Durchführung der In-vivo- und Ex-vivo-Impedanz-Myographie bei Nagetieren

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt, wie die elektrische Impedanzmyographie in vivo (unter Verwendung von Oberflächen- und Nadelelektrodenarrays) und ex vivo (unter Verwendung einer dielektrischen Zelle) am Musculus gastrocnemius von Nagetieren durchgeführt wird. Es wird die Technik sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten demonstrieren und die verfügbaren Modifikationen (z. B. fettleibige Tiere, Welpen) detailliert beschreiben.

Zusammenfassung

Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) ist eine praktische Technik, die in präklinischen und klinischen Studien verwendet werden kann, um die Gesundheit und Krankheit des Muskelgewebes zu beurteilen. EIM wird erhalten, indem ein richtungsfokussierter elektrischer Strom niedriger Intensität an einen Muskel von Interesse über einen Frequenzbereich (d. h. von 1 kHz bis 10 MHz) angelegt und die resultierenden Spannungen aufgezeichnet werden. Aus diesen werden mehrere Standardimpedanzkomponenten, einschließlich Reaktanz, Widerstand und Phase, erhalten. Bei Ex-vivo-Messungen an ausgeschnittenen Muskeln können auch die inhärenten passiven elektrischen Eigenschaften des Gewebes, nämlich die Leitfähigkeit und die relative Dielektrizitätskonstante, berechnet werden. EIM wurde ausgiebig bei Tieren und Menschen eingesetzt, um Muskelveränderungen bei einer Vielzahl von Krankheiten zu diagnostizieren und zu verfolgen, in Bezug auf einfache Nichtgebrauchsatrophie oder als Maßnahme der therapeutischen Intervention. Klinisch bietet EIM das Potenzial, das Fortschreiten der Krankheit im Laufe der Zeit zu verfolgen und die Wirkung therapeutischer Interventionen zu bewerten, wodurch die Möglichkeit besteht, die Dauer klinischer Studien zu verkürzen und die Anforderungen an die Stichprobengröße zu reduzieren. Da EIM sowohl in lebenden Tiermodellen als auch beim Menschen nichtinvasiv oder minimalinvasiv durchgeführt werden kann, bietet es das Potenzial, als neuartiges translationales Werkzeug zu dienen, das sowohl die präklinische als auch die klinische Entwicklung ermöglicht. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anweisungen zur Durchführung von In-vivo- und Ex-vivo-EIM-Messungen an Mäusen und Ratten, einschließlich Ansätzen zur Anpassung der Techniken an bestimmte Bedingungen, z. B. zur Anwendung bei Welpen oder fettleibigen Tieren.

Einleitung

Die elektrische Impedanzmyographie (EIM) bietet eine leistungsstarke Methode zur Beurteilung des Muskelzustands, die möglicherweise die Diagnose neuromuskulärer Erkrankungen, die Verfolgung des Krankheitsverlaufs und die Beurteilung des Ansprechens auf Therapie ^1,2,3 ermöglicht. Es kann analog auf Tierkrankheitsmodelle und Menschen angewendet werden, was eine relativ nahtlose Übertragung von präklinischen zu klinischen Studien ermöglicht. EIM-Messungen werden leicht mit vier linear angeordneten Elektroden durchgeführt, wobei die beiden äußeren einen schmerzlosen, schwachen elektrischen Strom über einen Frequenzbereich (im Allgemeinen zwischen 1 kHz und etwa 2 MHz) und die beiden inneren die resultierenden Spannungen aufzeichnen¹. Aus diesen Spannungen können die Impedanzeigenschaften des Gewebes gewonnen werden, einschließlich des Widerstands (R), ein Maß dafür, wie schwierig es ist, Strom durch das Gewebe zu fließen, und die Reaktanz (X) oder "Aufladbarkeit" des Gewebes, ein Maß für die Fähigkeit des Gewebes, Ladung zu speichern (Kapazität). Aus der Reaktanz und dem Widerstand wird der Phasenwinkel (θ) über die folgende Gleichung berechnet: , was ein einzelnes summatives Impedanzmaß ergibt. Solche Messungen können mit jedem Multifrequenz-Bioimpedanzgerät durchgeführt werden. Da Myofasern im Wesentlichen lange Zylinder sind, ist Muskelgewebe auch stark anisotrop, wobei der Strom leichter entlang der Fasern fließt als über sie ^4,5. Daher wird EIM oft in zwei Richtungen durchgeführt: mit dem Array, das entlang der Fasern so platziert ist, dass der Strom parallel zu ihnen fließt, und durch den Muskel, so dass der Strom senkrecht zu ihnen fließt. Zusätzlich können bei Ex-vivo-Messungen, bei denen ein bekanntes Gewebevolumen in einer Impedanzmesszelle gemessen wird, die inhärenten elektrischen Eigenschaften des Muskels (d. h. Leitfähigkeit und relative Permittivität) abgeleitet werden⁶.

Der Begriff "neuromuskuläre Erkrankungen" definiert ein breites Spektrum von primären und sekundären Erkrankungen, die zu strukturellen Muskelveränderungen und Funktionsstörungen führen. Dazu gehören amyotrophe Lateralsklerose und verschiedene Formen der Muskeldystrophie sowie einfachere Veränderungen im Zusammenhang mit dem Altern (z. B. Sarkopenie), Nichtgebrauchsatrophie (z. B. aufgrund längerer Bettruhe oder Schwerelosigkeit) oder sogar Verletzungen⁷. Während die Ursachen zahlreich sind und vom Motoneuron, Nerven, neuromuskulären Verbindungen oder dem Muskel selbst ausgehen können, kann EIM verwendet werden, um frühe Veränderungen im Muskel aufgrund vieler dieser Prozesse zu erkennen und das Fortschreiten oder Ansprechen auf die Therapie zu verfolgen. Bei Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie (DMD) wurde beispielsweise gezeigt, dass EIM das Fortschreiten der Erkrankung und das Ansprechen auf Kortikosteroide erkennt⁸. Jüngste Arbeiten haben auch gezeigt, dass EIM empfindlich auf unterschiedliche Nichtnutzungszustände reagiert, einschließlich der fraktionierten Schwerkraft⁹, wie sie auf dem Mond oder Mars auftreten würde, und der Auswirkungen des Alterns^10,11. Schließlich wird es durch die Anwendung von prädiktiven und maschinellen Lernalgorithmen auf den Datensatz, der mit jeder Messung erhalten wird (multifrequenz- und richtungsabhängige Daten), möglich, histologische Aspekte des Gewebes abzuleiten, einschließlich Myofasergröße 12,13, entzündliche Veränderungen und Ödeme¹⁴ sowie Bindegewebe und Fettgehalt ^15,16.

Mehrere andere nichtinvasive oder minimalinvasive Methoden werden auch verwendet, um die Muskelgesundheit bei Menschen und Tieren zu bewerten, einschließlich der Nadelelektromyographie¹⁷ und bildgebender Verfahren wie Magnetresonanztomographie, Computertomographie und Ultraschall^18,19. EIM zeigt jedoch deutliche Vorteile im Vergleich zu diesen Technologien. Zum Beispiel erfasst die Elektromyographie nur die aktiven elektrischen Eigenschaften der Myofasermembranen und nicht die passiven Eigenschaften und kann daher keine echte Beurteilung der Muskelzusammensetzung oder -struktur liefern. In gewisser Hinsicht sind bildgebende Verfahren enger mit EIM verwandt, da auch sie Aufschluss über die Struktur und Zusammensetzung von Gewebe geben. Aber in gewissem Sinne liefern sie zu viele Daten, die eine detaillierte Bildsegmentierung und Expertenanalyse erfordern, anstatt nur einen quantitativen Output zu liefern. Darüber hinaus werden bildgebende Verfahren aufgrund ihrer Komplexität auch stark von den Besonderheiten der verwendeten Hard- und Software beeinflusst, was im Idealfall die Verwendung identischer Systeme erfordert, damit Datensätze verglichen werden können. Im Gegensatz dazu bedeutet die Tatsache, dass EIM viel einfacher ist, dass es weniger von diesen technischen Problemen betroffen ist und keine Form von Bildverarbeitung oder Expertenanalyse erfordert.

Das folgende Protokoll zeigt, wie In-vivo-EIM bei Ratten und Mäusen durchgeführt wird, wobei sowohl nichtinvasive (Oberflächenarray) als auch minimalinvasive (subdermale Nadelarray) Techniken sowie ex vivo EIM an frisch herausgeschnittenen Muskeln angewendet werden.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Beth Israel Deaconess Medical Center unter den Protokollnummern (031-2019; 025-2019) genehmigt. Tragen Sie geeignete PSA-Ausrüstung für den Umgang mit Tieren und halten Sie sich an die IACUC-Richtlinien für alle Tierarbeiten.

1. In-vivo-Oberflächen-EIM

1. Legen Sie das Tier in eine Anästhesiebox, um eine Anästhesie einzuleiten.
   ANMERKUNG: Für Ratten wurden 1,5%-3,5% Isofluran und 2 O2L·min-1 und für Mäuse 2% Isofluran und 1_O2L·^min-1 verwendet.
2. Nach vollständiger Betäubung, wie durch das Ausbleiben der Reaktion nach dem Einklemmen des Fußes des Tieres angezeigt, legen Sie die Maus in Bauchlage auf die Bank und verwenden Sie den Nasenkegel, um die Anästhesie mit 1,5% Isofluran und einem Sauerstofffluss von 1 L·^min-1 aufrechtzuerhalten.
3. Platzieren Sie das zu analysierende Bein des Tieres in einem 45°-Winkel mit dem Hüftgelenk (Knie gestreckt) und sichern Sie den Fuß mit medizinischem Klebeband.
4. Verwenden Sie eine Haarschneidemaschine, um das Fell zu trimmen, das den Musculus gastrocnemius überlagert.
5. Tragen Sie eine dicke Schicht Enthaarungscreme auf die Haut des Tieres auf und lassen Sie es 1 Minute einwirken. Verwenden Sie dann salzhaltige Gaze, um das Enthaarungsmittel zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang bis zu dreimal, bis das gesamte Fell, das den Musculus gastrocnemius überlagert, entfernt ist.
   HINWEIS: Legen Sie ein mit Kochsalzlösung getränktes Mullkissen über die Haut, wenn keine Messungen durchgeführt werden, um eine Austrocknung der Haut zu verhindern.
6. Schließen Sie das Oberflächenarray (Abbildung 1) an das EIM-Gerät an, und lassen Sie die Elektroden auf einem in Kochsalzlösung getränkten Stück Gaze ruhen.
7. Platzieren Sie die Oberflächenanordnung direkt auf der Haut über dem Musculus gastrocnemius, längs orientiert zu den Muskelfasern.
8. Nach der Überprüfung des entsprechenden Kontakts, der durch alle grün erscheinenden Balken in der Software angezeigt wird, die die Stabilität der Widerstands-, Reaktanz- und Phasenwerte von 50 kHz anzeigen, erfassen Sie die EIM-Messungen.
   HINWEIS: Kurven sollten in Echtzeit überprüft werden, um eine ordnungsgemäße Datenerfassung zu gewährleisten.
9. Drehen Sie die Oberflächenanordnung um 90° und positionieren Sie sie auf der Haut über dem Gastrocnemius neu, um die Quermaße zu erhalten (prüfen Sie auf grüne Balken, die die Stabilität anzeigen).
10. Wiederholen Sie die Schritte 1.7, 1.8 und 1.9, um insgesamt vier Messungen pro Muskel zu erhalten: zwei Längs- und zwei Quermessungen.
    HINWEIS: Verwenden Sie ein Enthaarungsmittel nicht mehr als einmal (d. h. bis zu drei Anwendungen in derselben Instanz) alle zwei Wochen, um übermäßige Hautreizungen und Verletzungen zu vermeiden. Es ist wichtig, die Messungen innerhalb von etwa 5-10 Minuten nach dem Entfernen der Enthaarungscreme durchzuführen, da die Entwicklung von lokalisierten Hautödemen, die durch das Enthaarungsmittel induziert werden, die gesammelten Impedanzdaten beeinflussen kann. Die Erholung des Tieres erfolgt unmittelbar nach Beendigung der Isofluran-Anästhesie und das Verfahren erfordert keine analgetische Behandlung.

2. In-vivo-Nadelarray-EIM

1. Betäuben Sie das Tier und bereiten Sie das Bein nach dem gleichen Verfahren vor wie in den Schritten 1.1-1.4 beschrieben. Es ist jedoch nicht notwendig, ein Enthaarungsmittel zu verwenden, wenn in vivo EIM mit einem Nadelarray durchgeführt wird.
2. Schließen Sie das Nadelfeld (Abbildung 2A-F) an das EIM-Gerät an und lassen Sie es in einem Wiegeboot ruhen, das Kochsalzlösung enthält. Überprüfen Sie die Konnektivität und Signalstabilität (gekennzeichnet durch grüne Balken).
3. Desinfizieren Sie Haut und Nadeln mit Alkohol. Platzieren Sie die Nadelanordnung in einer Längsposition im Vergleich zu den Myofasern und drücken Sie sie fest in die Haut, bis alle Nadeln die Haut und den darunter liegenden Muskel bis zum Kunststoffschutz auf dem Array durchdringen. Erfassen von Daten.
4. Entfernen Sie das Array vorsichtig und führen Sie es in einem 90°-Winkel relativ zur ersten Messung in Querrichtung durch die Haut und wieder in den Muskel ein. Erfassen von Daten.
   HINWEIS: Bei Verwendung von Nadelarrays sollten Messungen nur einmal in jede Richtung durchgeführt werden, um den Einfluss der Nadelelektroden auf Haut und Muskelgewebe zu reduzieren. Wenn Blutungen auftreten, wischen Sie das Blut vorsichtig ab, bevor Sie die zweite Messung durchführen. Die Erholung des Tieres erfolgt unmittelbar nach Beendigung der Isofluran-Anästhesie und das Verfahren erfordert keine analgetische Behandlung.

3. Ex-vivo-EIM

1. Bereiten Sie die Ex-vivo-dielektrische Zelle vor (Abbildung 2G,H), geben Sie Kochsalzlösung in die Kammer und verbinden Sie die Zelle mit dem EIM-Gerät, um die Referenzwerte zu erhalten.
   HINWEIS: Die Phasen- und Reaktanzwerte der Kochsalzlösung sollten konstant bei oder nahe Null bleiben und die Widerstandswerte der Kochsalzlösung sollten bei etwa 100 ± 25 Ω über den Frequenzbereich von 1 kHz bis 1 MHz konstant bleiben.
2. Euthanasieren Sie das Tier gemäß den jeweiligen IACUC-Richtlinien.
3. Schneiden Sie mit einer Schere die Haut in der Nähe der Achillessehne ab. Ziehen Sie die Haut mit einer Pinzette nach oben, um die darunter liegenden Muskeln und Faszien freizulegen. Sezieren Sie vorsichtig den Bizeps femoris, der den Musculus gastrocnemius überlagert und den Ischiasnerv schneidet.
4. Schneiden Sie die Achillessehne ab, um das distale Ende der Muskeln Gastrocnemius und Soleus zu befreien, und ziehen Sie die Sehne vorsichtig nach oben, während Sie mit einer Schere alle Anhänge entfernen. Sobald alle Aufsätze entfernt sind, schneiden Sie mit einer Schere das rostrale Ende des Soleusmuskels ab und entfernen Sie es.
5. Verwenden Sie eine Schere, um die Köpfe des Musculus gastrocnemius um die Patella herum zu sezieren.
   HINWEIS: Nach der Entfernung des Musculus gastrocnemius ist es wichtig, sich an die ursprüngliche Ausrichtung der Myofasern zu erinnern.
6. Legen Sie den Gastrocnemius-Muskel auf eine Zahnwachsschicht und schneiden Sie ihn mit einer Rasierklinge und einem Lineal, um einen 10 mm x 10 mm großen Abschnitt von der Mitte des Musculus gastrocnemius zu erhalten.
   HINWEIS: Die dielektrische Zellengröße kann angepasst werden. Für Ratten wurde eine 10 mm x 10 mm Zelle und für Mäuse eine 5 mm x 5 mm Zelle verwendet.
7. Legen Sie den Gastrocnemius vorsichtig mit einer Pinzette in die dielektrischen Zellen und stellen Sie sicher, dass die Fasern längs ausgerichtet sind (d. H. Schwanz- und Rostralextremitäten sollten die Elektroden berühren). Stellen Sie sicher, dass der Muskel vollständig mit den Metallelektroden in Kontakt steht.
8. Befestigen Sie den oberen Teil der dielektrischen Zelle und führen Sie zwei Monopolnadeln (26 G) in die beiden Löcher ein. Verbinden Sie die Drähte des EIM-Geräts mit der Ex-vivo-Zelle in der folgenden Reihenfolge: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, wobei I für die Stromelektroden und V für die Spannungselektroden steht). Erfassen Sie die Längsschnittmessung.
9. Öffnen Sie die dielektrische Zelle und richten Sie den Muskel in Querrichtung neu aus, indem Sie ihn um 90° drehen. Befestigen Sie die Oberseite der dielektrischen Zelle wieder. Erfassen Sie die Quermessung.

Ergebnisse

EIM kann unter vielen Bedingungen erhalten werden, einschließlich Oberflächen-in-vivo-Arrays (Abbildung 1), Nadel-in-vivo-Arrays (Abbildung 2A-F) und Ex-vivo-dielektrischen Zellen (Abbildung 2G, H).

EIM liefert eine nahezu augenblickliche Momentaufnahme des Muskelzustands basierend auf den gemessenen Impedanzwerten. Die Messun...

Diskussion

In diesem Artikel werden die grundlegenden Methoden zur Durchführung von EIM bei Nagetieren sowohl in vivo als auch ex vivo beschrieben. Um zuverlässige Messungen zu erhalten, ist es wichtig, eine Reihe von Schritten durchzuführen. Zuerst muss man den Muskel von Interesse richtig identifizieren, da jeder Muskel unterschiedliche Reaktionen auf Krankheiten, Behandlung und Pathologie hat. Man muss bedenken, dass die Daten, die über einen Muskel (z. B. Gastrocnemius) erfasst wurden, nicht die gleichen I...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile