Realización de miografía de impedancia eléctrica in vivo y ex vivo en roedores

Resumen

Este artículo detalla cómo realizar una miografía de impedancia eléctrica in vivo (usando matrices de electrodos de superficie y aguja) y ex vivo (usando una celda dieléctrica) en el músculo gastrocnemio de roedores. Demostrará la técnica tanto en ratones como en ratas y detallará las modificaciones disponibles (es decir, animales obesos, cachorros).

Resumen

La miografía de impedancia eléctrica (EIM) es una técnica conveniente que se puede utilizar en estudios preclínicos y clínicos para evaluar la salud y la enfermedad del tejido muscular. EIM se obtiene aplicando una corriente eléctrica de baja intensidad, enfocada direccionalmente, a un músculo de interés en un rango de frecuencias (es decir, de 1 kHz a 10 MHz) y registrando los voltajes resultantes. A partir de estos, se obtienen varios componentes de impedancia estándar, incluyendo la reactancia, la resistencia y la fase. Al realizar mediciones ex vivo en el músculo extirpado, también se pueden calcular las propiedades eléctricas pasivas inherentes del tejido, a saber, la conductividad y la permitividad relativa. EIM se ha utilizado ampliamente en animales y humanos para diagnosticar y rastrear alteraciones musculares en una variedad de enfermedades, en relación con la atrofia simple por desuso, o como una medida de intervención terapéutica. Clínicamente, EIM ofrece el potencial de rastrear la progresión de la enfermedad a lo largo del tiempo y evaluar el impacto de las intervenciones terapéuticas, ofreciendo así la oportunidad de acortar la duración del ensayo clínico y reducir los requisitos de tamaño de la muestra. Debido a que se puede realizar de forma no invasiva o mínimamente invasiva en modelos animales vivos, así como en humanos, EIM ofrece el potencial de servir como una nueva herramienta traslacional que permite el desarrollo preclínico y clínico. Este artículo proporciona instrucciones paso a paso sobre cómo realizar mediciones de EIM in vivo y ex vivo en ratones y ratas, incluidos enfoques para adaptar las técnicas a condiciones específicas, como para su uso en cachorros o animales obesos.

Introducción

La miografía de impedancia eléctrica (EIM) proporciona un método poderoso para evaluar la condición muscular, lo que potencialmente permite el diagnóstico de trastornos neuromusculares, el seguimiento de la progresión de la enfermedad y la evaluación de la respuesta a la terapia ^1,2,3. Se puede aplicar de manera análoga a modelos de enfermedades animales y humanos, lo que permite una traducción relativamente fluida de estudios preclínicos a clínicos. Las mediciones de EIM se obtienen fácilmente utilizando cuatro electrodos colocados linealmente, con los dos externos aplicando una corriente eléctrica débil e indolora en un rango de frecuencias (generalmente entre 1 kHz y aproximadamente 2 MHz), y los dos internos registrando los voltajes resultantes¹. A partir de estos voltajes, se pueden obtener las características de impedancia del tejido, incluida la resistencia (R), una medida de cuán difícil es que la corriente pase a través del tejido, y la reactancia (X) o "cargabilidad" del tejido, una medida relacionada con la capacidad del tejido para almacenar carga (capacitancia). A partir de la reactancia y la resistencia, el ángulo de fase (θ) se calcula mediante la siguiente ecuación: , proporcionando una única medida de impedancia sumativa. Dichas mediciones se pueden obtener utilizando cualquier dispositivo de bioimpedancia multifrecuencia. Como las miofibras son esencialmente cilindros largos, el tejido muscular también es altamente anisótropo, con corriente que fluye más fácilmente a lo largo de las fibras que a través de ellas ^4,5. Por lo tanto, EIM a menudo se realiza en dos direcciones: con la matriz colocada a lo largo de las fibras de tal manera que la corriente corre paralela a ellas, y a través del músculo de tal manera que la corriente fluye perpendicular a ellas. Además, en las mediciones ex vivo, donde se mide un volumen conocido de tejido en una celda de medición de impedancia, se pueden derivar las propiedades eléctricas inherentes del músculo (es decir, la conductividad y la permitividad relativa)⁶.

El término "trastornos neuromusculares" define una amplia gama de enfermedades primarias y secundarias que conducen a la alteración y disfunción muscular estructural. Esto incluye la esclerosis lateral amiotrófica y varias formas de distrofia muscular, así como cambios más simples relacionados con el envejecimiento (por ejemplo, sarcopenia), atrofia por desuso (por ejemplo, debido a reposo prolongado en cama o microgravedad) o incluso lesiones⁷. Si bien las causas son abundantes y pueden originarse en la neurona motora, los nervios, las uniones neuromusculares o el músculo en sí, EIM se puede usar para detectar alteraciones tempranas en el músculo debido a muchos de estos procesos y para rastrear la progresión o la respuesta a la terapia. Por ejemplo, en pacientes con distrofia muscular de Duchenne (DMD), EIM ha demostrado detectar la progresión de la enfermedad y la respuesta a los corticosteroides⁸. Trabajos recientes también han demostrado que EIM es sensible a diferentes estados de desuso, incluida la gravedad fraccional⁹, como se experimentaría en la Luna o Marte, y los efectos del envejecimiento^10,11. Finalmente, mediante la aplicación de algoritmos predictivos y de aprendizaje automático al conjunto de datos obtenidos con cada medición (datos multifrecuencia y dependientes direccionalmente), es posible inferir aspectos histológicos del tejido, incluyendo el tamaño de la miofibra 12,13, los cambios inflamatorios y edema 14, y el tejido conectivo y el contenido de grasa ^15,16.

Varios otros métodos no invasivos o mínimamente invasivos también se utilizan para evaluar la salud muscular en humanos y animales, incluyendo la electromiografía con aguja¹⁷ y tecnologías de imagen como la resonancia magnética, la tomografía computarizada y el ultrasonido^18,19. Sin embargo, EIM demuestra beneficios distintos en comparación con estas tecnologías. Por ejemplo, la electromiografía registra solo las propiedades eléctricas activas de las membranas de miofibras y no las propiedades pasivas, y por lo tanto no puede proporcionar una verdadera evaluación de la composición o estructura muscular. En cierto sentido, los métodos de imagen están más estrechamente relacionados con EIM, ya que también proporcionan información sobre la estructura y composición del tejido. Pero, en cierto sentido, proporcionan demasiados datos, lo que requiere una segmentación detallada de la imagen y un análisis experto en lugar de simplemente proporcionar una salida cuantitativa. Además, dadas sus complejidades, las técnicas de imagen también se ven muy afectadas por las características específicas tanto del hardware como del software que se utilizan, lo que idealmente requiere el uso de sistemas idénticos para que se puedan comparar los conjuntos de datos. Por el contrario, el hecho de que EIM sea mucho más simple significa que se ve menos afectado por estos problemas técnicos y no requiere ninguna forma de procesamiento de imágenes o análisis experto.

El siguiente protocolo demuestra cómo realizar EIM in vivo en ratas y ratones, utilizando técnicas no invasivas (matriz de superficie) y mínimamente invasivas (matriz de agujas subdérmicas), así como EIM ex vivo en músculo recién extirpado.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico Beth Israel Deaconess bajo los números de protocolo (031-2019; 025-2019). Use el equipo de EPP adecuado para manejar animales y cumpla con las pautas de IACUC para todo el trabajo con animales.

1. EIM superficial in vivo

1. Coloque al animal en una caja de anestesia para inducir la anestesia.
   NOTA: Para ratas, se utilizó isoflurano 1.5% -3.5% y 2 O 2 L·min-1, y para ratones, isoflurano al 2% y 1 O₂ L·^min-1.
2. Una vez completamente anestesiado, como indica la ausencia de respuesta tras pellizcar el pie del animal, colocar el ratón en el banco en decúbito prono y utilizar el cono nasal para mantener la anestesia utilizando isoflurano al 1,5% y un flujo de oxígeno de 1 L·^min-1.
3. Coloque la pata del animal a analizar en un ángulo de 45° con la articulación de la cadera (rodilla extendida) y asegure el pie con cinta médica.
4. Use un cortapelos para recortar el pelaje que se superpone al músculo gastrocnemio.
5. Aplique una capa gruesa de crema depilatoria sobre la piel del animal y déjelo reposar durante 1 minuto. Luego, use una gasa saturada de solución salina para eliminar el agente depilatorio. Repita este proceso hasta tres veces hasta que se elimine todo el pelaje que recubre el músculo gastrocnemio.
   NOTA: Coloque una gasa empapada en solución salina sobre la piel cuando no se adquieran mediciones para prevenir la deshidratación de la piel.
6. Conecte la matriz de superficie (Figura 1) al dispositivo EIM y deje que los electrodos descansen sobre un trozo de gasa empapado en solución salina.
7. Coloque la matriz superficial directamente sobre la piel sobre el músculo gastrocnemio, orientada longitudinalmente a las fibras musculares.
8. Después de verificar el contacto apropiado, que se indica con todas las barras que aparecen en verde en el software que muestran la estabilidad de los valores de resistencia, reactancia y fase de 50 kHz, adquiera las mediciones EIM.
   NOTA: Las curvas deben verificarse en tiempo real para garantizar la adquisición adecuada de datos.
9. Gire la matriz de superficie 90° y vuelva a colocarla sobre la piel sobre el gastrocnemio para obtener las medidas transversales (compruebe si hay barras verdes que indiquen la estabilidad).
10. Repita los pasos 1.7, 1.8 y 1.9 para obtener un total de cuatro mediciones por músculo: dos longitudinales y dos transversales.
    NOTA: No use un agente depilatorio más de una vez (es decir, hasta tres aplicaciones en el mismo caso) cada dos semanas para prevenir la irritación excesiva de la piel y lesiones. Es importante realizar las mediciones dentro de los 5-10 minutos posteriores a la retirada de la crema depilatoria, ya que el desarrollo de edema cutáneo localizado inducido por el agente depilatorio puede afectar los datos de impedancia recogidos. La recuperación del animal es inmediata después de suspender la anestesia con isoflurano y el procedimiento no requiere tratamiento analgésico.

2. Matriz de agujas in vivo EIM

1. Anestesiar al animal y preparar la pata utilizando el mismo procedimiento descrito en los pasos 1.1-1.4. Sin embargo, no es necesario utilizar un agente depilatorio cuando se realiza EIM in vivo utilizando una matriz de agujas.
2. Conecte la matriz de agujas (Figura 2A-F) al dispositivo EIM y déjela reposar en un bote de pesaje que contenga solución salina. Compruebe la conectividad y la estabilidad de la señal (indicada por barras verdes).
3. Desinfecte la piel y las agujas con alcohol. Coloque la matriz de agujas en una posición longitudinal en comparación con las miofibras y presiónela firmemente en la piel hasta que todas las agujas penetren en la piel y el músculo subyacente hasta el protector de plástico en la matriz. Adquirir datos.
4. Retire suavemente la matriz y vuelva a insertarla a través de la piel y en el músculo en un ángulo de 90 ° con respecto a la primera medición, en la dirección transversal. Adquirir datos.
   NOTA: Cuando se utilizan matrices de agujas, las mediciones solo deben adquirirse una vez en cada dirección para reducir el impacto de los electrodos de aguja en la piel y el tejido muscular. Si se produce sangrado, limpie suavemente la sangre antes de realizar la segunda medición. La recuperación del animal es inmediata después de suspender la anestesia con isoflurano y el procedimiento no requiere tratamiento analgésico.

3. EIM ex vivo

1. Prepare la celda dieléctrica ex vivo (Figura 2G, H), agregue solución salina a la cámara y conecte la celda al dispositivo EIM para obtener los valores de referencia.
   NOTA: Los valores de fase y reactancia de la solución salina deben permanecer constantes en o cerca de cero y los valores de resistencia de la solución salina deben permanecer constantes en aproximadamente 100 ± 25 Ω en el rango de frecuencias de 1 kHz a 1 MHz.
2. Eutanasia del animal de acuerdo con las respectivas directrices de IACUC.
3. Con un par de tijeras, corte la piel cerca del tendón de Aquiles. Usando pinzas, tire de la piel en un movimiento hacia arriba para revelar los músculos subyacentes y la fascia. Diseccionar suavemente el bíceps femoral que se superpone al músculo gastrocnemio y seccionar el nervio ciático.
4. Corte el tendón de Aquiles para liberar el extremo distal de los músculos gastrocnemio y sóleo y tire suavemente del tendón hacia arriba mientras usa tijeras para quitar cualquier accesorio. Una vez que se retiren todos los accesorios, use tijeras para cortar el extremo rostral del músculo sóleo y retirarlo.
5. Use tijeras para diseccionar las cabezas del músculo gastrocnemio alrededor de la rótula.
   NOTA: Después de la extirpación del músculo gastrocnemio, es importante recordar la orientación original de las miofibras.
6. Coloque el músculo gastrocnemio en una lámina de cera dental y seccionarlo con una cuchilla de afeitar y una regla para obtener una sección de 10 mm x 10 mm desde el centro del músculo gastrocnemio.
   NOTA: El tamaño de la celda dieléctrica se puede personalizar. Para ratas, se utilizó una celda de 10 mm x 10 mm y para ratones, se utilizó una celda de 5 mm x 5 mm.
7. Usando pinzas, coloque suavemente el gastrocnemio en las células dieléctricas, asegurándose de que las fibras estén orientadas longitudinalmente (es decir, las extremidades caudales y rostrales deben tocar los electrodos). Asegúrese de que el músculo esté completamente en contacto con los electrodos metálicos.
8. Acople la parte superior de la celda dieléctrica e inserte dos agujas monopolares (26 G) en los dos orificios. Conecte los cables del dispositivo EIM a la celda ex vivo en el siguiente orden: (1: I +, 2: V +, 3: V-, 4: I-, donde I representa los electrodos de corriente y V representa los electrodos de voltaje). Adquirir la medida longitudinal.
9. Abra la celda dieléctrica y reoriente el músculo en la dirección transversal girándolo 90 °. Vuelva a conectar la parte superior de la celda dieléctrica. Adquirir la medida transversal.

Resultados

EIM se puede obtener en muchas condiciones, incluyendo matrices de superficie in vivo (Figura 1), matrices de aguja in vivo (Figura 2A-F) y células dieléctricas ex vivo (Figura 2G, H).

EIM proporciona una instantánea casi instantánea de la condición muscular basada en los valores de impedancia medidos. Las mediciones se adq...

Discusión

Este artículo proporciona los métodos básicos para realizar EIM en roedores, tanto in vivo como ex vivo. Para adquirir mediciones confiables, es fundamental realizar una serie de pasos. Primero, uno necesita identificar adecuadamente el músculo de interés, ya que cada músculo tendrá diferentes respuestas a enfermedades, tratamiento y patología. Uno debe ser consciente de que los datos adquiridos en un músculo (por ejemplo, gastrocnemio) no proporcionarán la misma información que en otro músc...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile