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요약

미생물 대사의 광유전학적 조절은 발효 과정에 대한 유연한 동적 제어를 제공합니다. 여기의 프로토콜은 다양한 부피 규모에서 화학 및 단백질 생산을위한 청색광 조절 발효를 설정하는 방법을 보여줍니다.

초록

미생물 세포 공장은 재생 가능한 공급 원료에서 화학 물질 및 재조합 단백질을 생산하기위한 지속 가능한 대안을 제공합니다. 그러나 유전자 변형으로 미생물에게 과도한 부담을 주면 숙주 적합성과 생산성이 떨어질 수 있습니다. 이 문제는 동적 조절을 사용하여 극복 할 수 있습니다 : 효소 및 경로의 유도 가능한 발현, 일반적으로 화학 물질 또는 영양소 기반 첨가제를 사용하여 세포 성장과 생산의 균형을 유지합니다. 광유전학은 유전자 발현을 동적으로 조절하는 비침습적이고, 고도로 조정가능하며, 가역적인 방법을 제공한다. 여기에서는 화학 물질 또는 재조합 단백질 생산을 위해 조작 된 에스케리치아 콜리 및 사카로 마이스 세레 비시아 (Saccharomyces cerevisiae )의 광 조절 발효를 설정하는 방법을 설명합니다. 우리는 발효 제어 및 생산성 향상을 위해 미생물 성장과 생산을 분리하기 위해 선택된 시간과 복용량에 빛을 적용하는 방법과 최상의 결과를 위한 주요 최적화 고려 사항에 대해 논의합니다. 또한, 우리는 실험실 규모의 생물 반응기 실험을위한 조명 제어를 구현하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 향상된 발효 성능을 위해 조작된 미생물에서 광유전학적 제어의 채택을 용이하게 합니다.

서문

광유전학은 광반응 단백질로 생물학적 과정을 제어하며, 화학 및 단백질 생산을 위한 미생물 발효를 동적으로 제어하는 새로운 전략을 제공합니다1,2. 조작된 대사 경로의 부담과 일부 중간체 및 제품의 독성은 종종 세포 성장을 손상시킵니다3. 이러한 스트레스는 바이오매스 축적을 저하시키고 생산성을 저하시킬 수 있습니다3. 이 과제는 발효를 일시적으로 성장 및 생산 단계로 나눠서 해결할 수 있으며, 이는 각각 바이오 매스 축적 또는 제품 합성에 대사 자원을 바칩니다4. 우리는 최근에이 두 단계 발효에서 성장에서 생산으로의 전환이 조명 조건의 변화에 따라 유도 될 수 있음을 보여주었습니다5,6,7. 광 입력의 높은 튜닝성, 가역성 및 직교성8은 기존의 2상 발효의 동적 제어에 사용되는 화학 유도제와 복제하기가 어렵거나 불가능한 광 제어 발효에 고유한 이점을 제공합니다4,9,10,11.

Erythrobacter litoralis에서 유래 한 청색광 반응 EL222 단백질은 Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13에서 대사 공학을위한 여러 광유전학 회로를 개발하는 데 사용되었습니다. EL222는 청색광 활성화(465nm)시 형태적 이동을 겪는 광산소-전압 센서(LOV) 도메인을 함유하고 있으며, 이를 통해 동족 DNA 서열(C120)13에 결합할 수 있습니다. EL222를 바이러스 VP16 활성화 도메인 (VP16-EL222)에 융합시키는 것은 합성 프로모터 PC120으로부터 S. cerevisiae7 및 다른 유기체14에서 유전자 발현을 가역적으로 활성화시킬 수 있는 청색광 반응성 전사 인자를 초래한다. EL222에 기초한 몇몇 회로가 개발되어 PC120으로부터 관심있는 유전자가 직접 발현되는 기본 광활성화 OptoEXP 시스템7과 같은 S. cerevisiae의 화학 생산에 사용되었다(도 1A). 그러나 발효의 생산 단계에서 일반적으로 발생하는 높은 세포 밀도에서의 광 침투에 대한 우려는 OptoINVRT 및 OptoQ-INVRT 회로와 같은 어둠 속에서 유도되는 반전 회로를 개발하도록 동기를 부여했습니다 (그림 1B) 5,7,13. 이들 시스템은 각각 S. cerevisiae 및 N. crassa로부터의 갈락토오스 (GAL) 또는 퀸산 (Q) 조절을 이용하여, VP16-EL222로 그들의 상응하는 억제기 (GAL80 및 QS)를 제어하여, 빛에서 유전자 발현을 억제하고 어둠 속에서 강하게 유도한다. OptoEXP와 OptoINVRT 회로를 결합하면 유전자 발현의 양방향 제어가 가능하여 성장 단계가 청색광으로 유도되는 2 상 발효가 가능하고 어둠이있는 생산 단계 (그림 2A)5,7.

생산 단계에서 유전자 발현을 유도하기 위해 어둠 대신 빛을 사용하는 것은 광유전학적 조절의 능력을 크게 확장시킬 것이지만, 또한 발효의 이 단계에서 전형적으로 직면하는 높은 세포 밀도의 광 침투 한계를 극복할 필요가 있을 것이다. 이를 위해 우리는 청색광 자극에 대한 전사 반응을 증폭시키는 OptoAMP 및 OptoQ-AMP로 알려진 회로를 개발했습니다. 이들 회로는 VP16-EL222의 야생형 또는 과민성 돌연변이체를 사용하여 각각 GAL 또는 Q 레귤론의 전사 활성화제 Gal4p 또는 QF2의 생산을 조절하여, light12,13으로 향상된 감도와 더 강한 유전자 발현을 달성한다(도 1C). OptoAMP 회로는 광학 밀도(600nm에서 측정; OD600) 값은 조명의 ~0.35%만을 갖는 적어도 40의 값(벌크 표면의 ~7%에서만 5% 광량). 이는 100%에 가까운 조명이 필요한 OptoEXP에 비해 더 높은 수준의 감도를 보여줍니다12. 높은 세포 밀도에서 빛으로 유전자 발현을 효과적으로 유도하는 능력은 발효의 역동적 인 조절을위한 새로운 기회를 열어줍니다. 여기에는 화학 생산을 최적화하기 위해 고유한 조명 일정으로 성장, 유도 및 생산 단계가 설정되는 삼상 발효와 같은 두 개 이상의 시간적 단계에서 발효를 운영하는 것이 포함됩니다(그림 2B)12.

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그림 1 : S. cerevisiae의 동적 제어를위한 광유전학 회로. OptoEXP, OptoINVRT 및 OptoAMP 회로는 빛에 민감한 VP16-EL222 시스템을 기반으로 합니다. (A) OptoEXP 회로에서, 청색광에 노출되면 VP16-EL222의 형태적 변화 및 이량체화가 일어나며, 이는 DNA 결합 도메인을 노출시키고 PC120으로부터의 전사를 허용한다. 그림은 Zhao et al.7에서 수정되었습니다. (b) OptoINVRT 회로는 어둠 속에서 발현을 유도하기 위해 GAL (도시) 또는 Q 레귤론을 이용한다. GAL 기반 회로에서 VP16-EL222 및 GAL4는 구성적으로 발현되는 반면, PC120은 GAL80 리프레서의 발현을 구동합니다 (Q 기반 회로에서는 GAL4 및 GAL80이 각각 QF2 및 QS 로 대체되고 GAL 프로모터 대신 합성 QUAS 함유 프로모터가 사용됩니다). 빛에서, Gal80p는 PGAL1로부터 관심있는 유전자의 활성화를 방지한다. 어둠 속에서, GAL80은 발현되지 않고 Gal4p에 의한 PGAL1의 활성화를 허용하는 구성적 데그론 도메인 (작은 갈색 도메인)에 융합함으로써 빠르게 분해된다. 그림은 Zhao et al.5에서 수정되었습니다. (C) OptoAMP 회로는 또한 VP16-EL222를 사용하여 GAL (그림) 또는 Q 레귤론을 제어합니다. 이 회로에서 GAL80 리프레서 (또는 QS)는 구성적으로 표현되고 감광성 데그론 (작은 파란색 도메인)에 융합되어 어둠 속에서 엄격한 억압을 보장합니다. PC120 및 과민성 VP16-EL222 돌연변이체는 빛과 함께 GAL4 (또는 QF2)의 발현을 조절하며, 이는 광에서 PGAL1 (또는 QUAS 함유 프로모터)을 강하게 활성화시킨다. GAL에서 유래한 회로는 활성이 증가한 PGAL1-M 또는 PGAL1-S와 같은 조작된 형태의 PGAL1뿐만 아니라 GAL 레귤론(PGAL1, PGAL10, PGAL2, PGAL7)에 의해 조절되는 야생형 프로모터를 사용할 수 있다. 그림은 Zhao et al.12에서 수정되었습니다.이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 시간에 따른 2상 및 삼상 발효. (A) 거꾸로 된 회로로 작동하는 2상 발효는 광구동 성장 단계와 어두운 생산 단계로 구성됩니다. 성장 단계에서 바이오 매스는 생산 경로가 억압 된 상태로 유지됨에 따라 축적됩니다. 원하는 OD600에 도달하면, 세포는 생산 단계를 위해 신선한 배지에 재현탁되기 전에 대사적으로 조정하기 위해 어둠으로 이동된다. (B) 삼상 공정에서 성장, 배양 및 생산 단계는 어두운 성장 기간, 펄스 인큐베이션 및 완전히 조명 된 생산 단계로 구성 될 수있는 고유 한 광 일정에 의해 정의됩니다. 바이오렌더로 만든 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

광유전학 회로는 또한 대장균에서 화학 및 단백질 생산의 동적 제어를 위해 개발되었다. OptoLAC 회로는 YF1/FixJ 두 구성 요소 시스템6을 기반으로 하는 광 반응 pDawn 회로를 사용하여 박테리아 LacI 리프레저를 제어합니다(그림 3). OptoINVRT5와 유사하게, OptoLAC 회로는 빛에서 유전자 발현을 억제하고 어둠 속에서 유도하도록 설계되었습니다. OptoLAC 회로를 사용하는 발현 수준은 표준 이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG) 유도로 달성된 수준과 일치하거나 초과할 수 있으므로 화학적 유도의 강도를 유지하면서 향상된 튜닝성 및 가역성을 제공합니다6. 따라서, OptoLAC 회로는 대장균에서 대사 공학을 위한 효과적인 광유전학적 조절을 가능하게 한다.

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그림 3: 대장균의 동적 제어를 위한 OptoLAC 회로. OptoLAC 회로는 pDawn 시스템과 lac 오페론을 조정하여 어둠 속에서의 활성화와 빛에서의 억압을 달성합니다. 어둠 속에서, YF1은 FixJ를 인산화시키고, 이는 pFixK2 프로모터를 활성화시켜 cI 리프레서를 발현시킨다. cI 리프레서는 PR 프로모터로부터의 lacI 리프레서의 발현을 방지하며, 이는 lacO 함유 프로모터로부터 관심있는 유전자의 전사를 허용한다. 반대로, 청색광은 YF1 순 키나제 활성을 감소시키고, FixJ 인산화 및 따라서 cI 발현을 역전시키고, 이는 lacI의 발현을 억제하고 lacO 함유 프로모터로부터의 발현을 방지한다. 이 그림은 Lalwani et al.6에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 화학 또는 단백질 생산을위한 S. cerevisiae 및 대장균 의 광 조절 발효를위한 기본 프로토콜을 여기에서 설명합니다. 효모와 박테리아 모두를 위해, 우리는 먼저 OptoINVRT 및 OptoLAC 회로에 의해 활성화 된 빛 구동 성장 단계와 어둠으로 인한 생산 단계를 가진 발효에 중점을 둡니다. 이어서, 우리는 OptoAMP 회로에 의해 활성화된 삼상(성장, 유도, 생산) 광 제어 발효를 위한 프로토콜을 설명한다. 또한, 우리는 광유전학적으로 제어된 발효물을 마이크로플레이트에서 실험실 규모의 생물반응기로 확장하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 우리는 화학 또는 단백질 생산을위한 광 제어 발효를 수행하기위한 완전하고 쉽게 재현 할 수있는 가이드를 제공하는 것을 목표로합니다.

프로토콜

1. S. cerevisiae OptoINVRT7 회로를 사용한 광 제어 화학 생산

  1. 스트레인 건설
    1. his3 영양위축을 갖는 균주를 얻고, 이 마커는 대부분의 현존하는 OptoINVRT 플라스미드5에 필요하기 때문이다. S. cerevisiae에 자생하는 유전자의 광유전학적 조절을 추구하는 경우, 유전자의 내인성 사본이 결실되는 균주를 구축한다.
    2. EZ-L4395와 같은 OptoINVRT7 회로를 포함하는 플라스미드를 선형화하고, 표준 리튬-아세테이트 변환 방법을 사용하여 영양영양 균주의 his3-유전자좌 내로 통합시킨다15. PGAL1을 빛에서 억누르고 어둠 속에서 활성화시키는 성분들을 포함하고 있는 EZ-L439 플라스미드를 사용하는 경우, PmeI 제한 부위에서 선형화한다.
    3. 형질전환 후, 세포를 1분 동안 150 x g 에서 원심분리하고, 200 μL의 신선한 히스티딘-드롭아웃 합성 완전 배지 (SC-His) 배지에 부드럽게 재현탁시킨다.
    4. 전체 세포 부피를 SC-His 한천 플레이트 상에 플레이트하고, 콜로니가 나타날 때까지 2-3일 동안 30°C에서 인큐베이션한다.
    5. 표준 리튬 아세테이트 형질전환 프로토콜을 사용하여 이 균주로부터 적격 세포를 준비하고, 이를 PGAL1-M 또는 PGAL1-S 프로모터5의 광유전학적으로 하류에서 조절되는 유전자(들)를 함유하는 플라스미드로 형질전환시킨다.
      참고: δ-site(YARCdelta5)에 통합되고 Zeocin과 함께 셀렉트되는 플라스미드를 사용하면 안정적인 다중 복사 통합이 가능합니다7,16,17,18.
    6. 형질전환 후, 배양물을 1분 동안 150 x g 에서 원심분리하고, 200 μL의 신선한 SC-드롭아웃 배지에 부드럽게 재현탁시켰다.
      참고: PGAL1-M 프로모터는 Mig1p 억제 부위가 결실된 PGAL1 프로모터의 합성 버전이며, PGAL1-S는 추가적인 Gal4p 활성화제 결합 부위가 있는 PGAL1-M의 엔지니어링 버전입니다. 규칙적인 PGAL1 프로모터가 발현을 조절하는데 사용될 수 있고; 그러나, 발현 강도는 이들 조작된 프로모터로부터의 것보다 낮을 것이다.
    7. 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(YPD) 한천 플레이트 상에 전체 세포 부피를 플레이트 내로 통합시키거나, 선택 마커를 함유하는 플라스미드로 형질전환시키는 경우 δ-부위 또는 SC 드롭아웃 플레이트에 플레이트를 플레이트한다. 일정한 청색광 하에서 30°C에서 16시간 동안 인큐베이션하여 광유전학적으로 조절된 유전자를 억압된 상태로 유지한다.
      참고: 일부 균주의 경우, 콜로니는 일정한 조명이 아닌 청색광 펄스(예: 1 s on/79 s off, 5 s on/75 s off, 10 s on/70 s off 등)에서 인큐베이션될 때 더 빠르게 성장할 수 있으며, 필요한 경우 각 균주에 대해 실험적으로 결정되어야 한다.
    8. 465nm 광원을 사용하고 LED 패널을 플레이트 위에 ~ 40cm 올려 놓으면 광도가 ~ 80-110 μmol / m2 / s가됩니다. 양자 미터를 사용하여 강도를 측정 하십시오 (재료 표 참조).
    9. δ 사이트에 통합하는 경우, 400 μg/mL와 1,200 μg/mL 사이의 범위의 Zeocin 농도를 포함하는 YPD 플레이트에 플레이트의 복제본을 생성 하여 다양한 통합 카피 번호5,7,12,16,17,18을 선택하십시오. 복제 플레이트를 콜로니가 나타날 때까지 2-3일 동안 일정한 또는 펄스된 청색광 하에서 30°C에서 인큐베이션한다.
  2. 최고의 식민지에 대한 예비 심사
    1. 각 플레이트에서 여덟 개의 콜로니를 선택하고 이를 사용하여 2% 글루코스가 보충된 SC-His 배지 1mL를 24웰 플레이트의 개별 웰에 접종합니다. 세포를 일정한 청색광 조명 하에서 흔들리는 200 rpm (19 mm 궤도 직경)으로 30°C에서 밤새도록(16-20 h) 하에 24-웰 플레이트에서 성장시킨다.
    2. 다음날 아침, 각 배양물을 2% 글루코스에서 0.01-0.3 범위의 OD600 값까지 2% 글루코스로 신선한 SC-His 배지 1 mL에 희석하고, 2 내지 9 OD600 값 사이의 세포 밀도에 도달할 때까지 200 rpm 진탕하면서 30°C에서 일정한 또는 펄스 빛 하에서 24-웰 플레이트에서 성장시킨다(도 4A). 이 성장 단계에 필요한 시간은 균주에 따라 달라집니다.
    3. 플레이트를 30°C에서 4시간 동안 어둠 속에서 인큐베이션하고, 라이트 패널을 끄고 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 200 rpm으로 진탕시킨다.
      참고: 이 단계는 세포가 생산 배지에서 재현탁되기 전에 대사적으로 생산 단계로 전환할 수 있게 한다.
    4. 생산 단계를 시작하기 위해, 배양물을 234 x g 에서 24-웰 플레이트에서 5분 동안 원심분리하고, 세포를 2% 글루코스로 신선한 SC-드롭아웃 배지 1 mL에 재현탁시킨다. 멸균 마이크로플레이트 밀봉 테이프를 사용하여 원하는 제품의 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오.
    5. 밀봉된 플레이트를 200 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 48 h 동안 어둠 속에서 발효시킨다. 빛에 노출되지 않도록 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸 두십시오.
      참고 : 호일에 플레이트를 감싸는 것은 발효시 산소 또는 가스 가용성을 제한하지 않습니다. 그러나 멸균 밀봉 테이프는 가스 전달을 제한합니다. 필요한 경우 테이프에 작은 구멍을 뚫어 산소를 도입 할 수 있습니다.
  3. 수확 및 분석
    1. 발효물을 수확하기 위해, 플레이트를 234 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액 800 μL를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내로 옮긴다.
    2. 관심있는 화학 물질에 따라 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 가스 크로마토그래피 - 질량 분광법 (GC-MS) 또는 사용 된 장비에 가장 적합한 샘플 준비 기술을 사용하는 다른 분석 방법을 사용하여 분석하십시오.

2. 대장균 OptoLAC 시스템을 이용한 광조절 단백질 생산

  1. 스트레인 건설
    1. 전기적격 BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3을 OptoLAC1B 또는 OptoLAC2B 회로6를 포함하는 플라스미드 및 PT7 프로모터19로부터 관심있는 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드로 공동-변환한다.
    2. 형질전환 후, 세포를 이화석 압착 (SOC; 2% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 글루코스)으로 1 mL의 초최적 브로스에서 1시간 동안 회전시키거나 진탕하면서 37°C에서 회수하였다.
      참고: 관심있는 단백질을 함유하는 플라스미드는 OptoLAC 플라스미드 (즉, 상이한 저항 마커 및 복제 기원)와 양립가능해야 하며 lacI의 카피를 함유해서는 안 된다.
    3. 세포를 4845 x g 에서 3분 동안 원심분리하고, 펠렛을 200 μL의 리조제니 브로스(LB) 배지에 농축시켰다. 농축된 전체 세포를 적절한 항생제로 LB 한천 플레이트 상에 플레이트화하고, 일정한 청색광 하에서 하룻밤 동안 37°C에서 성장시켜 단백질 발현을 억제한다.
  2. 발현을 검증하기 위한 초기 스크리닝
    1. 세 개의 단일 콜로니를 취하여 24웰 플레이트의 개별 웰에 적절한 항생제로 LB 배지 1mL를 접종하는 데 사용합니다. 일정한 청색광 조명 하에서 200rpm으로 진탕하면서 37°C에서 밤새도록(16-20시간) 성장시킨다(그림 4A).
    2. 다음날, 1.5 μL의 배양물을 사용하여 미세 부피 측정이 가능한 분광 광도계에서 OD600 을 측정하였다. 배양물을 24-웰 플레이트 내의 신선한 LB 1 mL로 희석하여 0.01-0.1 범위의 OD600 값으로 한다.
    3. 배양물을 37°C에서 2-3 h 동안 청색광 하에서 200 rpm 진탕하면서 성장시킨다. 두 번째 시간부터 시작하여 배양물이 0.1-1.5의 OD600 범위를 과도하게 성장시키지 않도록 15분마다 OD600 측정을 수행합니다.
    4. 배양물이 원하는 OD600에 도달하면 라이트 패널을 끄고 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 생산 단계를 시작하십시오. 플레이트를 200 rpm 진탕으로 8 h (37 °C), 20 h (30 °C) 또는 48 h (18 °C) 동안 어둠 속에 보관하십시오.
    5. 각 배양물의 최종 OD600 값을 측정하고 기록한다.
  3. 수확 및 분석
    1. 각 배양물 800 μL를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 17,000 x g에서 5분 동안 원심분리한다.
    2. 세포 펠렛을 200 μL의 재현탁 완충액 (트리스 50 mM, pH 8.0, NaCl 300 mM)에 재현탁시켰다.
      참고: NaCl의 농도는 분석되는 재조합 단백질에 기초하여 조정될 수 있다.
    3. 50 μL의 6x 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 샘플 버퍼 (트리스 375 mM, pH 6.8, SDS 9%, 글리세롤 50%, 브로모페놀 블루 0.03%, DTT 9%)를 첨가한다. 100°C에서 10분 동안 인큐베이션하고 열믹서에서 700 rpm으로 진탕시킨다.
    4. 배양물을 12% SDS-PAGE 겔에 3∼20 μL씩 로딩한다. 최종 OD600 측정을 가이드로 사용하여 각 샘플에 대해 대략 동일한 양의 단백질을 로딩합니다 (최종 OD600 값 1에 해당하는 샘플의 10 μL에 해당). 전원 공급 장치를 사용하여 젤이 완전히 해결될 때까지 100V에서 전기영동을 실행합니다.
    5. Coomassie 브릴리언트 블루 G-250 용액으로 겔을 착색시키고 전자 레인지에서 30-40 초 동안 가열 한 다음 플랫폼 회전기에서 적어도 15 분 동안 인큐베이션하십시오.
    6. 탈이온수로 두 번 헹구고 플랫폼 회전기에서 적어도 30 분 (또는 하룻밤) 동안 얼룩을 닦고 매듭에 묶인 두 개의 세정 물티슈를 추가하여 얼룩을 흡수하십시오. 젤을 충분한 양의 물에 전자 레인지에서 15 분 동안 끓여서 탈지 과정을 가속화하십시오.

3. S. cerevisiae OptoAMP 시스템을 이용한 3상 발효

  1. 스트레인 건설
    1. his3 영양영양 마커를 갖는 균주를 수득하는데, 이 마커는 기존의 OptoAMP 플라스미드5를 사용하기 위해 필요하기 때문이다. S. cerevisiae에 원산지인 유전자의 광유전학적 조절을 추구하는 경우, 이 유전자의 내인성 사본이 결실되는 균주를 구축한다.
    2. EZ-L58012와 같은 OptoAMP4 회로를 포함하는 플라스미드를 선형화하고, 이를 표준 리튬-아세테이트 형질전환 방법을 사용하여 영양영양 균주의 his3 유전자좌에 통합시킨다15. EZ-L580을 사용하는 경우, 플라스미드를 PmeI 제한 부위에서 선형화한다.
    3. 형질전환 후, 세포를 1분 동안 150 x g 에서 원심분리하고, 200 μL의 신선한 SC-His 배지에 부드럽게 재현탁시킨다.
    4. 전체 세포 부피를 선택적 배지(SC-His-agar) 상에 플레이트하고, 콜로니가 나타날 때까지 2-3일 동안 30°C에서 인큐베이션한다.
    5. 이 균주로부터 유능한 세포를 준비하고, PGAL1-S 프로모터12의 광유전학적으로 조절될 유전자(들)를 함유하는 플라스미드로 형질전환시킨다.
      참고: δ 사이트에서 통합되고 Zeocin과 함께 선택하는 플라스미드를 사용하면 안정적인 다중 복사 통합 및 선택이 가능합니다.
    6. 형질전환 후, 배양물을 1분 동안 150 x g 에서 원심분리하고, 200 μL의 신선한 SC-드롭아웃 배지에 부드럽게 재현탁시켰다.
      참고: PGAL1-S 프로모터는 Mig1p 억제 부위가 삭제되고 추가 Gal4p 활성화제 결합 부위가 첨가되는 PGAL1 프로모터의 합성 버전입니다. 규칙적인 PGAL1 프로모터가 사용될 수 있고; 그러나, 발현 강도는 이러한 조작된 프로모터보다 낮을 것이다.
    7. 전체 세포 부피를 YPD 또는 SC 드롭아웃 한천 플레이트 상에 플레이트하고, 어둠 속에서 16시간 동안 30°C에서 인큐베이션한다(알루미늄 호일에 싸여). 어둠 속에서 배양하면 광유전학적으로 조절된 유전자가 억제되어 세포가 대사 자원을 화학적 생산보다는 세포 성장으로 향하게 할 수 있습니다.
    8. δ-사이트 내로 통합되는 경우, 제오신 농도의 범위를 함유하는 YPD 플레이트 상에 복제 플레이트를 사용하여 다양한 통합 카피 번호를 선택한다. 플레이트를 콜로니가 나타날 때까지 2-3일 동안 어둠 속에서(알루미늄 호일로 감싸짐) 30°C에서 인큐베이션한다.
  2. 최고의 식민지에 대한 예비 심사
    1. 각 플레이트에서 여덟 개의 콜로니를 선택하고 이를 사용하여 24웰 플레이트의 개별 웰에 2% 글루코오스가 있는 SC-His 배지 1mL를 접종합니다. 세포를 200 rpm 진탕으로 30°C에서 밤새도록(16-20 h) 암흑에서 성장시킨다.
    2. 다음날 아침, 각 배양물을 2% 글루코스로 신선한 SC-His 배지 1 mL에 희석하여 0.1 OD600으로 희석하고, 30°C에서 암흑에서 성장시키고 300 rpm으로 진탕하여 30°C에서 3의 OD600에 도달할 때까지 진탕한다. 빛에 노출되지 않도록 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸십시오. 이 성장 단계에 필요한 시간은 균주에 따라 달라집니다.
    3. 유도 단계를 시작하기 위해, 플레이트를 펄스 광(예를 들어, 5 s on/95 s off) 하에서 200 rpm 진탕으로 30°C에서 12 h 동안 인큐베이션한다. 465nm 광원을 사용하고 최적의 결과를 위해 LED 패널을 플레이트 위에 올려 놓으면 광도가 ~ 80-110 μmol/m2/s가 되도록 합니다(그림 4A).
      참고: 이 인큐베이션을 위한 최적의 광 펄스 지속 시간은 생성되는 화학 물질에 따라 달라질 수 있습니다. 0.1%(예: 999초 꺼짐에서 1초)에서 100%(전체 조명)까지의 조명 스케줄 범위를 선별하는 것이 좋습니다.
    4. 생산 단계를 시작하기 위해, 배양물을 234 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 2% 글루코스로 신선한 SC-His 배지에 재현탁시킨다. 멸균 마이크로플레이트 밀봉 테이프를 사용하여 원하는 제품의 증발을 방지하기 위해 플레이트를 밀봉하십시오.
    5. 밀봉된 플레이트를 200 rpm에서 진탕하면서 30°C에서 48시간 동안 빛으로 발효시킨다. 일부 화학 물질은 전체 조명이 아닌 펄스 생산 단계의 이점을 누릴 수 있으므로 이 단계에서 조명 일정을 최적화하십시오.
  3. 수확 및 분석
    1. 플레이트를 234 x g 에서 5분 동안 원심분리하고, 상층액 800 μL를 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브 내로 옮겨 발효물을 수확한다.
    2. 관심있는 화학 물질에 따라 HPLC, GC-MS 또는 사용 된 장비에 가장 적합한 샘플 준비 기술을 사용하는 다른 분석 방법을 사용하여 분석하십시오.

4. 광조절된 생물반응기에서 대장균으로부터의 화학(메발로네이트) 생산

  1. 초기 접종 및 생물반응기 설정
    1. 광조절된 화학 생산으로 조작된 대장균 균주의 콜로니를 0.2% w/v 카사미노산, 5% w/v 글루코스 및 미량 금속 혼합물20(0.0084 g/L EDTA, 0.0084 g/L EDTA, 0.855 mM NaCl, 0.855 mM NaCl, 0.855 mM NaCl, 0.955 mM NaCl, 0.0025 g/L CoCl2, 0.015 g/L MnCl2, 0.0015 g/L CuCl2, 0.003 g/L H3BO3, 0.0025 g/L Na2MoO4, 0.008 g/L ZnCl2, 0.06 g/L Fe(III) 시트레이트, 0.0045 g/L 티아민, 1.3 g/L MgSO4) 50 mL 원뿔형 튜브.
    2. 배양물을 청색광 조명 하에서 200 rpm 진탕하면서 30°C에서 하룻밤 동안 성장시켰다.
    3. 생물 반응기 용기 헤드 플레이트를 설치하고 다음 포트가 설치되어 있는지 확인하십시오 : 열 프로브 용 삽입; 용존 산소 (DO) 프로브; 가스 스파거 - 0.2 μm 필터를 통해 공기 공급원에 연결; 임펠러; 가스 응축기 - 0.2 μm 필터에 연결; 냉각 라인 (x2); 공급 라인 (x2) - 하나는 배지 첨가용, 하나는 pH 조절용; 샘플링 라인 - 선박의 바닥에 도달했는지 확인하십시오. 빈 포트; pH 프로브 - 설치 전에 pH = 4 및 pH = 7의 표준으로 프로브를 교정하고 용기의 나머지 부분과 함께 오토클레이브하거나 95 % 에탄올로 살균하고 설치 전에 무균 적으로 삽입하십시오.
    4. 용기에 여과 된 물 1L를 채우고 헤드 플레이트를 부착하고 조여서 O 링이 꼭 맞고 밀봉되는지 확인하십시오.
    5. 반응기의 모든 개구부를 알루미늄 호일로 덮으십시오.
    6. 세 개의 튜브 스트립을 준비하십시오 : 하나는 물을 제거하기위한 것이고, 다른 하나는 사료를 삽입하기위한 것이고, 다른 하나는 pH 조절을위한 것입니다. 알루미늄 호일로 끝을 덮고 알루미늄 호일로 모든 튜브를 감쌉니다.
      참고: pH 조정에 사용되는 NH4OH는 실리콘 튜브에서 원활하게 흐르지 않아 부정확한 유량과 배양물의 과도한 저조를 초래할 수 있습니다. 이 문제를 방지하려면 NH4OH 공급용 생체 적합성 펌프 튜브(BPT)를 사용하십시오.
    7. 생물반응기 및 튜빙을 오토클레이브하고, 30분 액체 사이클을 사용한다.
    8. 오토클레이브에서 재료를 제거하십시오. 처리하기에 충분히 차가워지면 임펠러, pH 및 DO 프로브, 공기 소스, 응축기 입구 및 출구, 냉각 입구 및 출구를 제어 스테이션에 연결하십시오.
    9. 열 프로브를 삽입하고 가열 재킷으로 용기를 덮으십시오. 재킷을 용기 상단으로 고정하여 배양물이 빛에 노출되는 것을 막지 않도록 하십시오.
    10. 멸균 튜브 중 하나를 샘플링 라인에 연결하고 샘플링 펌프를 통해 고정하십시오. 다른 쪽 끝이 적어도 1 L. 용기 내부의 물을 배출 할 수있는 빈 용기로 흘러 들어가도록 두십시오.
    11. 다른 멸균 튜브를 공급 라인 중 하나에 연결하고 공급 펌프 중 하나를 통해 고정하십시오. 튜브의 다른 쪽 끝을 M9 미디어 병에 연결하십시오. 반응기에 매체를 공급하십시오.
    12. 다른 멸균 튜브를 공급 라인 중 하나에 연결하고 공급 펌프 중 하나를 통해 고정하십시오. 튜브의 다른 쪽 끝을 28 % -30 % NH4OH가 들어있는 병에 연결하십시오.
      주의: NH4OH는 부식성이 있습니다. 사료 병으로 옮기는 동안 흄 후드에서 작업하고 사료 병이 보조 격리실에 놓여 있는지 확인하십시오.
    13. 세 개의 조명 패널을 반응기에서 ~20cm 떨어진 삼각형 구조물에 놓고 용기 표면의 광 강도가 양쪽에서 ~80-110μmol/m2/s에 도달하는지 확인합니다(그림 4B).
    14. 다음날 생물 반응기 시스템과 냉각기를 켭니다. 반응기 온도 설정점을 37°C로, pH 설정점을 7.0으로 설정하고, 교반을 200 rpm으로 설정한다. 가열 재킷이 켜져야합니다.
    15. 먼저 온도 및 DO 측정이 일정해질 때까지 기다렸다가 DO 프로브를 보정합니다(이는 100% 설정점이 됨). 그런 다음 시스템에서 프로브를 분리합니다(0% 설정점). 프로브가 연결될 때 DO 측정이 100%에서 안정화될 때까지 반복한 다음 DO 설정점을 20%로 설정합니다.
  2. 빛으로 제어되는 화학 생산
    1. 생물반응기를 0.001-0.1의 초기 OD600 에 접종한다. 조명 패널을 켜서 성장을 시작하십시오.
    2. 3시간 후, 유도의 최적 세포 밀도(ρs)가 과도하게 자라지 않도록 OD600 측정을 취하기 위해 샘플링 라인에서 샘플을 채취하기 시작한다. 최적의 ρs에 도달하면 (메발로네이트 생산을위한 최적 값은 0.17입니다), 라이트 패널을 끄고 반응기를 알루미늄 호일로 덮은 다음 검은 천으로 셋업을 감싸서 어두운 생산 단계를 시작하십시오.
    3. 50 μL의 소포제를 어둠으로 전환 한 후 8 시간 동안 첨가하십시오. 빈 포트의 나사를 풀고 소포제를 반응기에 직접 피펫하십시오.
    4. 샘플링 포트를 사용하여 HPLC 또는 GC 분석을 위해 주기적으로 샘플을 채취하십시오.
  3. 분해 및 분석
    1. 실험이 끝나면 시스템을 끕니다. DO 및 pH 프로브의 나사를 조심스럽게 풀고 비누와 물로 씻으십시오. 헤드 플레이트의 나사를 풀고 브러시를 사용하여 비누와 물로 씻으십시오.
    2. 배양물을 빈 용기에 옮기고 표백제를 10 % v / v의 최종 농도로 첨가하십시오. 흄 후드에 넣고 30 분 후에 폐기하십시오.
    3. 브러시를 사용하여 비누가 물과 물로 반응기 용기를 씻으십시오.
    4. 관심있는 제품을 기반으로 분석을 위해 샘플을 준비하십시오. 메발로네이트 생산을 위해, 560 μL의 배양물을 140 μL의 0.5 M HCl과 혼합하고 1분 동안 고속으로 와류시킨다. 이것은 mevalonate를 (±) - mevalonolactone으로 변환합니다.
      주의: HCl은 건강에 해롭다. 적절한 PPE로 취급하고 볼텍스 전에 샘플 튜브가 제대로 뚜껑을 덮었는지 확인하십시오.
    5. 4°C에서 45분 동안 17,000 x g 에서 원심분리한다. 250 μL의 상청액을 HPLC 바이알로 옮긴다.
    6. 메발로네이트의 경우, 유기산 이온 교환 컬럼을 사용하여 샘플을 분석한다. 굴절률 검출기 (RID)를 사용하여 생산을 정량화하여 피크 면적을 (±)-메발로놀락톤의 표준과 비교합니다.

결과

미생물 대사의 광유전학적 조절은 바이오 연료, 벌크 화학물질, 단백질 및 천연물을 포함한 다양한 제품을 생산하기 위해 성공적으로 구현되었습니다5,6,7,12,13. 이러한 과정의 대부분은 세포 성장이 빛에서 일어나도록 설계되어 있으며(낮은 세포 밀도가 빛 침투로 최소한의...

토론

동적 조절은 대사 공학 및 재조합 단백질 생산을 위한 수율을 향상시키기 위해 오랫동안 적용되어 왔다4. 효소 발현의 이동은 가장 일반적으로 IPTG21, 갈락토오스22 및 테트라사이클린23과 같은 화학 유도제를 사용하여 구현되지만 온도 및 pH와 같은 공정 조건을 사용하여 매개되었습니다. 유전자 발현의 광유전학적 조절은 발?...

공개

저자는이 기사에서 설명 된 광유전학 회로 및 방법에 대한 여러 특허를 신청했습니다.

감사의 말

이 연구는 미국 에너지부, 과학 사무소, 생물 및 환경 연구 사무소 상 번호 DE-SC0019363, NSF CAREER Award CBET-1751840, 퓨 자선 신탁 및 카밀 드레퓌스 교사 - 학자 상이 지원했습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plateUSA ScientificCC7672-7524
Agar powderThermo Fisher Scientific303991049
Aluminum foilReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvetteEppendorf6135000923
Blue LED panelHQRP884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 PlasmidN/AN/ASee Reference 1
GlucoseThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
Microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5510
Orbital ShakerYamato Scientific AmericaSOU-300
Petri dishCelltreat229656
PmeINew England BiolabsR0560L
Quantum meterApogee InstrumentsMQ-510
Replica-plating deviceThomas ScientificF37848-0000
Replica-plating padsSunrise Science Products3005-012
SC-His powderSunrise Science Products1303-030
SC Complete powderSunrise Science Products1459-100
Sterile sealing filmExcel ScientificSTR-SEAL-PLT
YPD agar platesVWR100217-054
ZeocinThermo Fisher ScientificR25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample BufferCepham Life Sciences10502
12% Acrylamide protein gelsThermo Fisher ScientificNP0341BOX
24-well culture plateUSA ScientificCC7672-7524
Aluminum foilReynoldsB004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvetteEppendorf6135000923
Blue LED panelHQRP884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250Thermo Fisher Scientific20279
Electrophoresis cellBio-Rad1658004
Electrophoresis power supplyBio-Rad1645050
LB broth (Miller)Fisher ScientificBP97235
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
Microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5510
NaClThomas ScientificSX0425-1
OptoLAC plasmidsN/AN/ASee Reference 2
Orbital ShakerYamato Scientific AmericaSOU-300
Petri dishCelltreat229656
Quantum meterApogee InstrumentsMQ-510
SOC mediumThermo Fisher Scientific15544034
ThermomixerEppendorf5382000015
Tris baseFisher ScientificBP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 PlasmidN/AN/ASee Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foilReynoldsB004NG90YO
AntifoamSigma-AldrichA8311
Bioreactor with control stationEppendorfB120110001
BioSpectrometer with μcuvetteEppendorf6135000923
BleachVWR Scientific89501-620 (CS)
Blue LED panelHQRP884667106091218
BPT tubingFisher Scientific14-170-15
GlucoseThermo Fisher Scientific501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl)Fisher Scientific7647-01-0
M9 Minimal SaltsThermo Fisher ScientificA1374401
MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002403
Microcentrifuge tubesUSA Scientific1615-5510
NH4OH SolutionSigma-AldrichI0503-1VL
Orbital ShakerYamato Scientific AmericaSOU-300
Quantum meterApogee InstrumentsMQ-510
SC Complete powderSunrise Science Products1459-100

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