicos a granel, proteínas y productos naturales5,6,7,12,13. La mayoría de estos procesos están diseñados para que el crecimiento celular ocurra en la luz (cuando la baja densidad celular pla.......

Discusión

El control dinámico se ha aplicado durante mucho tiempo para mejorar los rendimientos de la ingeniería metabólica y la producción de proteínas recombinantes4. Los cambios en la expresión enzimática se implementan más típicamente utilizando inductores químicos como IPTG21, galactosa22 y tetraciclina23, pero también se han mediado utilizando condiciones de proceso como la temperatura y el pH. El control optogenético .......

Divulgaciones

Los autores han solicitado varias patentes para los circuitos y métodos optogenéticos descritos en este artículo.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Energía de los Estados Unidos, la Oficina de Ciencias, el Premio de la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental Número DE-SC0019363, el Premio NSF CAREER CBET-1751840, The Pew Charitable Trusts y el Premio Camille Dreyfus Teacher-Scholar.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plateUSA ScientificCC7672-7524
Agar powderThermo Fisher Scientific303991049
Aluminum foilReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvetteEppendorf6135000923
Blue LED panelHQRP884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 PlasmidN/AN/ASee Reference 1
GlucoseThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
Microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5510
Orbital ShakerYamato Scientific AmericaSOU-300
Petri dishCelltreat229656
PmeINew England BiolabsR0560L
Quantum meterApogee InstrumentsMQ-510
Replica-plating deviceThomas ScientificF37848-0000
Replica-plating padsSunrise Science Products3005-012
SC-His powderSunrise Science Products1303-030
SC Complete powderSunrise Science Products1459-100
Sterile sealing filmExcel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD agar platesVWR100217-054
ZeocinThermo Fisher ScientificR25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample BufferCepham Life Sciences10502
12% Acrylamide protein gelsThermo Fisher ScientificNP0341BOX
24-well culture plateUSA ScientificCC7672-7524
Aluminum foilReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvetteEppendorf6135000923
Blue LED panelHQRP884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250Thermo Fisher Scientific20279
Electrophoresis cellBio-Rad1658004
Electrophoresis power supplyBio-Rad1645050
LB broth (Miller)Fisher ScientificBP97235
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
Microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC plasmidsN/AN/ASee Reference 2
Orbital ShakerYamato Scientific AmericaSOU-300
Petri dishCelltreat229656
Quantum meterApogee InstrumentsMQ-510
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
ThermomixerEppendorf5382000015
Tris baseFisher ScientificBP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 PlasmidN/AN/ASee Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foilReynoldsB004NG90YO
AntifoamSigma-AldrichA8311
Bioreactor with control stationEppendorfB120110001
BioSpectrometer with μcuvetteEppendorf6135000923
BleachVWR Scientific89501-620 (CS)
Blue LED panelHQRP884667106091218
BPT tubingFisher Scientific14-170-15
GlucoseThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl)Fisher Scientific7647-01-0
M9 Minimal SaltsThermo Fisher ScientificA1374401
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
Microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5510
NH4OH SolutionSigma-AldrichI0503-1VL
Orbital ShakerYamato Scientific AmericaSOU-300
Quantum meterApogee InstrumentsMQ-510
SC Complete powderSunrise Science Products1459-100

Referencias

  1. Figueroa, D., Rojas, V., Romero, A., Larrondo, L. F., Salinas, F. The rise and shine of yeast optogenetics. Yeast. 38 (2), 131-146 (2021).
  2. Pouzet, S., et al. The promise of optogenetics for bioproduction: Dynamic ....

Reimpresiones y Permisos

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