Fermentazioni a controllo leggero per la produzione chimica microbica e proteica

Riepilogo

Il controllo optogenetico del metabolismo microbico offre un controllo dinamico flessibile sui processi di fermentazione. Il protocollo qui mostra come impostare fermentazioni regolate dalla luce blu per la produzione chimica e proteica a diverse scale volumetriche.

Abstract

Le fabbriche di cellule microbiche offrono un'alternativa sostenibile per la produzione di sostanze chimiche e proteine ricombinanti da materie prime rinnovabili. Tuttavia, sovraccaricare un microrganismo con modificazioni genetiche può ridurre la forma fisica e la produttività dell'ospite. Questo problema può essere superato utilizzando il controllo dinamico: espressione inducibile di enzimi e percorsi, in genere utilizzando additivi chimici o nutrizionali, per bilanciare la crescita e la produzione cellulare. L'optogenetica offre un metodo non invasivo, altamente sintonizzabile e reversibile per regolare dinamicamente l'espressione genica. Qui, descriviamo come impostare fermentazioni controllate dalla luce di Escherichia coli ingegnerizzato e Saccharomyces cerevisiae per la produzione di sostanze chimiche o proteine ricombinanti. Discutiamo di come applicare la luce in momenti e dosaggi selezionati per disaccoppiare la crescita e la produzione microbica per migliorare il controllo e la produttività della fermentazione, nonché le considerazioni chiave di ottimizzazione per i migliori risultati. Inoltre, descriviamo come implementare i controlli della luce per esperimenti di bioreattori su scala di laboratorio. Questi protocolli facilitano l'adozione di controlli optogenetici in microrganismi ingegnerizzati per migliorare le prestazioni di fermentazione.

Introduzione

L'optogenetica, il controllo dei processi biologici con proteine sensibili alla luce, offre una nuova strategia per controllare dinamicamente le fermentazioni microbiche per la produzione chimica e ^proteica1,2. L'onere delle vie metaboliche ingegnerizzate e la tossicità di alcuni intermedi e prodotti spesso compromettono la crescita ^cellulare3. Tali sollecitazioni possono portare a uno scarso accumulo di biomassa e a una ridotta ^{produttività3}. Questa sfida può essere affrontata dividendo temporalmente le fermentazioni in una fase di crescita e produzione, che dedicano risorse metaboliche rispettivamente all'accumulo di biomassa o alla sintesi del ^prodotto4. Recentemente abbiamo dimostrato che il passaggio dalla crescita alla produzione in questa fermentazione bifase può essere indotto con cambiamenti nelle condizioni di illuminazione5,6,7. L'elevata sintonizzazione, reversibilità e ortogonalità degli ingressi ^luminosi8 offre vantaggi unici alle fermentazioni controllate dalla luce che sono difficili o impossibili da replicare con induttori chimici utilizzati nel controllo dinamico delle fermentazioni bifase convenzionali4,9,10,11.

La proteina EL222 sensibile alla luce blu derivata da Erythrobacter litoralis è stata utilizzata per sviluppare diversi circuiti optogenetici per l'ingegneria metabolica in Saccharomyces cerevisiae5,7,12,13. EL222 contiene un dominio LOV (Light-Oxygen-Voltage Sensor) che subisce uno spostamento conformazionale all'attivazione della luce blu (465 nm), che gli consente di legarsi alla sua sequenza di DNA affine (C120)¹³. La fusione di EL222 con il dominio di attivazione virale VP16 (VP16-EL222) si traduce in un fattore di trascrizione sensibile alla luce blu che può attivare in modo reversibile l'espressione genica in S. cerevisiae7 e altri ^organismi14 dal promotore sintetico _PC120. Diversi circuiti basati su EL222 sono stati sviluppati e utilizzati per la produzione chimica in S. cerevisiae, come il sistema optoEXP di base attivato dalla ^luce7, in cui il gene di interesse è espresso direttamente da _PC120 (Figura 1A). Tuttavia, le preoccupazioni di penetrazione della luce alle alte densità cellulari tipicamente incontrate nella fase di produzione delle fermentazioni ci hanno motivato a sviluppare circuiti invertiti indotti al buio, come i circuiti OptoINVRT e OptoQ-INVRT (Figura 1B)^5,7,13. Questi sistemi sfruttano i regolaloni di galattosio (GAL) o acido chinico (Q) di S. cerevisiae e N. crassa, rispettivamente, controllando i loro corrispondenti repressori (GAL80 e QS) con VP16-EL222, per reprimere l'espressione genica alla luce e indurla fortemente al buio. La combinazione dei circuiti OptoEXP e OptoINVRT si traduce in un controllo bidirezionale dell'espressione genica, consentendo fermentazioni bifase in cui la fase di crescita è indotta con luce blu e la fase di produzione con oscurità (Figura 2A)^5,7.

L'uso della luce al posto dell'oscurità per indurre l'espressione genica durante la fase di produzione espanderebbe notevolmente le capacità dei controlli optogenetici, ma richiederebbe anche il superamento dei limiti di penetrazione della luce delle alte densità cellulari tipicamente incontrate in questa fase di fermentazione. A tal fine, abbiamo sviluppato circuiti, noti come OptoAMP e OptoQ-AMP, che amplificano la risposta trascrizionale alla stimolazione della luce blu. Questi circuiti utilizzano mutanti wild-type o ipersensibili di VP16-EL222 per controllare la produzione degli attivatori trascrizionali Gal4p o QF2 dei reguloni GAL o Q, rispettivamente, ottenendo una maggiore sensibilità e una maggiore espressione genica con la ^luce12,13 (Figura 1C). I circuiti OptoAMP possono ottenere un'induzione luminosa completa e omogenea in bioreattori da 5 L a densità ottica (misurata a 600 nm; _OD600) valori di almeno 40 con solo ~0,35% di illuminazione (5% di dose di luce solo su ~7% della superficie di massa). Ciò dimostra un grado di sensibilità più elevato rispetto a OptoEXP, che richiede un'illuminazione vicina al 100%¹². La capacità di indurre efficacemente l'espressione genica con la luce ad alte densità cellulari apre nuove opportunità per il controllo dinamico delle fermentazioni. Ciò include fermentazioni operative in più di due fasi temporali, come le fermentazioni trifase, in cui le fasi di crescita, induzione e produzione sono stabilite con programmi leggeri unici per ottimizzare la produzione chimica (Figura 2B)¹².

Figura 1: Circuiti optogenetici per il controllo dinamico di S. cerevisiae. I circuiti OptoEXP, OptoINVRT e OptoAMP si basano sul sistema VP16-EL222 sensibile alla luce. (A) Nel circuito OptoEXP, l'esposizione alla luce blu provoca un cambiamento conformazionale e la dimerizzazione di VP16-EL222, che espone un dominio legante il DNA e consente la trascrizione da _PC120. La figura è stata modificata da Zhao et ^al.7. (B) I circuiti OptoINVRT sfruttano i regolagni GAL (mostrati) o Q per indurre l'espressione al buio. Nei circuiti basati su GAL, VP16-EL222 e GAL4 sono espressi costitutivamente, mentre _PC120 guida l'espressione del repressore GAL80 (nei circuiti basati su Q, GAL4 e GAL80 sono sostituiti rispettivamente da QF2 e QS e viene utilizzato un promotore sintetico contenente QUAS al posto di un promotore GAL). Alla luce, Gal80p impedisce l'attivazione del gene di interesse da _PGAL1. Al buio, GAL80 non è espresso e rapidamente degradato fondendolo in un dominio costitutivo di degron (piccolo dominio marrone), che consente l'attivazione di _PGAL1 da parte di Gal4p. La figura è stata modificata da Zhao et ^al.5. (C) I circuiti OptoAMP utilizzano anche VP16-EL222 per controllare i reguloni GAL (mostrato) o Q. In questi circuiti, il repressore GAL80 (o QS) è costitutivamente espresso e fuso in un degron fotosensibile (piccolo dominio blu) che garantisce una stretta repressione al buio. _PC120 e un'espressione di controllo mutante ipersensibile VP16-EL222 di GAL4 (o QF2) con la luce, che attiva fortemente _PGAL1 (o un promotore contenente QUAS) nella luce. I circuiti derivati da GAL possono utilizzare forme ingegnerizzate di _PGAL1, come _PGAL1-M o _PGAL1-S, che hanno aumentato l'attività, così come promotori wild-type controllati dal regulon GAL (_PGAL1, _PGAL10, _PGAL2, _PGAL7). La figura è stata modificata da Zhao et ^al.12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Fermentazioni a due e tre fasi nel tempo. (A) Le fermentazioni bifase operate con circuiti invertiti consistono in una fase di crescita guidata dalla luce e una fase di produzione scura. Nella fase di crescita, la biomassa si accumula mentre il percorso di produzione rimane represso. Al raggiungimento _dell'OD600 desiderato, le cellule vengono spostate al buio per regolarsi metabolicamente prima di essere risospese in mezzi freschi per la fase di produzione. (B) In un processo in tre fasi, le fasi di crescita, incubazione e produzione sono definite da programmi di luce unici, che possono consistere in un periodo di crescita scuro, incubazione pulsata e fase di produzione completamente illuminata. Figura creata con Biorender. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sono stati inoltre sviluppati circuiti optogenetici per il controllo dinamico della produzione chimica e proteica in E. coli. I circuiti OptoLAC controllano il repressore batterico LacI utilizzando il circuito pDawn sensibile alla luce, basato sul sistema bicomponente YF1/^FixJ6 (Figura 3). Simile a OptoINVRT5, i circuiti OptoLAC sono progettati per reprimere l'espressione genica nella luce e indurla al buio. I livelli di espressione che utilizzano circuiti OptoLAC possono eguagliare o superare quelli raggiunti con l'induzione standard isopropil β-d-1-tiogalattopoliranoside (IPTG), mantenendo così la forza dell'induzione chimica offrendo al contempo una maggiore sintonizzazione e reversibilità6. Pertanto, i circuiti OptoLAC consentono un efficace controllo optogenetico per l'ingegneria metabolica in E. coli.

Figura 3: Circuiti OptoLAC per il controllo dinamico di E. coli. I circuiti OptoLAC adattano il sistema pDawn e l'operone lac per ottenere l'attivazione al buio e la repressione alla luce. Al buio, YF1 fosforila FixJ, che quindi attiva il promotore _PFixK2 per esprimere il repressore cI . Il repressore cI impedisce l'espressione del repressore lacI dal promotore _PR , che consente la trascrizione del gene di interesse da un promotore contenente lacO. Al contrario, la luce blu riduce l'attività della chinasi netta YF1, invertendo la fosforilazione di FixJ e quindi l'espressione di cI , che dereprime l'espressione di lacI e impedisce l'espressione dal promotore contenente lacO. La figura è stata modificata da Lalwani et ^al.6. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Descriviamo qui i protocolli di base per le fermentazioni controllate dalla luce di S. cerevisiae ed E. coli per la produzione chimica o proteica. Sia per i lieviti che per i batteri, ci concentriamo innanzitutto sulle fermentazioni con una fase di crescita guidata dalla luce e una fase di produzione indotta dall'oscurità abilitata dai circuiti OptoINVRT e OptoLAC. Successivamente, descriviamo un protocollo per una fermentazione a tre fasi (crescita, induzione, produzione) controllata dalla luce abilitata dai circuiti OptoAMP. Inoltre, descriviamo come aumentare le fermentazioni optogeneticamente controllate dalle micropiastre ai bioreattori su scala di laboratorio. Con questo protocollo, miriamo a fornire una guida completa e facilmente riproducibile per eseguire fermentazioni controllate dalla luce per la produzione chimica o proteica.

Protocollo

1. Produzione chimica controllata dalla luce utilizzando il circuito S. cerevisiae OptoINVRT7

1. Costruzione della deformazione
   1. Ottenere un ceppo con l'auxotrofia his3 , poiché questo marcatore è necessario per la maggior parte dei plasmidi OptoINVRT ^esistenti5. Se cerchi la regolazione optogenetica di un gene nativo di S. cerevisiae, costruisci un ceppo in cui qualsiasi copia endogena del gene viene eliminata.
   2. Linearizzare il plasmide contenente il circuito OptoINVRT7, come EZ-L4395, e integrarlo nell'his3-locus del ceppo auxotrofico utilizzando metodi standard di trasformazione litio-acetato15. Se si utilizza il plasmide EZ-L439, che contiene i componenti per reprimere _PGAL1 alla luce e attivarlo al buio, linearizzare nel sito di restrizione PmeI.
   3. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule a 150 x g per 1 minuto e risospese delicatamente in 200 μL di mezzo sintetico completo (SC-His) istidina-dropout fresco.
   4. Placcare l'intero volume cellulare su piastre di agar SC-His e incubare a 30 °C per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
   5. Preparare cellule competenti da questo ceppo utilizzando protocolli standard di trasformazione dell'acetato di litio e trasformarle con un plasmide contenente il gene o i geni da controllare optogeneticamente a valle del promotore _PGAL1-M o _PGAL1-S5.
      NOTA: L'utilizzo di un plasmide che si integra in siti δ (YARCdelta5) e seleziona con Zeocin consente un'integrazione multicopia stabile7,16,17,18.
   6. Dopo la trasformazione, centrifugare la coltura a 150 x g per 1 minuto e risospesare delicatamente in 200 μL di terreno fresco SC-dropout.
      NOTA: Il promotore _PGAL1-M è una versione sintetica del promotore _PGAL1 con i siti di repressione Mig1p eliminati, mentre _PGAL1-S è una versione ingegnerizzata di _PGAL1-M, che ha siti di legame dell'attivatore Gal4p extra. Il promotore _PGAL1 regolare può essere utilizzato per controllare l'espressione; tuttavia, la forza di espressione sarà inferiore a quella di questi promotori ingegnerizzati.
   7. Placcare l'intero volume cellulare su una piastra di agar di peptone destrosio (YPD) estratto di lievito se si integra in siti δ o una piastra SC-dropout se si trasforma con un plasmide contenente un marcatore di selezione. Incubare a 30 °C per 16 ore sotto luce blu costante per mantenere represso il gene optogeneticamente controllato.
      NOTA: per alcuni ceppi, le colonie potrebbero crescere più velocemente se incubate in impulsi di luce blu (ad esempio, 1 s on/79 s off, 5 s on/75 s off, 10 s on/70 s off, ecc.) piuttosto che in illuminazione costante, che deve essere determinata sperimentalmente per ogni ceppo, se necessario.
   8. Utilizzare qualsiasi sorgente luminosa a 465 nm e posizionare un pannello LED ~ 40 cm sopra la piastra in modo tale che l'intensità della luce sia ~ 80-110 μmol / ^m2 / s. Misurare l'intensità utilizzando un misuratore quantistico (vedi Tabella dei materiali).
   9. Se si esegue l'integrazione in siti δ, creare una replica della piastra su piastre YPD contenenti un intervallo di concentrazioni di Zeocin tra 400 μg/mL e 1.200 μg/mL da selezionare per una varietà di numeri di copia di integrazione5,7,12,16,17,18. Incubare le piastre replica a 30 °C sotto luce blu costante o pulsata per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
2. Screening preliminare per le migliori colonie
   1. Selezionare otto colonie da ogni piastra e usarle per inoculare 1 mL di SC-Il suo mezzo integrato con il 2% di glucosio nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Crescere in piastre a 24 pozzetti sotto le celle durante la notte (16-20 h) a 30 °C con 200 rpm (diametro orbitale 19 mm) che scuotono sotto un'illuminazione a luce blu costante.
   2. La mattina successiva, diluire ogni coltura in 1 mL di un mezzo SC-His fresco con il 2% di glucosio a valori di _OD600 che vanno da 0,01-0,3 e crescere in piastre a 24 pozzetti sotto luce costante o pulsata a 30 °C con 200 rpm scuotendo fino a raggiungere densità cellulari comprese tra 2 e 9 valori di _OD600 (Figura 4A). La quantità di tempo necessaria per questa fase di crescita dipenderà dalla tensione.
   3. Incubare le piastre al buio per 4 ore a 30 °C con 200 giri/min scuotendo il pannello luminoso e avvolgendo le piastre in un foglio di alluminio.
      NOTA: Questo passaggio consente alle cellule di passare metabolicamente alla fase di produzione prima della risospensione nei mezzi di produzione.
   4. Per iniziare la fase di produzione, centrifugare le colture nella piastra a 24 pozzetti a 234 x g per 5 minuti e risospese le cellule in 1 mL di terreno fresco SC-dropout con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante micropiastra sterile.
   5. Fermentare le piastre sigillate al buio per 48 ore a 30 °C con agitazione a 200 giri/min. Assicurarsi che le piastre siano avvolte in un foglio di alluminio per evitare qualsiasi esposizione alla luce.
      NOTA: Avvolgere le piastre in un foglio non limita la disponibilità di ossigeno o gas nelle fermentazioni; tuttavia, il nastro sigillante sterile limita il trasferimento di gas. Piccoli fori possono essere infilati nel nastro per introdurre ossigeno, se necessario.
3. Raccolta e analisi
   1. Per raccogliere le fermentazioni, centrifugare le piastre per 5 minuti a 234 x g e trasferire 800 μL del surnatante in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
   2. A seconda della sostanza chimica di interesse, analizzare utilizzando cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC), gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) o un altro metodo analitico utilizzando la tecnica di preparazione del campione più adatta allo strumento utilizzato.

2. Produzione di proteine controllate dalla luce utilizzando il sistema E. coli OptoLAC

1. Costruzione della deformazione
   1. Co-trasformare l'elettrocompetente BL21 DE3 ΔlacI ΔlacI-DE3 con un plasmide contenente il circuito OptoLAC1B o OptoLAC2B6 e un plasmide che esprime la proteina ricombinante di interesse dal promotore _PT719.
   2. Dopo la trasformazione, recuperare le cellule per 1 ora in 1 mL di brodo super ottimale con repressione della catabolite (SOC; 2% triptone, 0,5% estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM _MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glucosio) a 37 °C con rotazione o agitazione.
      NOTA: Il plasmide contenente la proteina di interesse deve essere compatibile con il plasmide OptoLAC (cioè diverso marcatore di resistenza e origine di replicazione) e non deve contenere una copia di lacI.
   3. Centrifugare le celle a 4845 x g per 3 min e concentrare il pellet in 200 μL di brodo di lisogenia (LB). Placcare le intere cellule concentrate su una piastra di agar LB con antibiotici appropriati e crescere a 37 ° C durante la notte sotto una luce blu costante per mantenere repressa l'espressione proteica.
2. Screening iniziale per verificare l'espressione
   1. Prendere tre colonie singole e usarle per inoculare 1 mL di lb media con antibiotici appropriati in singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Crescere durante la notte (16-20 h) a 37 °C con 200 giri/min che scuotono sotto illuminazione a luce blu costante (Figura 4A).
   2. Il giorno successivo, utilizzare 1,5 μL di coltura per misurare _OD600 in uno spettrofotometro con una misurazione del microvolume. Diluire le colture in 1 mL di LB fresco in piastre a 24 pozzetti a valori di _OD600 compresi tra 0,01 e 0,1.
   3. Coltivare le colture a 37 °C con 200 giri/min scuotendo sotto la luce blu per 2-3 ore. A partire dalla seconda ora, effettuare misurazioni _OD600 ogni 15 minuti per garantire che le colture non superino l'intervallo _OD600 di 0,1-1,5.
   4. Una volta che le colture sono _all'OD600 desiderato, spegnere il pannello luminoso e avvolgere la piastra in un foglio di alluminio per avviare la fase di produzione. Tenere la piastra al buio per 8 ore (37 °C), 20 ore (30 °C) o 48 ore (18 °C), con 200 giri/min di agitazione.
   5. Misurare e registrare il valore _OD600 finale di ogni lingua.
3. Raccolta e analisi
   1. Trasferire 800 μL di ogni coltura in un tubo microcentrifuga da 1,5 mL e centrifuga per 5 minuti a 17.000 x g.
   2. Risospesso il pellet cellulare in 200 μL di tampone di risospensione (Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM).
      NOTA: La concentrazione di NaCl può essere regolata in base alla proteina ricombinante analizzata.
   3. Aggiungere 50 μL di tampone campione 6x sodio dodecil solfato (SDS) (Tris 375 mM, pH 6,8, SDS 9%, glicerolo 50%, blu bromofenolo 0,03%, DTT 9%). Incubare a 100 °C per 10 minuti con agitazione a 700 giri/min in un bimby.
   4. Caricare ~3-20 μL della coltura in un gel SDS-PAGE al 12%. Utilizzando la misurazione finale _OD600 come guida, caricare approssimativamente la stessa quantità di proteine per ciascun campione (equivalente a 10 μL del campione corrispondente a un valore _OD600 finale di 1). Utilizzare un alimentatore per eseguire l'elettroforesi a 100 V fino a quando il gel non è completamente risolto.
   5. Macchiare il gel con la soluzione blu brillante di Coomassie G-250 riscaldando per 30-40 s in un forno a microonde e quindi incubando su un rotatore a piattaforma per almeno 15 minuti.
   6. Risciacquare con acqua deionizzata due volte e detonare su un rotatore a piattaforma per almeno 30 minuti (o durante la notte), aggiungendo due salviette detergenti legate in un nodo per aiutare ad assorbire la macchia. Far bollire il gel in quantità sufficiente di acqua nel forno a microonde per 15 minuti per accelerare il processo di detaining.

3. Fermentazione trifase con il sistema S. cerevisiae OptoAMP

1. Costruzione della deformazione
   1. Ottenere un ceppo con un marcatore auxotrofico his3 , poiché questo marcatore è necessario per utilizzare i plasmidi OptoAMP ^esistenti5. Se cerchi la regolazione optogenetica di un gene nativo di S. cerevisiae, costruisci un ceppo in cui la copia endogena di questo gene viene eliminata.
   2. Linearizzare un plasmide contenente il circuito OptoAMP4, come EZ-L58012, e integrarlo nel locus his3 del ceppo auxotrofico utilizzando metodi standard di trasformazione litio-acetato15. Se si utilizza EZ-L580, linearizzare il plasmide nel sito di restrizione PmeI.
   3. Dopo la trasformazione, centrifugare le cellule a 150 x g per 1 minuto e risospese delicatamente in 200 μL di mezzo SC-His fresco.
   4. Placcare l'intero volume cellulare su un mezzo selettivo (SC-His-agar) e incubare a 30 °C per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
   5. Preparare cellule competenti da questo ceppo e trasformarle con un plasmide contenente il gene o i geni da controllare optogeneticamente a valle del promotore _PGAL1-S12.
      NOTA: L'utilizzo di un plasmide che si integra in δ-siti e seleziona con Zeocin consente un'integrazione e una selezione multicopia stabili.
   6. Dopo la trasformazione, centrifugare la coltura a 150 x g per 1 minuto e risospenare delicatamente in 200 μL di terreno fresco SC-dropout.
      NOTA: Il promotore _PGAL1-S è una versione sintetica del promotore _PGAL1 in cui i siti di repressione Mig1p vengono eliminati e vengono aggiunti ulteriori siti di legame dell'attivatore Gal4p. È possibile utilizzare il normale promotore _PGAL1 ; tuttavia, la forza di espressione sarà inferiore a quella di questo promotore ingegnerizzato.
   7. Placcare l'intero volume della cella su una piastra di agar YPD o SC-dropout e incubare a 30 °C per 16 ore al buio (avvolto in un foglio di alluminio). L'incubazione al buio mantiene represso il gene optogeneticamente controllato, il che consente alle cellule di dirigere le loro risorse metaboliche verso la crescita cellulare piuttosto che verso la produzione chimica.
   8. Se si esegue l'integrazione in siti δ, replicare la piastra su piastre YPD contenenti un intervallo di concentrazioni di Zeocin da selezionare per una varietà di numeri di copia di integrazione. Incubare le piastre a 30 °C al buio (avvolte in un foglio di alluminio) per 2-3 giorni fino alla comparsa delle colonie.
2. Screening preliminare per le migliori colonie
   1. Selezionare otto colonie da ogni piastra e utilizzarle per inoculare 1 mL di SC-His mezzo con il 2% di glucosio nei singoli pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Far crescere le cellule durante la notte (16-20 h) al buio a 30 °C con 200 giri/min scuotendo.
   2. La mattina successiva, diluire ogni coltura in 1 mL di terreno fresco SC-His con il 2% di glucosio a 0,1 _OD600 e crescere al buio a 30 °C con 200 rpm scuotendo fino a raggiungere un _OD600 di 3. Avvolgere le piastre in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. La quantità di tempo necessaria per questa fase di crescita dipenderà dalla tensione.
   3. Per avviare la fase di induzione, incubare le piastre sotto luce pulsata (ad esempio, 5 s on/95 s off) per 12 h a 30 °C con 200 rpm di agitazione. Utilizzare qualsiasi sorgente luminosa a 465 nm e posizionare un pannello LED sopra la piastra in modo tale che l'intensità luminosa sia ~ 80-110 μmol / ^m2 / s per risultati ottimali (Figura 4A).
      NOTA: la durata ottimale dell'impulso luminoso per questa incubazione varierà in base alla sostanza chimica prodotta. Si consiglia di schermare una gamma di programmi di illuminazione dallo 0,1% (ad esempio, 1 s su 999 s spento) al 100% (piena luce).
   4. Per iniziare la fase di produzione, centrifugare le colture a 234 x g per 5 minuti e risospendare in mezzo SC-His fresco con il 2% di glucosio. Sigillare le piastre per evitare l'evaporazione del prodotto desiderato utilizzando nastro sigillante sterile a micropiastre.
   5. Fermentare le piastre sigillate alla luce per 48 ore a 30 °C con agitazione a 200 giri/min. Ottimizza il programma di luce durante questa fase poiché alcune sostanze chimiche beneficiano di una fase di produzione pulsata piuttosto che di luce piena.
3. Raccolta e analisi
   1. Raccogliere le fermentazioni centrifugando le piastre per 5 minuti a 234 x g e trasferendo 800 μL del surnatante in tubi microcentrifuga da 1,5 mL.
   2. A seconda della sostanza chimica di interesse, analizzare utilizzando HPLC, GC-MS o un altro metodo analitico utilizzando la tecnica di preparazione del campione più adatta allo strumento utilizzato.

4. Produzione chimica (mevalonato) da E. coli in un bioreattore a controllo leggero

1. Inoculazione iniziale e configurazione del bioreattore
   1. Inoculare una colonia di un ceppo di E. coli ingegnerizzato con produzione chimica controllata dalla luce in 5 mL di sali minimi M9 (3,37 mM _Na2HPO4, 2,2 mM _KH2PO4, 0,855 mM NaCl, 0,935 mM _NH4Cl) integrati con 0,2% p/v casaminoacidi, 5% p/v glucosio e miscela di metalli in ^traccia20 (0,0084 g/L EDTA, 0,0025 g/L _CoCl2, 0,015 g/L _MnCl2, 0,0015 g/L _CuCl2, 0,003 g/L _H3BO3, 0,0025 g/L _Na2MoO4, 0,008 g/L _ZnCl2, 0,06 g/L Fe (III) citrato, 0,0045 g/L tiamina, 1,3 g/L MgSO4) in un tubo conico da 50 mL.
   2. Coltiva la coltura durante la notte a 30 °C con 200 giri/min scuotendo sotto l'illuminazione a luce blu.
   3. Impostare la piastra di testa del serbatoio del bioreattore, assicurandosi che siano installate le seguenti porte: inserto per sonda termica; sonda di ossigeno disciolto (DO); sparger di gas - collegarsi alla fonte d'aria attraverso un filtro da 0,2 μm; girante; condensatore di gas - collegare a un filtro da 0,2 μm; linea di raffreddamento (x2); linee di alimentazione (x2) - una per l'aggiunta di supporti, una per il controllo del pH; linea di campionamento - assicurarsi che raggiunga il fondo della nave; porta vuota; Sonda di pH - calibrare la sonda con standard di pH = 4 e pH = 7 prima dell'installazione, in autoclave con il resto del recipiente o sterilizzare con etanolo al 95% e inserire asetticamente prima dell'installazione.
   4. Riempire il recipiente con 1 L di acqua filtrata e fissare la piastra di testa e stringere, assicurandosi che l'O-ring si adatti perfettamente e sigilli.
   5. Coprire eventuali aperture nel reattore con un foglio di alluminio.
   6. Preparare tre strisce di tubi: una per rimuovere l'acqua, una per l'inserimento del mangime e una per il controllo del pH. Coprire le estremità con un foglio di alluminio e avvolgere tutto il tubo in un foglio di alluminio.
      NOTA: _NH4OH, che viene utilizzato per la regolazione del pH, non scorre senza intoppi nei tubi in silicone, il che può portare a portate imprecise e sovra-basificazione della coltura. Per evitare questo problema, utilizzare tubi della pompa biocompatibili (BPT) per l'alimentazione _NH4OH.
   7. Autoclave del bioreattore e del tubo, utilizzando un ciclo di 30 minuti del liquido.
   8. Rimuovere i materiali dall'autoclave. Una volta raffreddato abbastanza da gestire, collegare la girante, le sonde di pH e DO, la sorgente d'aria, l'ingresso e l'uscita del condensatore e l'ingresso e l'uscita del raffreddamento alla stazione di controllo.
   9. Inserire la sonda termica e coprire la nave con una camicia riscaldante. Fissare la giacca verso la parte superiore del recipiente per evitare di bloccare la coltura dall'esposizione alla luce.
   10. Collegare uno dei tubi sterili alla linea di campionamento e fissarlo attraverso la pompa di campionamento. Posizionare l'altra estremità in modo tale che scorra in un contenitore vuoto che può contenere almeno 1 L. Scaricare l'acqua all'interno della nave.
   11. Collegare un altro tubo sterile a una delle linee di alimentazione e fissarlo attraverso una delle pompe di alimentazione. Collegare l'altra estremità del tubo a una bottiglia di supporto M9. Alimentare i media nel reattore.
   12. Collegare un altro tubo sterile a una delle linee di alimentazione e fissarlo attraverso una delle pompe di alimentazione. Collegare l'altra estremità del tubo al flacone contenente il 28%-30% di _NH4OH.
       ATTENZIONE: _NH4OH è corrosivo. Lavorare in una cappa aspirante durante il trasferimento in un biberon e assicurarsi che il biberon sia posto in contenimento secondario.
   13. Posizionare tre pannelli luminosi in una formazione triangolare a circa 20 cm di distanza dal reattore, controllando che le intensità luminose sulla superficie del recipiente raggiungano ~ 80-110 μmol / ^m2 / s da ciascun lato (Figura 4B).
   14. Il giorno successivo, accendere il sistema di bioreattore e il refrigeratore. Impostare il setpoint della temperatura del reattore a 37 °C, il setpoint del pH a 7,0 e l'agitazione a 200 giri/min. La giacca riscaldante dovrebbe accendersi.
   15. Calibrare la sonda DO aspettando prima che la temperatura e le misurazioni DO diventino costanti (questo sarà il setpoint al 100%). Quindi, scollegare la sonda dal sistema (questo sarà il setpoint dello 0%). Ripetere l'operazione fino a quando la misurazione DO non si stabilizza al 100% quando la sonda è collegata, quindi impostare il setpoint DO su 20%.
2. Produzione chimica controllata dalla luce
   1. Inoculare il bioreattore ad un _OD600 iniziale di 0,001-0,1. Accendi i pannelli luminosi per avviare la crescita.
   2. Dopo 3 ore, iniziare a prelevare campioni dalla linea di campionamento per effettuare misurazioni _OD600 per evitare di aumentare eccessivamente la densità cellulare ottimale di induzione (_ρs). Una volta raggiunto il _ρs ottimale (il valore ottimale per la produzione di mevalonato è 0,17), spegnere i pannelli luminosi, coprire il reattore con un foglio di alluminio e avvolgere il setup in un panno nero per avviare la fase di produzione scura.
   3. Aggiungere 50 μL di antischiuma, 8 ore dopo il passaggio all'oscurità. Svitare la porta vuota e pipettare l'antischiuma direttamente nel reattore.
   4. Utilizzare la porta di campionamento per prelevare periodicamente campioni per l'analisi HPLC o GC.
3. Smontaggio e analisi
   1. Al termine dell'esperimento, spegnere il sistema. Svitare con cura le sonde DO e pH e lavarle con acqua e sapone. Svitare la piastra della testa e lavarla con acqua e sapone usando un pennello.
   2. Trasferire la coltura in un contenitore vuoto e aggiungere candeggina ad una concentrazione finale del 10% v/v. Mettere in una cappa aspirante e smaltire dopo 30 min.
   3. Lavare il recipiente del reattore con acqua e sapone usando un pennello.
   4. Preparare i campioni per l'analisi in base al prodotto di interesse. Per la produzione di mevalonato, mescolare 560 μL di coltura con 140 μL di 0,5 M HCl e vortice ad alta velocità per 1 min. Questo converte il mevalonato in (±)-mevalonolactone.
      ATTENZIONE: HCl è un pericolo per la salute. Maneggiare con DPI adeguati e assicurarsi che le provette del campione siano adeguatamente tappate prima del vortice.
   5. Centrifugare a 17.000 x g per 45 min a 4 °C. Trasferire 250 μL del surnatante in un flaconcino HPLC.
   6. Per il mevalonato, analizzare i campioni utilizzando una colonna di scambio ionico di acidi organici. Quantificare la produzione utilizzando un rivelatore di indice di rifrazione (RID), confrontando le aree di picco con uno standard di (±)-mevalonolattone.

Risultati

La regolazione optogenetica del metabolismo microbico è stata implementata con successo per produrre una varietà di prodotti, tra cui biocarburanti, sostanze chimiche sfuse, proteine e prodotti naturali5,6,7,12,13. La maggior parte di questi processi sono progettati per la crescita cellulare che avviene alla luce (quando la bassa densità cellulare pone sfid...

Discussione

Il controllo dinamico è stato a lungo applicato per migliorare le rese per l'ingegneria metabolica e la produzione di proteine ricombinanti4. I cambiamenti nell'espressione enzimatica sono più tipicamente implementati utilizzando induttori chimici come ^IPTG21, galattosio22 e tetraciclina23, ma sono stati anche mediati utilizzando condizioni di processo come temperatura e pH. Il controllo optogenetico dell'espressione genica ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Light-controlled chemical production using S. cerevisiae
24-well culture plate	USA Scientific	CC7672-7524
Agar powder	Thermo Fisher Scientific	303991049
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
EZ-L439 OptoINVRT7 Plasmid	N/A	N/A	See Reference 1
Glucose	Thermo Fisher Scientific	501879892 (G8270-5KG)
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Petri dish	Celltreat	229656
PmeI	New England Biolabs	R0560L
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
Replica-plating device	Thomas Scientific	F37848-0000
Replica-plating pads	Sunrise Science Products	3005-012
SC-His powder	Sunrise Science Products	1303-030
SC Complete powder	Sunrise Science Products	1459-100
Sterile sealing film	Excel Scientific	STR-SEAL-PLT
YPD agar plates	VWR	100217-054
Zeocin	Thermo Fisher Scientific	R25005
Light-controlled protein production using E. coli
6X SDS Sample Buffer	Cepham Life Sciences	10502
12% Acrylamide protein gels	Thermo Fisher Scientific	NP0341BOX
24-well culture plate	USA Scientific	CC7672-7524
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
Coomassie Brilliant Blue G-250	Thermo Fisher Scientific	20279
Electrophoresis cell	Bio-Rad	1658004
Electrophoresis power supply	Bio-Rad	1645050
LB broth (Miller)	Fisher Scientific	BP97235
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
NaCl	Thomas Scientific	SX0425-1
OptoLAC plasmids	N/A	N/A	See Reference 2
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Petri dish	Celltreat	229656
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
SOC medium	Thermo Fisher Scientific	15544034
Thermomixer	Eppendorf	5382000015
Tris base	Fisher Scientific	BP1521
Three-phase fermentation using S. cerevisiae
Same materials as "Light-controlled chemical production using S. cerevisiae" protocol plus the following:
EZ-L580 OptoAMP4 Plasmid	N/A	N/A	See Reference 10
Chemical production in a light-controlled bioreactor
Aluminum foil	Reynolds	B004NG90YO
Antifoam	Sigma-Aldrich	A8311
Bioreactor with control station	Eppendorf	B120110001
BioSpectrometer with μcuvette	Eppendorf	6135000923
Bleach	VWR Scientific	89501-620 (CS)
Blue LED panel	HQRP	884667106091218
BPT tubing	Fisher Scientific	14-170-15
Glucose	Thermo Fisher Scientific	501879892 (G8270-5KG)
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific	7647-01-0
M9 Minimal Salts	Thermo Fisher Scientific	A1374401
Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002403
Microcentrifuge tubes	USA Scientific	1615-5510
NH4OH Solution	Sigma-Aldrich	I0503-1VL
Orbital Shaker	Yamato Scientific America	SOU-300
Quantum meter	Apogee Instruments	MQ-510
SC Complete powder	Sunrise Science Products	1459-100