ביצוע מיוגרפיה של עכבה חשמלית In Vivo ו - Ex Vivo במכרסמים

Summary

מאמר זה מפרט כיצד לבצע in vivo (באמצעות מערכי אלקטרודות משטח ומחט) ו- ex vivo (באמצעות תא דיאלקטרי) מיופיוגרפיה של עכבה חשמלית על שריר גסטרוקנמיוס המכרסמים. הוא ידגים את הטכניקה הן בעכברים והן בחולדות ויפרט את השינויים הזמינים, (כלומר, בעלי חיים שמנים, גורים).

Abstract

מיוגרפיה של עכבה חשמלית (EIM) היא טכניקה נוחה שניתן להשתמש בה במחקרים פרה-קליניים וקליניים להערכת בריאות ומחלות של רקמות שריר. EIM מתקבל על ידי הפעלת זרם חשמלי בעוצמה נמוכה, ממוקד כיוון, על שריר בעל עניין על פני טווח של תדרים (כלומר, מ 1 kHz עד 10 MHz) ורישום המתחים המתקבלים. מאלה מתקבלים מספר רכיבי עכבה סטנדרטיים, כולל התגובה, ההתנגדות והפאזה. בעת ביצוע מדידות ex vivo על שריר נכרת, ניתן לחשב גם את התכונות החשמליות הפסיביות הטבועות ברקמה, כלומר המוליכות וההיתר היחסי. EIM נמצא בשימוש נרחב בבעלי חיים ובבני אדם כדי לאבחן ולעקוב אחר שינויים בשרירים במגוון מחלות, ביחס לאטרופיה פשוטה, או כמדד להתערבות טיפולית. מבחינה קלינית, EIM מציע את הפוטנציאל לעקוב אחר התקדמות המחלה לאורך זמן ולהעריך את ההשפעה של התערבויות טיפוליות, ובכך להציע את ההזדמנות לקצר את משך הניסוי הקליני ולהפחית את דרישות גודל הדגימה. מכיוון שניתן לבצע אותו באופן לא פולשני או זעיר פולשני במודלים של בעלי חיים חיים כמו גם בבני אדם, EIM מציע את הפוטנציאל לשמש ככלי תרגום חדשני המאפשר פיתוח פרה-קליני וקליני כאחד. מאמר זה מספק הוראות שלב אחר שלב כיצד לבצע מדידות in vivo ו- ex vivo EIM בעכברים ובחולדות, כולל גישות להתאמת הטכניקות לתנאים ספציפיים, כגון לשימוש בגורים או בבעלי חיים שמנים.

Introduction

מיוגרפיה של עכבה חשמלית (EIM) מספקת שיטה רבת עוצמה להערכת מצב השרירים, ועשויה לאפשר אבחון של הפרעות נוירומוסקולריות, מעקב אחר התקדמות המחלה והערכת התגובה לטיפול ^1,2,3. ניתן ליישם אותו באופן אנלוגי למודלים של מחלות בעלי חיים ולבני אדם, מה שמאפשר תרגום חלק יחסית ממחקרים פרה-קליניים למחקרים קליניים. מדידות EIM מתקבלות בקלות באמצעות ארבע אלקטרודות הממוקמות באופן ליניארי, כאשר שתי החיצוניות מפעילות זרם חשמלי חלש ללא כאבים בטווח תדרים (בדרך כלל בין 1 קילוהרץ לכ-2 מגה-הרץ), ושתי הפנימיות רושמות את המתחים המתקבלים¹. ממתחים אלה ניתן לקבל את מאפייני העכבה של הרקמה, כולל ההתנגדות (R), מדד של כמה קשה לזרם לעבור דרך הרקמה, והתגובה (X) או "הטעינה" של הרקמה, מדד הקשור ליכולת של הרקמה לאחסן מטען (קיבוליות). מהתגובה וההתנגדות, זווית הפאזה (θ) מחושבת באמצעות המשוואה הבאה: , המספקת מידה אחת של עכבה מסכמת. מדידות כאלה ניתן להשיג באמצעות כל מכשיר bioimpedance רב תדרים. מכיוון שמיופייברים הם למעשה גלילים ארוכים, רקמת השריר היא גם אניזוטרופית מאוד, עם זרם זורם בקלות רבה יותר לאורך סיבים מאשר על פניהם ^4,5. לפיכך, EIM מבוצע לעתים קרובות בשני כיוונים: כאשר המערך ממוקם לאורך הסיבים כך שהזרם פועל במקביל אליהם, ולרוחב השריר כך שהזרם זורם בניצב אליהם. בנוסף, מדידות in ex vivo, שבהן נפח ידוע של רקמה נמדד בתא מדידת עכבה, ניתן לגזור את התכונות החשמליות הטבועות בשריר (כלומר המוליכות וההיתר היחסי),⁶.

המונח "הפרעות נוירומוסקולריות" מגדיר מגוון רחב של מחלות ראשוניות ומשניות המובילות לשינוי מבניים בשרירים ולתפקוד לקוי. זה כולל טרשת אמיוטרופית צידית וצורות שונות של ניוון שרירים, כמו גם שינויים פשוטים יותר הקשורים להזדקנות (למשל, סרקופניה), ניוון דיס-שימוש (למשל, עקב משענת מיטה ממושכת או מיקרו-כבידה) או אפילו פציעה⁷. בעוד שהסיבות הן בשפע ויכולות לנבוע מהנוירון המוטורי, העצבים, הצמתים העצביים-שריריים או השריר עצמו, ניתן להשתמש ב- EIM כדי לזהות שינויים מוקדמים בשריר עקב רבים מהתהליכים הללו ולעקוב אחר התקדמות או תגובה לטיפול. לדוגמה, בחולים עם ניוון שרירים דושן (DMD), הוכח כי EIM מזהה התקדמות המחלה ותגובתה לקורטיקוסטרואידים⁸. עבודות אחרונות הראו גם ש-EIM רגיש למצבי דיס-שימוש משתנים, כולל כבידה חלקית⁹, כפי שחווים על הירח או על מאדים, וההשפעות של הזדקנות^10,11. לבסוף, על ידי החלת אלגוריתמים של חיזוי ולמידת מכונה על מערך הנתונים המתקבל עם כל מדידה (נתונים בתדירות גבוהה ותלויי כיוון), ניתן להסיק היבטים היסטולוגיים של הרקמה, כולל גודל מיופייבר 12,13, שינויים דלקתיים ובצקת¹⁴, ותכולת רקמת חיבור ושומן ^15,16.

מספר שיטות לא פולשניות אחרות או פולשניות מינימליות משמשות גם להערכת בריאות השרירים בבני אדם ובבעלי חיים, כולל אלקטרומיוגרפיה של מחט¹⁷ וטכנולוגיות הדמיה כגון הדמיית תהודה מגנטית, טומוגרפיה ממוחשבת ואולטרסאונד^18,19. עם זאת, EIM מדגים יתרונות מובהקים בהשוואה לטכנולוגיות אלה. לדוגמה, אלקטרומיוגרפיה מתעדת רק את התכונות החשמליות הפעילות של קרומי המיופייבר ולא את התכונות הפסיביות, ולכן אינה יכולה לספק הערכה אמיתית של הרכב או מבנה השרירים. במובן מסוים, שיטות הדמיה קשורות קשר הדוק יותר EIM, שכן גם הם מספקים מידע על המבנה וההרכב של רקמות. אבל במובן מסוים, הם מספקים יותר מדי נתונים, ודורשים סגמנטציה מפורטת של תמונות וניתוח מומחים ולא רק מספקים פלט כמותי. יתר על כן, בהתחשב במורכבות שלהם, טכניקות הדמיה מושפעות מאוד גם מהפרטים של החומרה והתוכנה שבשימוש, באופן אידיאלי דורשות שימוש במערכות זהות כך שניתן להשוות בין מערכי נתונים. לעומת זאת, העובדה ש- EIM הוא הרבה יותר פשוט פירושה שהוא פחות מושפע מבעיות טכניות אלה ואינו דורש כל צורה של עיבוד תמונה או ניתוח מומחה.

הפרוטוקול הבא מדגים כיצד לבצע in vivo EIM בחולדות ובעכברים, תוך שימוש הן בטכניקות לא פולשניות (מערך פני השטח) והן בטכניקות זעיר פולשניות (מערך מחטים תת-עורי), כמו גם ex vivo EIM על שריר שזה עתה נכרת.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של המרכז הרפואי בית ישראל תחת מספרי פרוטוקול (031-2019; 025-2019). יש ללבוש ציוד PPE מתאים לטיפול בבעלי חיים ולציית להנחיות IACUC לכל עבודה עם בעלי חיים.

1. משטח In vivo EIM

1. הניחו את בעל החיים בקופסת הרדמה כדי לגרום להרדמה.
   הערה: עבור חולדות נעשה שימוש ב-1.5%-3.5% איזופלוראן ו-2 O 2 L·min-1, ובעכברים נעשה שימוש ב-2% איזופלוראן וב-1 O₂ L·^min-1.
2. לאחר הרדמה מלאה, כפי שצוין על ידי היעדר תגובה לאחר צביטה של כף הרגל של החיה, להניח את העכבר על הספסל במצב נוטה ולהשתמש חרוט האף כדי לשמור על הרדמה באמצעות 1.5% isoflurane וזרימת חמצן של 1 L·^min-1.
3. הניחו את רגל החיה לניתוח בזווית של 45° עם מפרק הירך (הברך מורחבת) והדקו את כף הרגל באמצעות סרט רפואי.
4. השתמש קוצץ שיער כדי לקצץ את הפרווה מעל כיסוי שריר gastrocnemius.
5. החל שכבה עבה של קרם דפילציה על העור של החיה ולתת לו לשבת במשך 1 דקות. לאחר מכן, השתמש גזה רוויה מלוחים כדי להסיר את סוכן depilatory. חזור על תהליך זה עד שלוש פעמים עד שכל הפרווה מעל שריר gastrocnemius מוסר.
   הערה: יש להניח כרית גזה ספוגה במי מלח על העור כאשר לא נרכשות מדידות למניעת התייבשות העור.
6. חבר את מערך פני השטח (איור 1) להתקן EIM ותן לאלקטרודות לנוח על חתיכת גזה ספוגה בתמיסת מלח.
7. הניחו את מערך פני השטח ישירות על העור מעל שריר הגסטרוקנמיוס, בכיוון אורך לסיבי השריר.
8. לאחר בדיקת מגע מתאים, המסומן על ידי כל הפסים המופיעים בירוק בתוכנה המציגים את יציבות ההתנגדות, התגובה וערכי הפאזה של 50 קילוהרץ, רכשו את מדידות ה- EIM.
   הערה: יש לבדוק עקומות בזמן אמת כדי להבטיח רכישת נתונים נאותה.
9. סובבו את מערך פני השטח ב-90° והניחו אותו מחדש על העור מעל הגסטרוקנמיוס כדי לקבל את המדידות הרוחביות (בדקו אם קיימים פסים ירוקים המעידים על יציבות).
10. חזור על שלבים 1.7, 1.8 ו- 1.9 כדי לקבל בסך הכל ארבע מדידות לכל שריר: שתיים אורכיות ושתיים רוחביות.
    הערה: אין להשתמש בחומר דפילציה יותר מפעם אחת (כלומר, עד שלושה מריחות באותו מקרה) כל שבועיים כדי למנוע גירוי ופציעה מוגזמים בעור. חשוב לבצע את המדידות תוך כ-5-10 דקות מהסרת קרם הדפילציה, שכן התפתחות בצקת מקומית בעור המושרה על ידי הגורם הדפילטורי עלולה להשפיע על נתוני העכבה שנאספו. התאוששות בעלי חיים היא מיד לאחר הפסקת הרדמה isoflurane ואת ההליך אינו דורש טיפול משכך כאבים.

2. מערך מחטים In vivo EIM

1. הרדימו את החיה והכינו את הרגל באותו הליך כמתואר בשלבים 1.1-1.4. עם זאת, אין צורך להשתמש בסוכן depilatory בעת ביצוע in vivo EIM באמצעות מערך מחטים.
2. חבר את מערך המחטים (איור 2A-F) להתקן EIM ותן לו לנוח בסירת שקילה המכילה תמיסת מלח. בדוק קישוריות ויציבות אות (מסומנים בפסים ירוקים).
3. לחטא את העור והמחטים עם אלכוהול. מניחים את מערך המחטים בתנוחה אורכית בהשוואה למיופייבר ולוחצים אותו בחוזקה לתוך העור עד שכל המחטים חודרות לעור ולשריר שמתחתיו עד למגן הפלסטיק במערך. השגת נתונים.
4. הסירו בעדינות את המערך והכניסו אותו מחדש דרך העור ולתוך השריר בזווית של 90° ביחס למדידה הראשונה, בכיוון הרוחבי. השגת נתונים.
   הערה: בעת שימוש במערכי מחטים, יש לבצע מדידות פעם אחת בלבד לכל כיוון כדי להפחית את ההשפעה של אלקטרודות המחט על העור ורקמת השריר. אם מתרחש דימום, נגבו בעדינות את הדם לפני ביצוע המדידה השנייה. התאוששות בעלי חיים היא מיד לאחר הפסקת הרדמה isoflurane ואת ההליך אינו דורש טיפול משכך כאבים.

3. Ex vivo EIM

1. הכן את התא הדיאלקטרי ex vivo (איור 2G,H), הוסף תמיסת מלח לתא וחבר את התא להתקן EIM כדי לקבל את ערכי הייחוס.
   הערה: ערכי הפאזה והתגובה של מי מלח צריכים להישאר קבועים באפס או קרוב אליו, וערכי ההתנגדות של מי מלח צריכים להישאר קבועים בערך 100 ± 25 Ω בטווח התדרים שבין 1 קילוהרץ ל-1 מגה-הרץ.
2. להרדים את בעל החיים בהתאם להנחיות IACUC המתאימות.
3. בעזרת זוג מספריים, חותכים את העור ליד גיד אכילס. באמצעות פינצטה, משכו את העור בתנועה כלפי מעלה כדי לחשוף את השרירים והחיתולית שמתחת. נתחו בעדינות את שרירי הזרוע פמוריס מעל שריר הגסטרוקנמיוס וחתכו את העצב הסיאטי.
4. חותכים את גיד אכילס כדי לשחרר את הקצה הדיסטלי של שרירי הגסטרוקנמיוס והסולאוס ומושכים בעדינות את הגיד כלפי מעלה תוך שימוש במספריים להסרת כל חיבור. לאחר הסרת כל הקבצים המצורפים, השתמש במספריים כדי לחתוך את הקצה הרוסטרלי של שריר הסולאוס ולהסיר אותו.
5. השתמש מספריים כדי לנתח את הראשים של שריר gastrocnemius סביב patella.
   הערה: לאחר הסרת שריר הגסטרוקנמיוס, חשוב לזכור את הכיוון המקורי של המיופייבר.
6. מניחים את שריר הגסטרוקנמיוס על יריעה של שעווה דנטלית וחותכים אותו באמצעות סכין גילוח וסרגל כדי לקבל חתך של 10 מ"מ x 10 מ"מ ממרכז שריר הגסטרוקנמיוס.
   הערה: ניתן להתאים אישית את גודל התא הדיאלקטרי. עבור חולדות נעשה שימוש בתא של 10 מ"מ x 10 מ"מ ועבור עכברים נעשה שימוש בתא של 5 מ"מ x 5 מ"מ.
7. בעזרת פינצטה, הניחו בעדינות את הגסטרוקנמיוס בתאים הדיאלקטריים, וודאו שהסיבים מכוונים לאורך (כלומר, גפיים קאודליות ורוסטרליות צריכות לגעת באלקטרודות). ודא כי השריר נמצא במגע מלא עם אלקטרודות המתכת.
8. חברו את החלק העליון של התא הדיאלקטרי והכניסו שתי מחטים מונופולריות (26 גרם) לשני החורים. חבר את החוטים מהתקן EIM לתא ex vivo בסדר הבא: (1: I +, 2: V+, 3: V-, 4: I-, כאשר I מייצג את אלקטרודות הזרם ו- V מייצג את אלקטרודות המתח). לרכוש את המדידה האורך.
9. פתח את התא הדיאלקטרי וכיוון מחדש של השריר בכיוון הרוחבי על ידי סיבובו ב-90°. חברו מחדש את החלק העליון של התא הדיאלקטרי. לרכוש את המדידה הרוחבית.

תוצאות

ניתן להשיג EIM בתנאים רבים, כולל מערכי פני שטח in vivo (איור 1), מערכי מחט in vivo (איור 2A-F) ותאים דיאלקטריים ex vivo (איור 2G,H).

EIM מספק תמונת מצב כמעט מיידית של מצב השרירים בהתבסס על ערכי העכבה שנמדד...

Discussion

מאמר זה מספק את השיטות הבסיסיות לביצוע EIM במכרסמים, הן in vivo והן ex vivo. כדי להשיג מדידות אמינות, זה קריטי לבצע סדרה של צעדים. ראשית, יש לזהות כראוי את שריר העניין, שכן לכל שריר יהיו תגובות שונות למחלות, טיפול ופתולוגיה. יש לשים לב שהנתונים הנרכשים על שריר אחד (למשל, גסטרוקנמיוס) לא יספקו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile