Fermentações controladas por luz para produção de produtos químicos e proteicos microbianos

Resumo

O controle optogenético do metabolismo microbiano oferece controle dinâmico flexível sobre os processos de fermentação. O protocolo aqui mostra como configurar fermentações reguladas por luz azul para produção química e proteica em diferentes escalas volumosas.

Resumo

As fábricas de células microbianas oferecem uma alternativa sustentável para a produção de produtos químicos e proteínas recombinantes a partir de matérias-primas renováveis. No entanto, sobrecarregar um microrganismo com modificações genéticas pode reduzir o condicionamento físico e a produtividade do hospedeiro. Esse problema pode ser superado usando o controle dinâmico: expressão indutível de enzimas e caminhos, tipicamente usando aditivos à base de químicos ou nutrientes, para equilibrar o crescimento e a produção celular. A optogenética oferece um método não invasivo, altamente tável e reversível de regular dinamicamente a expressão genética. Aqui, descrevemos como configurar fermentações controladas por luz de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae para a produção de produtos químicos ou proteínas recombinantes. Discutimos como aplicar luz em horários selecionados e dosagens para desacoplar o crescimento e a produção microbiana para melhor controle de fermentação e produtividade, bem como as principais considerações de otimização para melhores resultados. Além disso, descrevemos como implementar controles de luz para experimentos bioreatores em escala de laboratório. Esses protocolos facilitam a adoção de controles optogenéticos em microrganismos projetados para melhor desempenho de fermentação.

Introdução

A optogenética, o controle de processos biológicos com proteínas leves responsivas, oferece uma nova estratégia para controlar dinamicamente as fermentações microbianas para a produção química e ^proteica1,2. A carga de vias metabólicas projetadas e a toxicidade de alguns intermediários e produtos muitas vezes prejudicam o crescimento ^celular3. Tais tensões podem levar à má acumulação de biomassa e à redução da ^{produtividade3}. Esse desafio pode ser enfrentado dividindo temporalmente as fermentações em uma fase de crescimento e produção, que dedicam recursos metabólicos ao acúmulo de biomassa ou à síntese do produto, ^{respectivamente4}. Recentemente, mostramos que a transição do crescimento para a produção nesta fermentação em duas fases pode ser induzida com mudanças nas condições de ^{iluminação5,6,7}. A alta sintonia, reversibilidade e ortogonalidade dos insumos ^leves8 oferecem vantagens únicas às fermentações controladas pela luz que são difíceis ou impossíveis de replicar com indutores químicos usados no controle dinâmico das fermentações convencionais em duas fases4,9,10,11.

A proteína EL222 responsiva de luz azul derivada de Erythrobacter litoralis tem sido usada para desenvolver vários circuitos optogenéticos para engenharia metabólica em Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. El222 contém um domínio sensor de tensão de oxigênio leve (LOV) que sofre uma mudança conformacional sobre a ativação da luz azul (465 nm), que permite que ele se ligue à sua sequência de DNA cognato (C120)¹³. Fundir EL222 ao domínio de ativação do VP16 viral (VP16-EL222) resulta em um fator de transcrição responsiva de luz azul que pode ativar reversivelmente a expressão genética em S. cerevisiae7 e outros ^organismos14 do promotor sintético _PC120. Vários circuitos baseados no EL222 foram desenvolvidos e utilizados para a produção química em S. cerevisiae, como o sistema OptoEXP ativado pela luz ^básica7, no qual o gene de interesse é diretamente expresso a partir de _PC120 (Figura 1A). No entanto, preocupações com a penetração da luz nas altas densidades celulares tipicamente encontradas na fase de produção de fermentações nos motivaram a desenvolver circuitos invertidos que são induzidos no escuro, como os circuitos OptoINVRT e OptoQ-INVRT (Figura 1B)^5,7,13. Estes sistemas aproveitam os regulons galactose (GAL) ou quinic acid (Q) de S. cerevisiae e N. crassa, respectivamente, controlando seus repressores correspondentes (GAL80 e QS) com VP16-EL222, para reprimir a expressão genética na luz e induzi-la fortemente no escuro. A combinação de circuitos OptoEXP e OptoINVRT resulta em controle bidirecional da expressão genética, permitindo fermentações em duas fases nas quais a fase de crescimento é induzida com luz azul, e a fase de produção com escuridão (Figura 2A)^5,7.

Usar a luz em vez de escuridão para induzir a expressão genética durante a fase de produção expandiria muito as capacidades de controles optogenéticos, mas também exigiria superar as limitações de penetração de luz das altas densidades celulares tipicamente encontradas nesta fase de fermentação. Para isso, desenvolvemos circuitos, conhecidos como OptoAMP e OptoQ-AMP, que amplificam a resposta transcricional à estimulação da luz azul. Esses circuitos usam mutantes do tipo selvagem ou hipersensíveis do VP16-EL222 para controlar a produção dos ativadores transcricionais Gal4p ou QF2 dos regulons GAL ou Q, respectivamente, alcançando maior sensibilidade e expressão genética mais forte com ^luz12,13 (Figura 1C). Os circuitos optoAMP podem alcançar indução de luz completa e homogênea em bioreatores de 5 L a uma densidade óptica (medida a 600 nm; _OD600) valores de pelo menos 40 com apenas ~0,35% de iluminação (5% de dose leve em apenas ~7% da superfície a granel). Isso demonstra um maior grau de sensibilidade em comparação com o OptoEXP, que requer cerca de 100% de ^{iluminação12}. A capacidade de induzir efetivamente a expressão genética com luz em altas densidades celulares abre novas oportunidades para o controle dinâmico das fermentações. Isso inclui fermentações operacionais em mais de duas fases temporais, como fermentações trifásicas, nas quais as fases de crescimento, indução e produção são estabelecidas com cronogramas de luz únicos para otimizar a produção química (Figura 2B)¹².

Figura 1: Circuitos optogenéticos para controle dinâmico de S. cerevisiae. Os circuitos OptoEXP, OptoINVRT e OptoAMP são baseados no sistema VP16-EL222 sensível à luz. (A) No circuito OptoEXP, a exposição à luz azul causa uma alteração conformacional e a dimerização do VP16-EL222, que expõe um domínio de vinculação de DNA e permite a transcrição do _PC120. O número foi modificado de Zhao et ^al.7. (B) Os circuitos OptoINVRT aproveitam os regulons GAL (mostrado) ou Q para induzir a expressão no escuro. Nos circuitos baseados em GAL, VP16-EL222 e GAL4 são expressos constitutivamente, enquanto a expressão de drives _PC120 do repressor GAL80 (em circuitos baseados em Q, GAL4 e GAL80 são substituídas por QF2 e QS, respectivamente, e um promotor sintético contendo QUAS é usado em vez de um promotor gal). À luz, Gal80p impede a ativação do gene de interesse do _PGAL1. No escuro, GAL80 não é expresso e rapidamente degradado, fundindo-o a um domínio degron constitutivo (pequeno domínio marrom), que permite a ativação de _PGAL1 por Gal4p. O número foi modificado de Zhao et ^al.5. (C) Os circuitos OptoAMP também usam VP16-EL222 para controlar os regulons GAL (mostrado) ou Q. Nestes circuitos, o repressor GAL80 (ou QS) é expresso e fundido constitutivamente e fundido a um degron sensível a fotos (pequeno domínio azul) garantindo uma repressão apertada no escuro. _PC120 e uma expressão de controle mutante hipersensível VP16-EL222 de GAL4 (ou QF2) com luz, que ativa fortemente O _PGAL1 (ou um promotor contendo QUAS) na luz. Os circuitos derivados de GAL podem usar formas projetadas de _PGAL1, como _PGAL1-M ou _PGAL1-S, que aumentaram a atividade, bem como promotores do tipo selvagem controlados pelo regulon GAL (_PGAL1, _PGAL10, _PGAL2, _PGAL7). A figura foi modificada de Zhao et ^al.12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Fermentações de duas e três fases através do tempo. (A) Fermentações em duas fases operadas com circuitos invertidos consistem em uma fase de crescimento orientada pela luz e uma fase de produção escura. Na fase de crescimento, a biomassa se acumula à medida que a via de produção permanece reprimida. Ao atingir o _OD600 desejado, as células são deslocadas para o escuro para ajustar metabolicamente antes de serem resuspendidas em novas mídias para a fase de produção. (B) Em um processo trifásica, as fases de crescimento, incubação e produção são definidas por cronogramas de luz únicos, que podem consistir em um período de crescimento escuro, incubação pulsada e fase de produção totalmente iluminada. Figura criada com Biorender. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Circuitos optogenéticos também foram desenvolvidos para controle dinâmico da produção química e proteica em E. coli. Os circuitos optoLAC controlam o repressor LacI bacteriano usando o circuito pDawn responsivo à luz, que é baseado no sistema de dois componentes YF1/^FixJ6 (Figura 3). Semelhante ao OptoINVRT5, os circuitos OptoLAC são projetados para reprimir a expressão genética na luz e induzi-la no escuro. Os níveis de expressão usando circuitos OptoLAC podem corresponder ou exceder aqueles alcançados com indução isopropílico padrão β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), mantendo assim a força da indução química ao mesmo tempo que oferece maior sintonia e ^{reversibilidade6}. Portanto, os circuitos OptoLAC permitem um controle optogenético eficaz para a engenharia metabólica em E. coli.

Figura 3: Circuitos OptoLAC para controle dinâmico de E. coli. Os circuitos OptoLAC adaptam o sistema pDawn e operon de lac para alcançar ativação no escuro e repressão à luz. No escuro, o YF1 fosforila fixJ, que então ativa o promotor _PFixK2 para expressar o repressor cI . O repressor de IC impede a expressão do repressor lacI do promotor de _PR , que permite a transcrição do gene de interesse de um promotor contendo lacO. Por outro lado, a luz azul reduz a atividade de quinase líquida YF1, invertendo a fosforilação fixJ e, portanto, a expressão cI , que deprime a expressão do lacI e impede a expressão do promotor contendo lacO. O número foi modificado de Lalwani et ^al.6. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Descrevemos aqui os protocolos básicos para fermentações controladas pela luz de S. cerevisiae e E. coli para produção química ou proteica. Para a levedura e as bactérias, primeiro focamos em fermentações com uma fase de crescimento impulsionada pela luz e uma fase de produção induzida pela escuridão habilitada pelos circuitos OptoINVRT e OptoLAC. Posteriormente, descrevemos um protocolo para uma fermentação trifásica (crescimento, indução, produção) controlada por luz habilitada pelos circuitos OptoAMP. Além disso, descrevemos como escalar fermentações optogeneticamente controladas de microplacos a bioreatores em escala de laboratório. Com este protocolo, pretendemos fornecer um guia completo e facilmente reprodutível para a realização de fermentações controladas por luz para produção química ou proteica.

Protocolo

1. Produção química controlada por luz utilizando o circuito S. cerevisiae OptoINVRT7

1. Construção de cepa
   1. Obtenha uma cepa com sua3 auxotrofia, pois este marcador é necessário para a maioria dos plasmídeos OptoINVRT ^existentes5. Se buscar a regulação optogenética de um gene nativo de S. cerevisiae, construa uma cepa na qual qualquer cópia endógena do gene seja excluída.
   2. Linearize o plasmídeo contendo o circuito OptoINVRT7, como o EZ-L4395, e integre-o no his3-locus da cepa auxotrófica usando métodos padrão de transformação de lítio-acetato15. Se usar o plasmídeo EZ-L439, que contém os componentes para reprimir O _PGAL1 na luz e ativá-lo no escuro, linearize-o no local de restrição do PmeI.
   3. Após a transformação, centrifugar as células a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de meio completo sintético de histidina fresco (SC-His).
   4. Emplaque todo o volume celular em placas de ágar SC-Seu e incubar a 30 °C por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
   5. Prepare células competentes dessa cepa usando protocolos padrão de transformação de acetato de lítio e transforme-as com um plasmídeo contendo os genes para serem controlados optogeneticamente a jusante do promotor _PGAL1-M ou _PGAL1-S5.
      NOTA: O uso de um plasmídeo que se integra em δ-locais (YARCdelta5) e seleciona com Zeocin permite integração multicópia estável7,16,17,18.
   6. Após a transformação, centrifugar a cultura a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de meio sc-dropout fresco.
      NOTA: O promotor _PGAL1-M é uma versão sintética do promotor _PGAL1 com os sites de repressão Mig1p excluídos, enquanto o _PGAL1-S é uma versão projetada do _PGAL1-M, que tem sites extras de ligação do ativador Gal4p. O promotor _PGAL1 regular pode ser usado para controlar a expressão; no entanto, a força de expressão será menor do que esses promotores projetados.
   7. Plaque o volume inteiro da célula em uma placa de ágar extrato de levedura peptone dextrose (YPD) se integrando-se em δ-locais, ou uma placa de evasão sc se transformar com um plasmídeo contendo um marcador de seleção. Incubar a 30 °C por 16 h sob luz azul constante para manter o gene otogeneticamente controlado reprimido.
      NOTA: Para algumas cepas, as colônias podem crescer mais rapidamente quando incubadas em pulsos de luz azul (por exemplo, 1 s on/79 s off, 5 s on/75 s off, 10 s on/70 s off, etc.) em vez de em iluminação constante, que deve ser determinada experimentalmente para cada cepa, se necessário.
   8. Use qualquer fonte de luz de 465 nm e coloque um painel LED ~40 cm acima da placa de tal forma que a intensidade da luz seja ~80-110 μmol/^m2/s. Meça a intensidade usando um medidor quântico (ver Tabela de Materiais).
   9. Se integrar em δ-sites, crie uma réplica da placa em placas YPD contendo uma gama de concentrações de Zeocina entre 400 μg/mL e 1.200 μg/mL para selecionar para uma variedade de números de cópia de integração5,7,12,16,17,18. Incubar as placas de réplica a 30 °C sob luz azul constante ou pulsada por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
2. Triagem preliminar para as melhores colônias
   1. Selecione oito colônias de cada placa e use-as para vacinar 1 mL de SC-Seu meio complementado com 2% de glicose em poços individuais de uma placa de 24 poços. Cresça em placas de 24 poços sob as células durante a noite (16-20 h) a 30 °C com 200 rpm (diâmetro orbital de 19 mm) tremendo sob iluminação constante de luz azul.
   2. Na manhã seguinte, diluir cada cultura em 1 mL de um sc-seu médio fresco com 2% de glicose a _OD600 valores variando de 0,01-0,3 e crescer em placas de 24 poços sob luz constante ou pulsada a 30 °C com 200 rpm tremendo até atingirem densidades celulares entre 2 e 9 valores _OD600 (Figura 4A). A quantidade de tempo necessária para esta fase de crescimento dependerá da tensão.
   3. Incubar as placas no escuro por 4h a 30 °C com 200 rpm tremendo desligando o painel de luz e enrolando as placas em papel alumínio.
      NOTA: Esta etapa permite que as células transitem metabolicamente para a fase de produção antes da ressuspensão na mídia de produção.
   4. Para iniciar a fase de produção, centrifugar as culturas na placa de 24 poços a 234 x g por 5 min e resuspend células em 1 mL de sc-dropout médio fresco com 2% de glicose. Sele as placas para evitar a evaporação do produto desejado usando fita de vedação microplatéria estéril.
   5. Fermente as placas seladas no escuro por 48h a 30 °C com agitação a 200 rpm. Certifique-se de que as placas estão enroladas em papel alumínio para evitar qualquer exposição à luz.
      NOTA: Embrulhar as placas em papel alumínio não limita a disponibilidade de oxigênio ou gás nas fermentações; no entanto, a fita de vedação estéril limita a transferência de gás. Pequenos orifícios podem ser cutucados na fita para introduzir oxigênio, se necessário.
3. Colheita e análise
   1. Para colher as fermentações, centrifufique as placas por 5 min a 234 x g e transfira 800 μL do supernatante em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
   2. Dependendo do produto químico de interesse, analise usando cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), espectrometria de cromatografia-massa gasosa (GC-MS), ou outro método analítico utilizando a técnica de preparação da amostra mais adequada para o instrumento utilizado.

2. Produção de proteína controlada por luz utilizando o sistema E. coli OptoLAC

1. Construção de cepa
   1. Co-transforme eletrocompetente BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 com um plasmídeo contendo o circuito OptoLAC1B ou OptoLAC2B6 e um plasmídeo que expressa a proteína recombinante de interesse do promotor _PT719.
   2. Após a transformação, recupere as células por 1 h em 1 mL de caldo super ótimo com repressão catabólito (SOC; 2% tripla, extrato de levedura de 0,5%, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM _MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM de glicose) a 37 °C com rotação ou agitação.
      NOTA: O plasmídeo contendo a proteína de interesse deve ser compatível com o plasmídeo OptoLAC (ou seja, marcador de resistência diferente e origem da replicação) e não deve conter uma cópia de lacI.
   3. Centrifugar as células a 4845 x g por 3 min e concentrar a pelota em 200 μL de caldo de lysogenia (LB). Coloque as células concentradas em uma placa de ágar LB com antibióticos apropriados e cresça a 37 °C durante a noite sob luz azul constante para manter a expressão proteica reprimida.
2. Triagem inicial para verificar a expressão
   1. Pegue três colônias simples e use-as para vacinar 1 mL de mídia LB com antibióticos apropriados em poços individuais de uma placa de 24 poços. Cresça durante a noite (16-20 h) a 37 °C com 200 rpm tremendo sob iluminação constante de luz azul (Figura 4A).
   2. No dia seguinte, use 1,5 μL de cultura para medir _OD600 em um espectrofotômetro com uma medição de microvolume. Culturas diluídas em 1 mL de LB fresco em placas de 24 poços a valores _OD600 que variam de 0,01-0,1.
   3. Cresça as culturas a 37 °C com 200 rpm tremendo sob luz azul por 2-3 h. A partir da segunda hora, faça medições de _OD600 a cada 15 minutos para garantir que as culturas não superem a faixa _OD600 de 0,1-1,5.
   4. Uma vez que as culturas estejam no _OD600 desejado, desligue o painel de luz e enrole a placa em papel alumínio para iniciar a fase de produção. Mantenha a placa no escuro por 8h (37 °C), 20 h (30 °C) ou 48 h (18 °C), com 200 rpm tremendo.
   5. Medir e registrar o valor final de _OD600 de cada cultura.
3. Colheita e análise
   1. Transfira 800 μL de cada cultura para um tubo de microcentrifuuge de 1,5 mL e centrífuga por 5 min a 17.000 x g.
   2. Resuspense a pelota de célula em 200 μL de tampão de ressuspensão (Tris 50 mM, pH 8.0, NaCl 300 mM).
      NOTA: A concentração de NaCl pode ser ajustada com base na proteína recombinante que está sendo analisada.
   3. Adicione 50 μL de 6x sulfato de sódio (SDS) tampão de amostra (Tris 375 mM, pH 6.8, SDS 9%, glicerol 50%, azul bromofenol 0,03%, DTT 9%). Incubar a 100 °C por 10 min com agitação a 700 rpm em um termomixer.
   4. Carregue ~3-20 μL da cultura em um gel SDS-PAGE de 12%. Utilizando a medição final de _OD600 como guia, carregue aproximadamente a mesma quantidade de proteína para cada amostra (equivalente a 10 μL da amostra correspondente a um valor final de _OD600 de 1). Use uma fonte de alimentação para executar a eletroforese a 100 V até que o gel esteja totalmente resolvido.
   5. Colora o gel com solução G-250 azul brilhante Coomassie aquecendo para 30-40 s em um forno de micro-ondas, e depois incubando em um rotador de plataforma por pelo menos 15 minutos.
   6. Enxágüe com água deionizada duas vezes e desestir em um rotador de plataforma por pelo menos 30 minutos (ou durante a noite), adicionando dois lenços de limpeza amarrados em um nó para ajudar a absorver a mancha. Ferva o gel em quantidade suficiente de água no forno micro-ondas por 15 minutos para acelerar o processo de desinsindúnte.

3. Fermentação trifásica utilizando o sistema S. cerevisiae OptoAMP

1. Construção de cepa
   1. Obtenha uma cepa com um marcador auxotrófico his3 , pois este marcador é necessário para usar os plasmídeos OptoAMP ^existentes5. Se buscar a regulação optogenética de um gene nativo de S. cerevisiae, construa uma cepa na qual a cópia endógena deste gene seja excluída.
   2. Linearize um plasmídeo contendo o circuito OptoAMP4, como o EZ-L58012, e integre-o no lócus his3 da cepa auxotrófica usando métodos padrão de transformação de lítio-acetato15. Se usar OZ-L580, linearize o plasmídeo no local de restrição do PmeI.
   3. Após a transformação, centrifugar as células a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de SC-Seu médio fresco.
   4. Emplaque todo o volume celular em mídia seletiva (SC-His-ágar) e incubar a 30 °C por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
   5. Prepare células competentes dessa cepa e transforme-as com um plasmídeo contendo os genes para serem controlados optogeneticamente a jusante do promotor _PGAL1-S12.
      NOTA: O uso de um plasmídeo que se integra em δ locais e seleciona com Zeocin permite integração e seleção de multicópias estáveis.
   6. Depois de transformar, centrifugar a cultura a 150 x g por 1 min e suavemente resuspend em 200 μL de médio sc-dropout fresco.
      NOTA: O promotor _PGAL1-S é uma versão sintética do promotor _PGAL1 no qual os sites de repressão Mig1p são excluídos e sites extras de vinculação do ativador Gal4p são adicionados. O promotor _PGAL1 regular pode ser usado; no entanto, a força de expressão será menor do que este promotor projetado.
   7. Emplaque todo o volume celular em uma placa de ágar YPD ou SC-dropout e incubar a 30 °C por 16 h no escuro (envolto em papel alumínio). A incubação no escuro mantém o gene otogeneticamente controlado reprimido, o que permite que as células direcionem seus recursos metabólicos para o crescimento celular em vez de produção química.
   8. Se integrar em δ-sites, a réplica de placas YPD contendo uma série de concentrações de Zeocin para selecionar para uma variedade de números de cópia de integração. Incubar as placas a 30 °C no escuro (embrulhado em papel alumínio) por 2-3 dias até que as colônias apareçam.
2. Triagem preliminar para as melhores colônias
   1. Selecione oito colônias de cada placa e use-as para vacinar 1 mL de SC-Seu meio com 2% de glicose em poços individuais de uma placa de 24 poços. Cresça as células durante a noite (16-20 h) no escuro a 30 °C com 200 rpm tremendo.
   2. Na manhã seguinte, diluir cada cultura em 1 mL de SC-Seu médio fresco com 2% de glicose a 0,1 _OD600 e crescer no escuro a 30 °C com 200 rpm tremendo até atingir um _OD600 de 3. Enrole as placas em papel alumínio para evitar a exposição à luz. A quantidade de tempo necessária para esta fase de crescimento dependerá da tensão.
   3. Para iniciar a fase de indução, incubar as placas sob luz pulsada (por exemplo, 5 s on/95 s off) por 12 h a 30 °C com 200 rpm tremendo. Use qualquer fonte de luz de 465 nm e coloque um painel led acima da placa de tal forma que a intensidade da luz seja ~80-110 μmol/^m2/s para obter resultados ótimos (Figura 4A).
      NOTA: A duração ideal do pulso de luz para esta incubação variará de acordo com o produto químico produzido. Recomenda-se a triagem de uma série de horários de luz de 0,1% (por exemplo, 1 s em 999 s off) a 100% (luz completa).
   4. Para iniciar a fase de produção, centrifugar as culturas a 234 x g por 5 min e resuspend em SC-Seu médio fresco com 2% de glicose. Sele as placas para evitar a evaporação do produto desejado usando fita de vedação microplata estéril.
   5. Fermente as placas seladas em luz por 48h a 30 °C com agitação a 200 rpm. Otimize o cronograma de luz durante esta etapa, pois alguns produtos químicos se beneficiam de uma fase de produção pulsada em vez de luz total.
3. Colheita e análise
   1. Colher as fermentações por centrifugação das placas por 5 min a 234 x g e transferir 800 μL do supernante em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL.
   2. Dependendo do produto químico de interesse, analise usando HPLC, GC-MS ou outro método analítico utilizando a técnica de preparação da amostra mais adequada para o instrumento utilizado.

4. Produção química (mevalonato) de E. coli em um bioreator controlado pela luz

1. Inoculação inicial e configuração do bioreator
   1. Inocula uma colônia de uma cepa E. coli projetada com produção química controlada pela luz em 5 mL de sais mínimos M9 (3,37 mM _Na2HPO4, 2,2 mM _KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM _NH4Cl) suplementados com 0,2% w/v casaminoácidos, 5% w/v de glicose e mistura de metais ^trace20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L _CoCl2, 0,015 g/L MnCl2, 0,0015 g/L _CuCl2, 0,003 g/L _H3BO3, 0,0025 g/L _Na2MoO4, 0,008 g/L ZnCl2, 0,06 g/L Fe (III) citrato, 0,0045 g/L thiamine, 1,3 g/L MgSO4) em um tubo conlical de 50 m.
   2. Cresça a cultura durante a noite a 30 °C com 200 rpm tremendo sob iluminação de luz azul.
   3. Configure a placa principal do vaso bioreator, certificando-se de que as seguintes portas estejam instaladas: inserir para sonda térmica; sonda de oxigênio dissolvido (DO); sparger de gás - conectar-se à fonte de ar através de um filtro de 0,2 μm; impulsor; condensador de gás - conecte-se a um filtro de 0,2 μm; linha de resfriamento (x2); linhas de alimentação (x2) - uma para adição de mídia, outra para controle de pH; linha de amostragem - garantir que atinja a parte inferior do vaso; porto vazio; pH sonda - calibrar a sonda com padrões de pH = 4 e pH = 7 antes da instalação, seja autoclave com o resto do vaso ou esterilizar com 95% de etanol e asepticamente inserir antes da configuração.
   4. Encha o recipiente com 1 L de água filtrada, e conecte a placa da cabeça e aperte, certificando-se de que o anel O se encaixa e sela.
   5. Cubra qualquer abertura no reator com papel alumínio.
   6. Prepare três tiras de tubulação: uma para a remoção da água, uma para inserção da ração e outra para controle de pH. Cubra as extremidades com papel alumínio e enrole toda a tubulação em papel alumínio.
      NOTA: O _NH4OH, que é usado para ajuste de pH, não flui suavemente em tubos de silicone, o que pode levar a taxas de fluxo imprecisas e sobre-basificação da cultura. Para evitar esse problema, use tubos de bomba biocompatíveis (BPT) para a alimentação _NH4OH.
   7. Autoclave o bioreator e tubo, usando um ciclo líquido de 30 minutos.
   8. Remova os materiais da autoclave. Uma vez frio o suficiente para manusear, conecte as sondas impeller, pH e DO, fonte de ar, entrada e saída do condensador, e entrada e saída de resfriamento à estação de controle.
   9. Insira a sonda térmica e cubra a nave com uma jaqueta de aquecimento. Fixar a jaqueta em direção ao topo do vaso para evitar bloquear a cultura da exposição à luz.
   10. Conecte um dos tubos estéreis à linha de amostragem e fixe através da bomba de amostragem. Coloque a outra extremidade de tal forma que ela flua em um recipiente vazio que pode conter pelo menos 1 L. Drene a água dentro do vaso.
   11. Conecte outro tubo estéril a uma das linhas de alimentação e proteja através de uma das bombas de alimentação. Conecte a outra extremidade do tubo a uma garrafa de mídia M9. Alimente a mídia para o reator.
   12. Conecte outro tubo estéril a uma das linhas de alimentação e proteja através de uma das bombas de alimentação. Conecte a outra extremidade do tubo à garrafa contendo 28%-30% _NH4OH.
       ATENÇÃO: _NH4OH é corrosivo. Trabalhe em um capô de fumaça enquanto se transfere para uma garrafa de ração e certifique-se de que a garrafa de alimentação seja colocada em contenção secundária.
   13. Coloque três painéis de luz em uma formação triangular ~20 cm de distância do reator, verificando se as intensidades de luz na superfície do vaso atingem ~80-110 μmol/^m2/s de cada lado (Figura 4B).
   14. No dia seguinte, ligue o sistema bioreator e o refrigerador. Defina o ponto de temperatura do reator para 37 °C, o ponto de 7,0 do pH e a agitação a 200 rpm. A jaqueta de aquecimento deve ligar.
   15. Calibrar a sonda DO pela primeira vez esperando até que a temperatura e as medições DO se tornem constantes (este será o ponto de setpoint 100%). Em seguida, desconecte a sonda do sistema (este será o setpoint de 0%). Repita até que a medição DO se estabilize em 100% quando a sonda estiver conectada e, em seguida, defina o setpoint DO para 20%.
2. Produção química controlada por luz
   1. Inocular o bioreator a um _OD600 inicial de 0,001-0.1. Ligue os painéis de luz para iniciar o crescimento.
   2. Após 3h, comece a colher amostras da linha amostral para tomar medições de _OD600 para evitar o excesso de crescimento da densidade celular ideal de indução (_ρs). Uma vez alcançado o _ρs ideal (o valor ideal para a produção de mevalonato é 0,17), desligue os painéis de luz, cubra o reator em papel alumínio e enrole a configuração em pano preto para iniciar a fase de produção escura.
   3. Adicione 50 μL de antifoam, 8h depois de mudar para escuridão. Desaparafusar a porta vazia e pipeta o antifoam diretamente no reator.
   4. Use a porta de amostragem para coletar periodicamente amostras para análise hplc ou gc.
3. Desmontagem e análise
   1. Depois que o experimento for concluído, desligue o sistema. Desaparafusar cuidadosamente as sondas DO e pH e lavá-las com água e sabão. Desaparafusar a placa da cabeça e lavá-la com água e sabão usando um pincel.
   2. Transfira a cultura para um recipiente vazio e adicione alvejante a uma concentração final de 10% v/v. Coloque em um capô de fumaça e descarte depois de 30 minutos.
   3. Lave o vaso do reator com água e sabão usando uma escova.
   4. Prepare as amostras para análise com base no produto de interesse. Para produção de mevalonato, misture 560 μL de cultura com 140 μL de 0,5 M HCl e vórtice em alta velocidade por 1 min. Isso converte mevalonato em (±)-mevalonolactona.
      ATENÇÃO: HCl é um risco para a saúde. Manuseie com EPI adequado e certifique-se de que os tubos de amostra estejam devidamente tampados antes do vórtice.
   5. Centrifugar a 17.000 x g por 45 min a 4 °C. Transfira 250 μL do supernatante para um frasco HPLC.
   6. Para o mevalonato, analise amostras usando uma coluna de troca de íons ácidos orgânicos. Quantifique a produção usando um detector de índice refrativo (RID), comparando áreas de pico a um padrão de (±)-mevalonolactona.

Resultados

A regulação optogenética do metabolismo microbiano foi implementada com sucesso para produzir uma variedade de produtos, incluindo biocombustíveis, produtos químicos a granel, proteínas e produtos naturais5,6,7,12,13. A maioria desses processos são projetados para que o crescimento celular ocorra à luz (quando a baixa densidade celular apresenta desafi...

Discussão

O controle dinâmico tem sido aplicado há muito tempo para melhorar os rendimentos da engenharia metabólica e da produção de proteínas recombinantes4. Mudanças na expressão enzimática são mais tipicamente implementadas usando indutores químicos como ^IPTG21, galactose22 e tetraciclina23, mas também foram mediadas usando condições de processo como temperatura e pH. O controle optogenético da expressão genética el...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate	USA Scientific	CC7672-7524
Agar powder	Thermo Fisher Scientific	303991049
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid	N/A	N/A	See Reference 1
Glucose	Thermo Fisher Scientific	501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Petri dish	Celltreat	229656
PmeI	New England Biolabs	R0560L
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
Replica-plating device	Thomas Scientific	F37848-0000
Replica-plating pads	Sunrise Science Products	3005-012
SC-His powder	Sunrise Science Products	1303-030
SC Complete powder	Sunrise Science Products	1459-100
Sterile sealing film	Excel Scientific	STR-SEAL-PLT
YPD agar plates	VWR	100217-054
Zeocin	Thermo Fisher Scientific	R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer	Cepham Life Sciences	10502
12% Acrylamide protein gels	Thermo Fisher Scientific	NP0341BOX
24-well culture plate	USA Scientific	CC7672-7524
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250	Thermo Fisher Scientific	20279
Electrophoresis cell	Bio-Rad	1658004
Electrophoresis power supply	Bio-Rad	1645050
LB broth (Miller)	Fisher Scientific	BP97235
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
NaCl	Thomas Scientific	SX0425-1
OptoLAC plasmids	N/A	N/A	See Reference 2
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Petri dish	Celltreat	229656
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
SOC medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Tris base	Fisher Scientific	BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid	N/A	N/A	See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
Antifoam	Sigma-Aldrich	A8311
Bioreactor with control station	Eppendorf	B120110001
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Bleach	VWR Scientific	89501-620 (CS)
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
BPT tubing	Fisher Scientific	14-170-15
Glucose	Thermo Fisher Scientific	501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	7647-01-0
M9 Minimal Salts	Thermo Fisher Scientific	A1374401
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
NH4OH Solution	Sigma-Aldrich	I0503-1VL
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
SC Complete powder	Sunrise Science Products	1459-100