설치류에서 생체 내 및 생체 외 전기 임피던스 근전도 수행

요약

이 기사에서는 설치류 비복근 근육에서 생체 내 (표면 및 바늘 전극 어레이 사용) 및 생체 외 (유전체 셀 사용) 전기 임피던스 근조영술을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 생쥐와 쥐 모두에서 기술을 시연하고 사용 가능한 수정 (즉, 비만 동물, 새끼)을 자세히 설명합니다.

초록

전기 임피던스 근조영술(EIM)은 근육 조직 건강 및 질병을 평가하기 위해 전임상 및 임상 연구에 사용할 수 있는 편리한 기술입니다. EIM은 주파수 범위(즉, 1kHz에서 10MHz)에 걸쳐 관심 근육에 저강도의 방향성 초점이 맞춰진 전류를 적용하고 결과 전압을 기록함으로써 얻어집니다. 이들로부터 리액턴스, 저항 및 위상을 포함한 몇 가지 표준 임피던스 성분이 얻어집니다. 절제된 근육에 대한 생체 외 측정을 수행할 때 조직의 고유한 수동 전기적 특성, 즉 전도도 및 상대 유전율도 계산할 수 있습니다. EIM은 동물과 인간에서 다양한 질병의 근육 변화를 진단하고 추적하기 위해, 단순한 사용 불용 위축과 관련하여, 또는 치료 적 개입의 척도로 광범위하게 사용되었습니다. 임상적으로 EIM은 시간 경과에 따른 질병 진행을 추적하고 치료적 개입의 영향을 평가할 수 있는 잠재력을 제공하여 임상 시험 기간을 단축하고 표본 크기 요구 사항을 줄일 수 있는 기회를 제공합니다. EIM은 인간뿐만 아니라 살아있는 동물 모델에서 비침습적 또는 최소 침습적으로 수행할 수 있기 때문에 전임상 및 임상 개발을 모두 가능하게 하는 새로운 번역 도구 역할을 할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 이 문서에서는 강아지 또는 비만 동물에 사용하기 위한 것과 같은 특정 조건에 기술을 적용하는 접근 방식을 포함하여 생쥐와 쥐에서 생체 내 및 생체 외 EIM 측정을 수행하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다.

서문

전기 임피던스 근조영술(EIM)은 근육 상태를 평가하는 강력한 방법을 제공하여 잠재적으로 신경근 장애 진단, 질병 진행 추적 및 치료 ^1,2,3에 대한 반응 평가를 가능하게 합니다. 동물 질병 모델 및 인간과 유사하게 적용될 수 있어 전임상에서 임상 연구로 비교적 원활하게 번역할 수 있습니다. EIM 측정은 선형으로 배치 된 4 개의 전극을 사용하여 쉽게 얻을 수 있으며, 2 개의 외부 전극은 주파수 범위 (일반적으로 1kHz에서 약 2MHz 사이)에 걸쳐 고통없고 약한 전류를 적용하고 2 개의 내부 전극은 결과 전압을 기록합니다¹. 이러한 전압으로부터, 저항(R), 전류가 조직을 통과하는 것이 얼마나 어려운지에 대한 척도, 조직의 리액턴스(X) 또는 "전하성"을 포함한 조직의 임피던스 특성을 얻을 수 있다. 리액턴스와 저항으로부터 위상각(θ)은 다음 방정식을 통해 계산됩니다. , 단일 합계 임피던스 측정값을 제공합니다. 이러한 측정은 임의의 다중 주파수 바이오임피던스 장치를 사용하여 얻을 수 있다. 근섬유는 본질적으로 긴 실린더이기 때문에 근육 조직도 매우 이방성이며 전류가 섬유를 가로지르는 것보다 섬유를 따라 더 쉽게 흐릅니다^4,5. 따라서 EIM은 종종 두 가지 방향으로 수행됩니다 : 전류가 섬유와 평행하게 흐르도록 섬유를 따라 배열을 배치하고 전류가 수직으로 흐르도록 근육을 가로 질러 배치됩니다. 또한, 임피던스 측정 셀에서 알려진 부피의 조직이 측정되는 생체 외 측정에서 근육의 고유 한 전기적 특성 (즉, 전도도 및 상대 유전율)을 도출 할 수 있습니다⁶.

"신경근 장애"라는 용어는 구조적 근육 변화 및 기능 장애를 유발하는 광범위한 1 차 및 2 차 질환을 정의합니다. 여기에는 근 위축성 측삭 경화증 및 다양한 형태의 근이영양증뿐만 아니라 노화 (예 : 근육 감소증), 사용 중단 위축 (예 : 장기간의 침상 안정 또는 미세 중력으로 인한) 또는 부상과 관련된 단순한 변화가 포함됩니다⁷. 원인은 풍부하고 운동 뉴런, 신경, 신경근 접합부 또는 근육 자체에서 비롯될 수 있지만 EIM은 이러한 많은 과정으로 인한 근육의 조기 변화를 감지하고 치료에 대한 진행 또는 반응을 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 뒤셴 근이영양증(DMD) 환자에서 EIM은 질병 진행 및 코르티코스테로이드에 대한 반응을 감지하는 것으로^{나타났습니다8.} 최근 연구에 따르면 EIM은 달이나 화성에서 경험할 수있는 분수 중력⁹과 노화^10,11의 영향을 포함한 다양한 사용 중단 상태에 민감합니다. 마지막으로, 각 측정으로 얻은 데이터 세트(다중 주파수 및 방향 의존적 데이터)에 예측 및 기계 학습 알고리즘을 적용함으로써 근섬유 크기 12,13, 염증 변화 및 부종 14, 결합 조직 및 지방 함량 ^15,16을 포함한 조직의 조직학적 측면을 추론할 수 있게 됩니다.

바늘 근전도¹⁷ 및 자기 공명 영상, 컴퓨터 단층 촬영 및 초음파^18,19와 같은 영상 기술을 포함하여 인간 및 동물의 근육 건강을 평가하기 위해 몇 가지 다른 비침습적 또는 최소 침습적 방법도 사용됩니다. 그러나 EIM은 이러한 기술에 비해 뚜렷한 이점을 보여줍니다. 예를 들어, 근전도 검사는 근섬유 막의 활성 전기적 특성만 기록하고 수동 특성은 기록하지 않으므로 근육 구성이나 구조에 대한 진정한 평가를 제공할 수 없습니다. 특정 측면에서 이미징 방법은 조직의 구조와 구성에 대한 정보를 제공하기 때문에 EIM과 더 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 어떤 의미에서는 너무 많은 데이터를 제공하므로 정량적 출력을 제공하는 것이 아니라 상세한 이미지 분할 및 전문가 분석이 필요합니다. 또한 복잡성을 감안할 때 이미징 기술은 사용되는 하드웨어와 소프트웨어의 특성에 크게 영향을 받으며 이상적으로는 데이터 세트를 비교할 수 있도록 동일한 시스템을 사용해야 합니다. 반대로 EIM이 훨씬 간단하다는 사실은 이러한 기술적 문제의 영향을 덜 받고 어떤 형태의 이미지 처리나 전문가 분석도 필요하지 않다는 것을 의미합니다.

다음 프로토콜은 새로 절제된 근육에 대한 생체 외 EIM뿐만 아니라 비침습적(표면 어레이) 및 최소 침습적(피하 바늘 배열) 기술을 모두 사용하여 쥐와 마우스에서 생체 내 EIM을 수행하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 방법은 프로토콜 번호 (031-2019; 025-2019)에 따라 Beth Israel Deaconess Medical Center의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 동물을 취급하고 모든 동물 작업에 대한 IACUC 지침을 준수하기 위해 적절한 PPE 장비를 착용하십시오.

1. 생체 내 표면 EIM

1. 동물을 마취 상자에 넣어 마취를 유도하십시오.
   참고 : 쥐의 경우 1.5 % -3.5 % 이소 플루 란 및 2 O 2 L · min-1이 사용되었고 마우스의 경우 2 % 이소 플루 란 및 1 O₂ L · ^min-1이 사용되었습니다.
2. 동물의 발을 꼬집은 후 반응이 없는 것으로 나타난 대로 완전히 마취되면 마우스를 벤치에 엎드린 자세로 놓고 코콘을 사용하여 1.5% 이소플루란과 1L·^min-1의 산소 흐름을 사용하여 마취를 유지합니다.
3. 분석할 동물의 다리를 고관절(무릎 확장)과 45° 각도로 놓고 의료용 테이프로 발을 고정합니다.
4. 머리 깎기를 사용하여 비복근 근육을 덮는 모피를 다듬습니다.
5. 동물의 피부에 제모 크림을 두껍게 바르고 1분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 식염수 포화 거즈를 사용하여 탈모제를 제거하십시오. 비복근 근육을 덮고있는 모든 모피가 제거 될 때까지이 과정을 최대 3 번 반복하십시오.
   알림: 피부 탈수를 방지하기 위해 측정값을 수집하지 않을 때 식염수에 적신 거즈 패드를 피부 위에 놓습니다.
6. 표면 어레이(그림 1)를 EIM 장치에 연결하고 전극을 식염수에 적신 거즈 조각 위에 놓습니다.
7. 표면 배열을 근육 섬유에 세로로 향하는 비복근 위의 피부에 직접 놓습니다.
8. 소프트웨어에서 녹색으로 나타나는 모든 막대가 50kHz 저항, 리액턴스 및 위상 값의 안정성을 나타내는 적절한 접촉을 확인한 후 EIM 측정값을 획득합니다.
   참고: 적절한 데이터 수집을 위해 곡선을 실시간으로 확인해야 합니다.
9. 표면 배열을 90° 회전하고 비복근 위의 피부에 다시 배치하여 가로 측정값을 얻습니다(안정성을 나타내는 녹색 막대 확인).
10. 1.7, 1.8 및 1.9단계를 반복하여 근육당 총 4개의 측정값(세로 2개, 가로 2개)을 얻습니다.
    알림: 과도한 피부 자극과 부상을 방지하기 위해 2주마다 한 번 이상(즉, 동일한 경우에 최대 3회) 제모제를 사용하지 마십시오. 제모제에 의해 유도 된 국소 피부 부종의 발생이 수집 된 임피던스 데이터에 영향을 미칠 수 있으므로 제모 크림을 제거한 후 약 5-10 분 이내에 측정을 수행하는 것이 중요합니다. 동물 회복은 이소 플루 란 마취를 중단 한 직후에 이루어지며 절차는 진통제 치료가 필요하지 않습니다.

2. 생체 내 바늘 배열 EIM

1. 동물을 마취시키고 1.1-1.4 단계에서 설명한 것과 동일한 절차를 사용하여 다리를 준비하십시오. 그러나, 바늘 어레이를 이용하여 in vivo EIM을 수행하는 경우에는 탈모제를 사용할 필요가 없다.
2. 바늘 어레이(그림 2A-F)를 EIM 장치에 연결하고 식염수가 들어 있는 계량 보트에 그대로 두십시오. 연결 및 신호 안정성을 확인합니다(녹색 막대로 표시됨).
3. 알코올로 피부와 바늘을 소독하십시오. 바늘 배열을 근섬유와 비교하여 세로 위치에 놓고 모든 바늘이 피부와 밑 근육을 배열의 플라스틱 가드까지 관통할 때까지 피부에 단단히 누릅니다. 데이터 수집.
4. 어레이를 부드럽게 제거하고 피부를 통해 근육에 가로 방향으로 첫 번째 측정에 대해 90° 각도로 다시 삽입합니다. 데이터 수집.
   알림: 바늘 배열을 사용할 때 바늘 전극이 피부와 근육 조직에 미치는 영향을 줄이기 위해 각 방향에서 한 번만 측정값을 수집해야 합니다. 출혈이 발생하면 두 번째 측정을 수행하기 전에 혈액을 부드럽게 닦아냅니다. 동물 회복은 이소 플루 란 마취를 중단 한 직후에 이루어지며 절차는 진통제 치료가 필요하지 않습니다.

3. 생체 외 EIM

1. 생체 외 유전체 셀(그림 2G,H)을 준비하고 식염수를 챔버에 추가한 다음 셀을 EIM 장치에 연결하여 기준 값을 얻습니다.
   알림: 식염수의 위상 및 리액턴스 값은 0 또는 거의 0에서 일정하게 유지되어야하며 식염수의 저항 값은 100kHz에서 25MHz의 주파수 범위에서 약 1± 1 Ω에서 일정하게 유지되어야합니다.
2. 각각의 IACUC 지침에 따라 동물을 안락사시킨다.
3. 가위를 사용하여 아킬레스 건 근처의 피부를 자릅니다. 핀셋을 사용하여 피부를 위쪽으로 당겨 밑에있는 근육과 근막을 드러냅니다. 비복근을 덮고 있는 대퇴이두근을 부드럽게 해부하고 좌골 신경을 절개합니다.
4. 아킬레스건을 잘라 비복근과 단독근의 말단부를 풀고 힘줄을 부드럽게 위로 당기면서 가위를 사용하여 부착물을 제거합니다. 모든 부착물이 제거되면 가위를 사용하여 솔레 우스 근육의 끝을 자르고 제거하십시오.
5. 가위를 사용하여 슬개골 주변의 비복근 근육의 머리를 해부하십시오.
   알림: 비복근 근육을 제거한 후에는 근섬유의 원래 방향을 기억하는 것이 중요합니다.
6. 치과용 왁스 시트에 비복근을 놓고 면도날과 자를 사용하여 절편하여 비복근의 중심에서 10mm x 10mm 단면을 얻습니다.
   참고: 유전체 셀 크기는 사용자 정의할 수 있습니다. 쥐의 경우 10mm x 10mm 셀을 사용하고 마우스의 경우 5mm x 5mm 세포를 사용했습니다.
7. 핀셋을 사용하여 비복근을 유전체 셀에 부드럽게 배치하고 섬유가 세로로 향하도록 합니다(즉, 꼬리 및 말단이 전극에 닿아 있어야 함). 근육이 금속 전극과 완전히 접촉했는지 확인하십시오.
8. 유전체 셀의 상단 부분을 부착하고 두 개의 단극 바늘(26G)을 두 개의 구멍에 삽입합니다. EIM 장치에서 생체 외 셀에 전선을 다음 순서로 연결합니다(1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, 여기서 I는 전류 전극을 나타내고 V는 전압 전극을 나타냄). 종방향 측정값을 획득합니다.
9. 유전체 셀을 열고 근육을 90° 회전시켜 가로 방향으로 방향을 바꿉니다. 유전체 셀의 상단을 다시 부착합니다. 가로 측정을 획득합니다.

결과

EIM은 표면 생체 내 어레이 (그림 1), 바늘 생체 내 어레이 (그림 2A-F) 및 생체 외 유 전체 셀 (그림 2G, H)을 포함한 많은 조건에서 얻을 수 있습니다.

EIM은 측정된 임피던스 값을 기반으로 근육 상태에 대한 거의 즉각적인 스냅샷을 제공합니다. 측정은 ?...

토론

이 기사에서는 생체 내 및 생체 외 설치류에서 EIM을 수행하는 기본 방법을 제공합니다. 신뢰할 수 있는 측정값을 얻으려면 일련의 단계를 수행하는 것이 중요합니다. 첫째, 각 근육이 질병, 치료 및 병리에 대해 서로 다른 반응을 보이기 때문에 관심있는 근육을 적절하게 식별해야합니다. 한 근육 (예 : 비복근)에서 획득 한 데이터는 다른 근육 (예 : 전방 경골)과 동일한 정보를 제공하...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile