Kemirgenlerde In Vivo ve Ex Vivo Elektriksel Empedans Miyografisi Gerçekleştirme

Özet

Bu makalede, kemirgen gastroknemius kası üzerinde in vivo (yüzey ve iğne elektrot dizileri kullanılarak) ve ex vivo (dielektrik hücre kullanılarak) elektriksel empedans miyografisinin nasıl yapılacağı açıklanmaktadır. Hem farelerde hem de sıçanlarda tekniği gösterecek ve mevcut modifikasyonları detaylandıracak (yani, obez hayvanlar, yavrular).

Özet

Elektriksel empedans miyografisi (EIM), kas dokusu sağlığını ve hastalığını değerlendirmek için klinik öncesi ve klinik çalışmalarda kullanılabilecek uygun bir tekniktir. EIM, bir frekans aralığında (yani, 1 kHz'den 10 MHz'e) ilgi duyulan bir kasın içine düşük yoğunluklu, yön odaklı bir elektrik akımı uygulanarak ve elde edilen voltajların kaydedilmesiyle elde edilir. Bunlardan, reaktans, direnç ve faz dahil olmak üzere çeşitli standart empedans bileşenleri elde edilir. Eksize kas üzerinde ex vivo ölçümler yapılırken, dokunun doğal pasif elektriksel özellikleri, yani iletkenlik ve göreceli geçirgenlik de hesaplanabilir. EIM, hayvanlarda ve insanlarda, çeşitli hastalıklardaki kas değişikliklerini teşhis etmek ve izlemek için, basit kullanım atrofisi ile ilgili olarak veya terapötik müdahalenin bir ölçüsü olarak yaygın olarak kullanılmıştır. Klinik olarak, EIM zaman içinde hastalığın ilerlemesini izleme ve terapötik müdahalelerin etkisini değerlendirme potansiyeli sunar, böylece klinik çalışma süresini kısaltma ve örneklem büyüklüğü gereksinimlerini azaltma fırsatı sunar. Canlı hayvan modellerinde ve insanlarda noninvaziv veya minimal invaziv olarak gerçekleştirilebildiği için, EIM hem klinik öncesi hem de klinik gelişimi sağlayan yeni bir translasyonel araç olarak hizmet etme potansiyeli sunmaktadır. Bu makalede, farelerde ve sıçanlarda in vivo ve ex vivo EIM ölçümlerinin nasıl gerçekleştirileceğine ilişkin adım adım talimatlar, teknikleri yavrularda veya obez hayvanlarda kullanım gibi belirli koşullara uyarlama yaklaşımları da dahil olmak üzere sunulmaktadır.

Giriş

Elektriksel empedans miyografisi (EIM), kas durumunu değerlendirmek, potansiyel olarak nöromüsküler bozuklukların teşhisini, hastalık progresyonunun izlenmesini ve tedaviye yanıtın değerlendirilmesini sağlayan güçlü bir yöntem sağlar ^1,2,3. Hayvan hastalığı modellerine ve insanlara benzer şekilde uygulanabilir ve klinik öncesi çalışmalardan klinik çalışmalara nispeten sorunsuz bir çeviri sağlar. EIM ölçümleri, doğrusal olarak yerleştirilmiş dört elektrot kullanılarak kolayca elde edilir; iki dış elektrot, bir frekans aralığında (genellikle 1 kHz ile yaklaşık 2 MHz arasında) ağrısız, zayıf bir elektrik akımı uygular ve iki iç elektrot ortaya çıkan voltajları kaydeder¹. Bu voltajlardan, dokunun empedans özellikleri, akımın dokudan geçmesinin ne kadar zor olduğunun bir ölçüsü olan direnç ( R ) ve dokunun reaktansı (X) veya "yüklenebilirliği" de dahil olmak üzere elde edilebilir. Reaktans ve dirençten, faz açısı (θ) aşağıdaki denklemle hesaplanır: , tek bir toplam empedans ölçüsü sağlar. Bu tür ölçümler herhangi bir çok frekanslı biyoempedans cihazı kullanılarak elde edilebilir. Miyolifler esasen uzun silindirler olduğundan, kas dokusu da oldukça anizotropiktir, akım lifler boyunca onlardan daha kolay akar ^4,5. Bu nedenle, EIM genellikle iki yönde gerçekleştirilir: dizi, lifler boyunca, akımın onlara paralel olarak akacağı şekilde ve kas boyunca, akımın kendilerine dik olarak akacağı şekilde yerleştirilir. Ek olarak, bir empedans ölçüm hücresinde bilinen bir doku hacminin ölçüldüğü ex vivo ölçümlerde, kasın doğal elektriksel özellikleri (yani iletkenlik ve göreceli geçirgenlik) türetilebilir⁶.

"Nöromüsküler bozukluklar" terimi, yapısal kas değişikliği ve disfonksiyonuna yol açan çok çeşitli birincil ve ikincil hastalıkları tanımlar. Bu, amiyotrofik lateral skleroz ve çeşitli kas distrofisi formlarının yanı sıra yaşlanma (örneğin, sarkopeni), kullanılmama atrofisi (örneğin, uzun süreli yatak istirahati veya mikro yerçekimi nedeniyle) ve hatta yaralanma⁷ ile ilgili daha basit değişiklikleri içerir. Nedenler bol olsa da ve motor nöron, sinirler, nöromüsküler kavşaklar veya kasın kendisinden kaynaklanabilse de, EIM, bu süreçlerin çoğuna bağlı olarak kastaki erken değişiklikleri tespit etmek ve ilerlemeyi veya tedaviye yanıtı izlemek için kullanılabilir. Örneğin, Duchenne musküler distrofisi (DMD) olan hastalarda, EIM'nin hastalığın ilerlemesini ve kortikosteroidlere yanıtı tespit ettiği gösterilmiştir⁸. Son zamanlarda yapılan çalışmalar ayrıca, EIM'nin, Ay veya Mars'ta yaşanacağı gibi kesirli yerçekimi^{9 ve yaşlanmanın} etkileri de dahil olmak üzere değişen kullanım dışı durumlara duyarlı olduğunu ^{göstermiştir.} Son olarak, her ölçümle elde edilen veri setine (çok frekanslı ve yönlü bağımlı veriler) öngörücü ve makine öğrenmesi algoritmaları uygulayarak, miyofiber boyutu 12,13, enflamatuar değişiklikler ve ödem 14 ve bağ dokusu ve yağ içeriği ^15,16 dahil olmak üzere dokunun histolojik yönlerini çıkarmak mümkün hale gelir.

İğne elektromiyografisi 17 ve manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı tomografi ve ultrason^18,19 gibi görüntüleme teknolojileri de dahil olmak üzere insanlarda ve hayvanlarda kas sağlığını değerlendirmek için diğer birçok noninvaziv veya minimal invaziv yöntem de kullanılmaktadır. Bununla birlikte, EIM bu teknolojilerle karşılaştırıldığında farklı faydalar göstermektedir. Örneğin, elektromiyografi pasif özellikleri değil, sadece miyofiber membranların aktif elektriksel özelliklerini kaydeder ve bu nedenle kas bileşiminin veya yapısının gerçek bir değerlendirmesini sağlayamaz. Belli bir açıdan, görüntüleme yöntemleri de dokunun yapısı ve bileşimi hakkında bilgi sağladıkları için EIM ile daha yakından ilişkilidir. Ancak bir anlamda, sadece nicel bir çıktı sağlamak yerine ayrıntılı görüntü segmentasyonu ve uzman analizi gerektiren çok fazla veri sağlarlar. Dahası, karmaşıklıkları göz önüne alındığında, görüntüleme teknikleri hem kullanılan donanım hem de yazılımın özelliklerinden de büyük ölçüde etkilenir ve ideal olarak veri kümelerinin karşılaştırılabilmesi için aynı sistemlerin kullanılmasını gerektirir. Buna karşılık, EIM'nin çok daha basit olması, bu teknik sorunlardan daha az etkilendiği ve herhangi bir görüntü işleme veya uzman analizi gerektirmediği anlamına gelir.

Aşağıdaki protokol, hem noninvaziv (yüzey dizisi) hem de minimal invaziv (subdermal iğne dizisi) tekniklerin yanı sıra taze eksize edilmiş kas üzerinde ex vivo EIM kullanılarak sıçanlarda ve farelerde in vivo EIM'nin nasıl gerçekleştirileceğini göstermektedir.

Protokol

Burada açıklanan tüm yöntemler, Beth Israel Deaconess Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından protokol numaraları altında onaylanmıştır (031-2019; 025-2019). Hayvanları idare etmek için uygun KKD ekipmanı giyin ve tüm hayvan işleri için IACUC kurallarına uyun.

1. In vivo yüzey EIM

1. Anesteziyi indüklemek için hayvanı bir anestezi kutusuna yerleştirin.
   NOT: Sıçanlar için %1.5-%3.5 izofluran ve 2 O 2 L·min-1, fareler için ise %₂ izofluran ve 1_O2 L·^min-1 kullanılmıştır.
2. Tamamen anestezi uygulandıktan sonra, hayvanın ayağını sıkıştırdıktan sonra yanıt yokluğu ile belirtildiği gibi, fareyi tezgahın üzerine yüzüstü bir pozisyonda yerleştirin ve% 1.5 izofluran ve 1 L · ^min-1 oksijen akışı kullanarak anesteziyi sürdürmek için burun konisini kullanın.
3. Analiz edilecek hayvanın bacağını kalça eklemi (diz uzatılmış) ile 45° açıyla yerleştirin ve ayağı tıbbi bantla sabitleyin.
4. Gastroknemius kasını kaplayan kürkü kesmek için bir saç kesme makinesi kullanın.
5. Hayvanın derisine kalın bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın ve 1 dakika bekletin. Daha sonra, tüy dökücü maddeyi çıkarmak için tuzlu doymuş gazlı bez kullanın. Gastroknemius kasını kaplayan tüm kürk çıkarılana kadar bu işlemi üç defaya kadar tekrarlayın.
   NOT: Cilt dehidrasyonunu önlemek için ölçümler alınmadığında cildin üzerine tuzlu suya batırılmış bir gazlı bez pedi yerleştirin.
6. Yüzey dizisini (Şekil 1) EIM cihazına bağlayın ve elektrotların tuzlu su çözeltisine batırılmış bir gazlı bez parçası üzerinde durmasına izin verin.
7. Yüzey dizisini doğrudan gastroknemius kası üzerinden, kas liflerine uzunlamasına yönlendirilmiş olarak cilde yerleştirin.
8. Yazılımda 50 kHz direnç, reaktans ve faz değerlerinin kararlılığını gösteren yeşil görünen tüm çubuklarla gösterilen uygun teması kontrol ettikten sonra, EIM ölçümlerini alın.
   NOT: Doğru veri alımını sağlamak için eğriler gerçek zamanlı olarak kontrol edilmelidir.
9. Yüzey dizisini 90 ° döndürün ve enine ölçümleri elde etmek için gastroknemius üzerinde cilt üzerinde yeniden konumlandırın (stabiliteyi gösteren yeşil çubukları kontrol edin).
10. Kas başına toplam dört ölçüm elde etmek için 1.7, 1.8 ve 1.9 adımlarını tekrarlayın: iki uzunlamasına ve iki enine.
    NOT: Aşırı cilt tahrişini ve yaralanmasını önlemek için her iki haftada bir tüy dökücü ajanı birden fazla kez (yani, aynı durumda en fazla üç uygulama) kullanmayın. Tüy dökücü kremin çıkarılmasından yaklaşık 5-10 dakika sonra ölçümlerin yapılması önemlidir, çünkü tüy dökücü ajan tarafından indüklenen lokalize cilt ödeminin gelişmesi toplanan empedans verilerini etkileyebilir. İzofluran anestezisini durdurduktan hemen sonra hayvan iyileşmesi gerçekleşir ve prosedür analjezik tedavi gerektirmez.

2. In vivo iğne dizisi EIM

1. Hayvanı anestezi altına alın ve bacağı adım 1.1-1.4'te açıklandığı gibi aynı prosedürü kullanarak hazırlayın. Bununla birlikte, bir iğne dizisi kullanarak in vivo EIM gerçekleştirirken bir tüy dökücü ajan kullanmak gerekli değildir.
2. İğne dizisini (Şekil 2A-F) EIM cihazına bağlayın ve tuzlu su çözeltisi içeren bir tartım teknesinde dinlendirin. Bağlantı ve sinyal kararlılığını kontrol edin (yeşil çubuklarla gösterilir).
3. Cildi ve iğneleri alkolle dezenfekte edin. İğne dizisini miyoliflere kıyasla uzunlamasına bir pozisyona yerleştirin ve tüm iğneler cilde ve altta yatan kaslara dizi üzerindeki plastik koruyucuya kadar nüfuz edene kadar cilde sıkıca bastırın. Veri alın.
4. Dizgeyi nazikçe çıkarın ve enine yönde, ilk ölçüme göre 90°'lik bir açıyla deriden ve kasın içine tekrar yerleştirin. Veri alın.
   NOT: İğne dizileri kullanılırken, iğne elektrotlarının cilt ve kas dokusu üzerindeki etkisini azaltmak için ölçümler her yönde yalnızca bir kez alınmalıdır. Kanama meydana gelirse, ikinci ölçümü yapmadan önce kanı nazikçe silin. İzofluran anestezisini durdurduktan hemen sonra hayvan iyileşmesi gerçekleşir ve prosedür analjezik tedavi gerektirmez.

3. Ex vivo EIM

1. Ex vivo dielektrik hücreyi hazırlayın (Şekil 2G, H), odaya tuzlu su çözeltisi ekleyin ve referans değerleri elde etmek için hücreyi EIM cihazına bağlayın.
   NOT: Salinin faz ve reaktans değerleri sıfırda veya sıfıra yakın sabit kalmalı ve salinin direnç değerleri 1 kHz ila 1 MHz frekans aralığında yaklaşık 100 ± 25 Ω sabit kalmalıdır.
2. Hayvanı ilgili IACUC kurallarına göre ötenazileştirin.
3. Bir çift makas kullanarak, Aşil tendonunun yakınındaki cildi kesin. Cımbız kullanarak, altta yatan kasları ve fasyayı ortaya çıkarmak için cildi yukarı doğru bir hareketle çekin. Gastroknemius kasını kaplayan biseps femoris'i nazikçe diseke edin ve siyatik siniri kesin.
4. Gastroknemius ve soleus kaslarının distal ucunu serbest bırakmak için Aşil tendonunu kesin ve herhangi bir eki çıkarmak için makas kullanırken tendonu yavaşça yukarı doğru çekin. Tüm ataşmanlar çıkarıldıktan sonra, soleus kasının rostral ucunu kesmek ve çıkarmak için makas kullanın.
5. Patella etrafındaki gastroknemius kasının kafalarını incelemek için makas kullanın.
   NOT: Gastroknemius kasının çıkarılmasından sonra, miyoliflerin orijinal oryantasyonunu hatırlamak önemlidir.
6. Gastroknemius kasını bir diş balmumu tabakasına yerleştirin ve gastroknemius kasının merkezinden 10 mm x 10 mm'lik bir bölüm elde etmek için bir tıraş bıçağı ve bir cetvel kullanarak bölün.
   NOT: Dielektrik hücre boyutu özelleştirilebilir. Sıçanlar için 10 mm x 10 mm'lik bir hücre kullanıldı ve fareler için 5 mm x 5 mm'lik bir hücre kullanıldı.
7. Cımbız kullanarak, gastroknemius'u dielektrik hücrelere nazikçe yerleştirin, liflerin uzunlamasına yönlendirildiğinden emin olun (yani, kaudal ve rostral ekstremiteler elektrotlara dokunmalıdır). Kasın metal elektrotlarla tamamen temas halinde olduğundan emin olun.
8. Dielektrik hücrenin üst kısmını takın ve iki deliğe iki monopolar iğne (26 G) yerleştirin. EIM cihazından ex vivo hücreye kabloları aşağıdaki sırayla bağlayın: (1: I +, 2: V +, 3: V-, 4: I-, burada akım elektrotlarını temsil ederim ve V voltaj elektrotlarını temsil eder). Uzunlamasına ölçümü elde edin.
9. Dielektrik hücreyi açın ve kası 90 ° döndürerek enine yönde yeniden yönlendirin. Dielektrik hücrenin üst kısmını yeniden takın. Enine ölçümü elde edin.

Sonuçlar

EIM, yüzey in vivo dizileri (Şekil 1), iğne in vivo dizileri (Şekil 2A-F) ve ex vivo dielektrik hücreler (Şekil 2G, H) dahil olmak üzere birçok koşulda elde edilebilir.

EIM, ölçülen empedans değerlerine dayanarak kas durumunun neredeyse anlık bir görüntüsünü sağlar. Ölçümler hızlı bir şekilde elde edili...

Tartışmalar

Bu makale, hem in vivo hem de ex vivo kemirgenlerde EIM gerçekleştirmek için temel yöntemleri sunmaktadır. Güvenilir ölçümler elde etmek için, bir dizi adımın gerçekleştirilmesi çok önemlidir. İlk olarak, her kasın hastalıklara, tedaviye ve patolojiye farklı yanıtları olacağından, ilgilenilen kası doğru bir şekilde tanımlamanız gerekir. Bir kas (örneğin, gastroknemius) üzerinde elde edilen verilerin başka bir kasta (örneğin, tibialis anterior) aynı bilgiyi sağlamayac...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile