Realização de Miografia de Impedância Elétrica In Vivo e Ex Vivo em Roedores

Resumo

Este artigo detalha como realizar a miografia de impedância elétrica in vivo (usando matrizes de eletrodos de superfície e agulha) e ex vivo (usando uma célula dielétrica) no músculo gastrocnêmio de roedores. Ele demonstrará a técnica em camundongos e ratos e detalhará as modificações disponíveis (ou seja, animais obesos, filhotes).

Resumo

A miografia por impedância elétrica (EIM) é uma técnica conveniente que pode ser usada em estudos pré-clínicos e clínicos para avaliar a saúde e a doença do tecido muscular. O EIM é obtido aplicando uma corrente elétrica de baixa intensidade, direcionalmente focada, a um músculo de interesse em uma faixa de frequências (ou seja, de 1 kHz a 10 MHz) e registrando as tensões resultantes. A partir destes, vários componentes de impedância padrão, incluindo a reatância, resistência e fase, são obtidos. Ao realizar medições ex vivo no músculo excisado, as propriedades elétricas passivas inerentes do tecido, ou seja, a condutividade e a permissividade relativa, também podem ser calculadas. O MEI tem sido amplamente utilizado em animais e humanos para diagnosticar e rastrear alterações musculares em uma variedade de doenças, em relação à atrofia por simples desuso ou como medida de intervenção terapêutica. Clinicamente, o EIM oferece o potencial de rastrear a progressão da doença ao longo do tempo e avaliar o impacto das intervenções terapêuticas, oferecendo assim a oportunidade de encurtar a duração do ensaio clínico e reduzir os requisitos de tamanho da amostra. Como pode ser realizado de forma não invasiva ou minimamente invasiva em modelos animais vivos, bem como em humanos, o EIM oferece o potencial de servir como uma nova ferramenta translacional que permite o desenvolvimento pré-clínico e clínico. Este artigo fornece instruções passo a passo sobre como realizar medições de MEI in vivo e ex vivo em camundongos e ratos, incluindo abordagens para adaptar as técnicas a condições específicas, como para uso em filhotes ou animais obesos.

Introdução

A miografia por impedância elétrica (MEI) fornece um método poderoso para avaliar a condição muscular, potencialmente possibilitando o diagnóstico de distúrbios neuromusculares, o rastreamento da progressão da doença e a avaliação da resposta à terapia ^1,2,3. Pode ser aplicado de forma análoga a modelos de doenças animais e humanos, permitindo uma tradução relativamente perfeita de estudos pré-clínicos para clínicos. As medições do EIM são facilmente obtidas usando quatro eletrodos posicionados linearmente, com os dois externos aplicando uma corrente elétrica indolor e fraca em uma faixa de frequências (geralmente entre 1 kHz e aproximadamente 2 MHz), e os dois internos registrando as tensões resultantes¹. A partir dessas tensões, as características de impedância do tecido podem ser obtidas, incluindo a resistência (R), uma medida de quão difícil é para a corrente passar através do tecido, e a reatância (X) ou "carregabilidade" do tecido, uma medida relacionada à capacidade do tecido de armazenar carga (capacitância). A partir da reatância e resistência, o ângulo de fase (θ) é calculado através da seguinte equação: , fornecendo uma única medida de impedância somativa. Tais medições podem ser obtidas usando qualquer dispositivo de bioimpedância multifreqüência. Como as miofibras são essencialmente cilindros longos, o tecido muscular também é altamente anisotrópico, com corrente fluindo mais facilmente ao longo das fibras do que através delas ^4,5. Assim, o EIM é frequentemente realizado em duas direções: com a matriz colocada ao longo das fibras, de modo que a corrente corre paralela a elas, e através do músculo, de modo que a corrente flui perpendicularmente a elas. Além disso, em medições ex vivo, onde um volume conhecido de tecido é medido em uma célula de medição de impedância, as propriedades elétricas inerentes do músculo (ou seja, a condutividade e a permissividade relativa) podem ser derivadas⁶.

O termo "distúrbios neuromusculares" define uma ampla gama de doenças primárias e secundárias que levam à alteração e disfunção muscular estrutural. Isso inclui esclerose lateral amiotrófica e várias formas de distrofia muscular, bem como alterações mais simples relacionadas ao envelhecimento (por exemplo, sarcopenia), atrofia por desuso (por exemplo, devido a repouso prolongado ou microgravidade) ou mesmo lesão⁷. Embora as causas sejam abundantes e possam se originar do neurônio motor, nervos, junções neuromusculares ou do próprio músculo, o EIM pode ser usado para detectar alterações precoces no músculo devido a muitos desses processos e para rastrear a progressão ou a resposta à terapia. Por exemplo, em pacientes com distrofia muscular de Duchenne (DMD), a MEI demonstrou detectar a progressão da doença e a resposta aos corticosteroides⁸. Trabalhos recentes também mostraram que o MEI é sensível a diferentes estados de desuso, incluindo a gravidade fracionada⁹, como seria experimentado na Lua ou em Marte, e os efeitos do envelhecimento^10,11. Por fim, ao aplicar algoritmos preditivos e de machine learning ao conjunto de dados obtidos a cada medida (dados multifrequência e direcionais dependentes), torna-se possível inferir aspectos histológicos do tecido, incluindo tamanho da miofibra 12,13, alterações inflamatórias e edema 14, e tecido conjuntivo e teor de gordura ^15,16.

Vários outros métodos não invasivos ou minimamente invasivos também são utilizados para avaliar a saúde muscular em humanos e animais, incluindo eletromiografia por agulha¹⁷ e tecnologias de imagem, como ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultrassonografia^18,19. No entanto, o EIM demonstra benefícios distintos em comparação com essas tecnologias. Por exemplo, a eletromiografia registra apenas as propriedades elétricas ativas das membranas miofibras e não as propriedades passivas e, portanto, não pode fornecer uma avaliação verdadeira da composição ou estrutura muscular. Em certo aspecto, os métodos de imagem estão mais intimamente relacionados com o EIM, pois também fornecem informações sobre a estrutura e a composição do tecido. Mas, em certo sentido, eles fornecem muitos dados, exigindo segmentação detalhada de imagens e análise de especialistas, em vez de apenas fornecer uma saída quantitativa. Além disso, dadas as suas complexidades, as técnicas de imagem também são muito impactadas pelas especificidades do hardware e do software que estão sendo usados, idealmente exigindo o uso de sistemas idênticos para que os conjuntos de dados possam ser comparados. Em contraste, o fato de o EIM ser muito mais simples significa que ele é menos impactado por essas questões técnicas e não requer nenhuma forma de processamento de imagem ou análise especializada.

O protocolo a seguir demonstra como realizar EIM in vivo em ratos e camundongos, usando técnicas não invasivas (matriz de superfície) e minimamente invasivas (matriz de agulhas subdérmicas), bem como EIM ex vivo em músculo recém-excisado.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Beth Israel Deaconess Medical Center sob números de protocolo (031-2019; 025-2019). Use equipamentos de EPI adequados para lidar com animais e siga as diretrizes da IACUC para todo o trabalho com animais.

1. EIM de superfície in vivo

1. Coloque o animal em uma caixa de anestesia para induzir a anestesia.
   NOTA: Para ratos, foram utilizados isoflurano a 1,5%-3,5% e 2 O 2 L·min-1 e, para camundongos, isoflurano a 2% e 1 O₂ L·^min-1.
2. Uma vez totalmente anestesiado, como indicado pela ausência de resposta após beliscar o pé do animal, coloque o rato no banco em decúbito ventral e utilize o cone nasal para manter a anestesia com isoflurano a 1,5% e um fluxo de oxigênio de 1 L·^min-1.
3. Coloque a perna do animal a ser analisada em um ângulo de 45° com a articulação do quadril (joelho estendido) e prenda o pé com fita adesiva.
4. Use um cortador de cabelo para aparar a pele que sobrepõe o músculo gastrocnêmio.
5. Aplique uma camada espessa de creme depilatório sobre a pele do animal e deixe-o descansar por 1 min. Em seguida, use gaze saturada de solução salina para remover o agente depilatório. Repita este processo até três vezes até que toda a pele que sobrepõe o músculo gastrocnêmio seja removida.
   NOTA: Coloque uma gaze embebida em solução salina sobre a pele quando as medidas não estiverem sendo adquiridas para evitar a desidratação da pele.
6. Conecte a matriz de superfície (Figura 1) ao dispositivo EIM e deixe os eletrodos descansarem em um pedaço de gaze embebido em solução salina.
7. Coloque a matriz de superfície diretamente sobre a pele sobre o músculo gastrocnêmio, orientada longitudinalmente para as fibras musculares.
8. Após a verificação do contato apropriado, que é indicado por todas as barras que aparecem em verde no software mostrando a estabilidade dos valores de resistência, reatância e fase de 50 kHz, adquira as medidas do EIM.
   NOTA: As curvas devem ser verificadas em tempo real para garantir a aquisição adequada de dados.
9. Gire a matriz de superfície em 90° e reposicione-a na pele sobre o gastrocnêmio para obter as medidas transversais (verifique se há barras verdes indicando a estabilidade).
10. Repita as etapas 1,7, 1,8 e 1,9 para obter um total de quatro medidas por músculo: duas longitudinais e duas transversais.
    NOTA: Não use um agente depilatório mais de uma vez (ou seja, até três aplicações no mesmo caso) a cada duas semanas para evitar irritação excessiva da pele e lesões. É importante realizar as medidas dentro de cerca de 5-10 min após a remoção do creme depilatório, uma vez que o desenvolvimento de edema cutâneo localizado induzido pelo agente depilatório pode afetar os dados de impedância coletados. A recuperação animal é imediata após a interrupção da anestesia com isoflurano e o procedimento não requer tratamento analgésico.

2. Matriz de agulhas in vivo EIM

1. Anestesiar o animal e preparar a perna utilizando o mesmo procedimento descrito nos passos 1.1-1.4. No entanto, não é necessário usar um agente depilatório ao realizar EIM in vivo usando uma matriz de agulhas.
2. Conecte o conjunto de agulhas (Figura 2A-F) ao dispositivo EIM e deixe-o descansar em um barco de pesagem contendo solução salina. Verifique a conectividade e a estabilidade do sinal (indicadas por barras verdes).
3. Desinfete a pele e as agulhas com álcool. Coloque a matriz de agulhas em uma posição longitudinal em comparação com as miofibras e pressione-a firmemente na pele até que todas as agulhas penetrem na pele e no músculo subjacente até o protetor de plástico na matriz. Adquira dados.
4. Remova suavemente a matriz e reinsira-a através da pele e no músculo em um ângulo de 90° em relação à primeira medição, na direção transversal. Adquira dados.
   NOTA: Ao usar matrizes de agulhas, as medições só devem ser adquiridas uma vez em cada direção para reduzir o impacto dos eletrodos da agulha na pele e no tecido muscular. Se ocorrer sangramento, limpe suavemente o sangue antes de realizar a segunda medição. A recuperação animal é imediata após a interrupção da anestesia com isoflurano e o procedimento não requer tratamento analgésico.

3. EIM ex vivo

1. Preparar a célula dieléctrica ex vivo (Figura 2G,H), adicionar solução salina à câmara e ligar a célula ao dispositivo EIM para obter os valores de referência.
   NOTA: Os valores de fase e reatância da solução salina devem permanecer constantes em ou perto de zero e os valores de resistência da solução salina devem permanecer constantes em aproximadamente 100 ± 25 Ω na faixa de frequência de 1 kHz a 1 MHz.
2. Eutanasiar o animal de acordo com as respectivas diretrizes da IACUC.
3. Usando um par de tesouras, corte a pele perto do tendão de Aquiles. Usando pinças, puxe a pele em um movimento ascendente para revelar os músculos subjacentes e a fáscia. Disseque suavemente o bíceps femoral que recobre o músculo gastrocnêmio e corte o nervo ciático.
4. Corte o tendão de Aquiles para liberar a extremidade distal dos músculos gastrocnêmio e sóleo e puxe suavemente o tendão para cima enquanto usa uma tesoura para remover quaisquer acessórios. Uma vez que todos os anexos são removidos, use uma tesoura para cortar a extremidade rostral do músculo sóleo e removê-lo.
5. Use uma tesoura para dissecar as cabeças do músculo gastrocnêmio ao redor da patela.
   NOTA: Após a remoção do músculo gastrocnêmio, é importante lembrar a orientação original das miofibras.
6. Coloque o músculo gastrocnêmio em uma folha de cera dentária e separe-o usando uma lâmina de barbear e uma régua para obter uma seção de 10 mm x 10 mm do centro do músculo gastrocnêmio.
   NOTA: O tamanho da célula dielétrica pode ser personalizado. Para os ratos, foi utilizada uma célula de 10 mm x 10 mm e, para os camundongos, uma célula de 5 mm x 5 mm.
7. Usando uma pinça, coloque suavemente o gastrocnêmio nas células dielétricas, certificando-se de que as fibras estejam orientadas longitudinalmente (ou seja, as extremidades caudais e rostral devem estar tocando os eletrodos). Certifique-se de que o músculo está totalmente em contato com os eletrodos de metal.
8. Anexe a parte superior da célula dielétrica e insira duas agulhas monopolares (26 G) nos dois orifícios. Conecte os fios do dispositivo EIM à célula ex vivo na seguinte ordem: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, onde I representa os eletrodos de corrente e V representa os eletrodos de tensão). Adquira a medida longitudinal.
9. Abra a célula dielétrica e reoriente o músculo na direção transversal, girando-o 90°. Reconecte a parte superior da célula dielétrica. Adquira a medida transversal.

Resultados

O EIM pode ser obtido em muitas condições, incluindo matrizes de superfície in vivo (Figura 1), matrizes de agulha in vivo (Figura 2A-F) e células dielétricas ex vivo (Figura 2G,H).

O EIM fornece um instantâneo quase instantâneo da condição muscular com base nos valores de impedância medidos. As medições são adquiri...

Discussão

Este artigo fornece os métodos básicos para a realização de EIM em roedores, tanto in vivo quanto ex vivo. Para adquirir medições confiáveis, é fundamental executar uma série de etapas. Primeiro, é preciso identificar adequadamente o músculo de interesse, pois cada músculo terá respostas diferentes a doenças, tratamento e patologia. Deve-se estar ciente de que os dados adquiridos em um músculo (por exemplo, gastrocnêmio) não fornecerão as mesmas informações que em outro músculo (por...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile