Réalisation de myographie d’impédance électrique in vivo et ex vivo chez les rongeurs

Résumé

Cet article explique comment effectuer une myographie d’impédance électrique in vivo (à l’aide de réseaux d’électrodes de surface et à aiguilles) et ex vivo (à l’aide d’une cellule diélectrique) sur le muscle gastrocnémien du rongeur. Il démontrera la technique chez les souris et les rats et détaillera les modifications disponibles (c.-à-d. animaux obèses, petits).

Résumé

La myographie d’impédance électrique (MIE) est une technique pratique qui peut être utilisée dans les études précliniques et cliniques pour évaluer la santé et la maladie des tissus musculaires. L’EIM est obtenue en appliquant un courant électrique de faible intensité, focalisé directionnellement, à un muscle d’intérêt sur une gamme de fréquences (c.-à-d. de 1 kHz à 10 MHz) et en enregistrant les tensions résultantes. À partir de ceux-ci, plusieurs composants d’impédance standard, y compris la réactance, la résistance et la phase, sont obtenus. Lors de la réalisation de mesures ex vivo sur un muscle excisé, les propriétés électriques passives inhérentes du tissu, à savoir la conductivité et la permittivité relative, peuvent également être calculées. L’EIM a été largement utilisée chez les animaux et les humains pour diagnostiquer et suivre les altérations musculaires dans diverses maladies, en relation avec une simple atrophie de désuétude, ou comme mesure d’intervention thérapeutique. Sur le plan clinique, l’EIM offre la possibilité de suivre la progression de la maladie au fil du temps et d’évaluer l’impact des interventions thérapeutiques, offrant ainsi la possibilité de raccourcir la durée des essais cliniques et de réduire les exigences relatives à la taille des échantillons. Parce qu’il peut être réalisé de manière non invasive ou peu invasive dans des modèles animaux vivants ainsi que chez l’homme, EIM offre le potentiel de servir de nouvel outil translationnel permettant à la fois le développement préclinique et clinique. Cet article fournit des instructions étape par étape sur la façon d’effectuer des mesures EIM in vivo et ex vivo chez la souris et le rat, y compris des approches pour adapter les techniques à des conditions spécifiques, telles que l’utilisation chez les chiots ou les animaux obèses.

Introduction

La myographie d’impédance électrique (MIE) fournit une méthode puissante pour évaluer l’état musculaire, permettant potentiellement le diagnostic des troubles neuromusculaires, le suivi de la progression de la maladie et l’évaluation de la réponse au traitement ^1,2,3. Il peut être appliqué de manière analogue aux modèles de maladies animales et aux humains, ce qui permet une traduction relativement transparente des études précliniques aux études cliniques. Les mesures EIM sont facilement obtenues à l’aide de quatre électrodes placées linéairement, les deux électrodes externes appliquant un courant électrique faible et indolore sur une gamme de fréquences (généralement entre 1 kHz et environ 2 MHz), et les deux électrodes internes enregistrant les tensions résultantes¹. À partir de ces tensions, les caractéristiques d’impédance du tissu peuvent être obtenues, y compris la résistance (R), une mesure de la difficulté pour le courant de traverser le tissu, et la réactance (X) ou « chargeabilité » du tissu, une mesure liée à la capacité du tissu à stocker la charge (capacité). À partir de la réactance et de la résistance, l’angle de phase (θ) est calculé via l’équation suivante: , fournissant une seule mesure d’impédance sommative. De telles mesures peuvent être obtenues à l’aide de n’importe quel dispositif de bioimpédance multifréquence. Comme les myofibres sont essentiellement de longs cylindres, le tissu musculaire est également très anisotrope, le courant circulant plus facilement le long des fibres qu’à travers elles ^4,5. Ainsi, l’EIM est souvent effectuée dans deux directions: avec le réseau placé le long des fibres de telle sorte que le courant leur soit parallèle, et à travers le muscle de telle sorte que le courant circule perpendiculairement à elles. De plus, dans les mesures ex vivo, où un volume connu de tissu est mesuré dans une cellule de mesure d’impédance, les propriétés électriques inhérentes du muscle (c’est-à-dire la conductivité et la permittivité relative) peuvent être déduites⁶.

Le terme « troubles neuromusculaires » définit un large éventail de maladies primaires et secondaires qui entraînent une altération et un dysfonctionnement musculaire structurel. Cela comprend la sclérose latérale amyotrophique et diverses formes de dystrophie musculaire, ainsi que des changements plus simples liés au vieillissement (p. ex. sarcopénie), à l’atrophie de la désuétude (p. ex. en raison d’un alitement prolongé ou de la microgravité) ou même à une blessure⁷. Bien que les causes soient nombreuses et puissent provenir du motoneurone, des nerfs, des jonctions neuromusculaires ou du muscle lui-même, l’EIM peut être utilisée pour détecter les altérations précoces du muscle dues à bon nombre de ces processus et pour suivre la progression ou la réponse au traitement. Par exemple, chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), il a été démontré que l’EIM détecte la progression de la maladie et la réponse aux corticostéroïdes⁸. Des travaux récents ont également montré que l’EIM est sensible à divers états de désuétude, y compris la gravité fractionnée⁹, comme ce serait le cas sur la Lune ou Mars, et les effets du vieillissement^10,11. Enfin, en appliquant des algorithmes prédictifs et d’apprentissage automatique à l’ensemble de données obtenues à chaque mesure (données multifréquences et directionnellement dépendantes), il devient possible de déduire les aspects histologiques du tissu, y compris la taille des myofibres 12,13, les changements inflammatoires et l’œdème 14, et la teneur en tissu conjonctif et en graisse ^15,16.

Plusieurs autres méthodes non invasives ou mini-invasives sont également utilisées pour évaluer la santé musculaire chez les humains et les animaux, y compris l’électromyographie à l’aiguille¹⁷ et les technologies d’imagerie telles que l’imagerie par résonance magnétique, la tomographie informatisée et l’échographie^18,19. Cependant, EIM présente des avantages distincts par rapport à ces technologies. Par exemple, l’électromyographie enregistre uniquement les propriétés électriques actives des membranes myofibreuses et non les propriétés passives, et ne peut donc pas fournir une véritable évaluation de la composition ou de la structure musculaire. À certains égards, les méthodes d’imagerie sont plus étroitement liées à l’EIM, car elles fournissent également des informations sur la structure et la composition des tissus. Mais dans un certain sens, ils fournissent trop de données, nécessitant une segmentation détaillée des images et une analyse d’experts plutôt que de simplement fournir une sortie quantitative. De plus, compte tenu de leur complexité, les techniques d’imagerie sont également grandement influencées par les spécificités du matériel et des logiciels utilisés, ce qui nécessite idéalement l’utilisation de systèmes identiques afin que les ensembles de données puissent être comparés. En revanche, le fait que l’EIM soit beaucoup plus simple signifie qu’il est moins impacté par ces problèmes techniques et ne nécessite aucune forme de traitement d’image ou d’expertise.

Le protocole suivant montre comment effectuer une EIM in vivo chez le rat et la souris, en utilisant à la fois des techniques non invasives (réseau de surface) et mini-invasives (réseau d’aiguilles sous-cutanées), ainsi que des EIM ex vivo sur des muscles fraîchement excisés.

Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Beth Israel Deaconess Medical Center sous les numéros de protocole (031-2019; 025-2019). Portez un équipement de protection individuelle approprié pour manipuler les animaux et respectez les directives de l’IACUC pour tous les travaux sur les animaux.

1. EIM de surface in vivo

1. Placez l’animal dans une boîte d’anesthésie pour induire l’anesthésie.
   NOTA : Pour les rats, 1,5 % à 3,5 % d’isoflurane et 2 O 2 L·min-1 ont été utilisés, et pour les souris, 2 % d’isoflurane et 1 O₂ L·^min-1 ont été utilisés.
2. Une fois complètement anesthésié, comme indiqué par l’absence de réponse après avoir pincé le pied de l’animal, placez la souris sur le banc en position couchée et utilisez le cône nasal pour maintenir l’anesthésie en utilisant 1,5% d’isoflurane et un débit d’oxygène de 1 L·^min-1.
3. Placez la patte de l’animal à analyser à un angle de 45° avec l’articulation de la hanche (genou tendu) et fixez le pied avec du ruban médical.
4. Utilisez une tondeuse à cheveux pour couper la fourrure recouvrant le muscle gastrocnémien.
5. Appliquez une épaisse couche de crème dépilatoire sur la peau de l’animal et laissez-le reposer pendant 1 min. Ensuite, utilisez de la gaze saturée de solution saline pour éliminer l’agent dépilatoire. Répétez ce processus jusqu’à trois fois jusqu’à ce que toute la fourrure recouvrant le muscle gastrocnémien soit enlevée.
   REMARQUE: Placez un tampon de gaze imbibé de solution saline sur la peau lorsque les mesures ne sont pas acquises pour prévenir la déshydratation de la peau.
6. Connectez le réseau de surface (Figure 1) au dispositif EIM et laissez les électrodes reposer sur un morceau de gaze imbibé d’une solution saline.
7. Placez le réseau de surfaces directement sur la peau au-dessus du muscle gastrocnémien, orienté longitudinalement vers les fibres musculaires.
8. Après avoir vérifié le contact approprié, qui est indiqué par toutes les barres apparaissant en vert sur le logiciel montrant la stabilité de la résistance, de la réactance et des valeurs de phase de 50 kHz, obtenez les mesures EIM.
   REMARQUE: Les courbes doivent être vérifiées en temps réel pour assurer une bonne acquisition des données.
9. Faire pivoter la matrice de surface de 90° et la repositionner sur la peau au-dessus du gastrocnémien pour obtenir les mesures transversales (vérifier les barres vertes indiquant la stabilité).
10. Répétez les étapes 1.7, 1.8 et 1.9 pour obtenir un total de quatre mesures par muscle: deux longitudinales et deux transversales.
    REMARQUE : N’utilisez pas d’agent dépilatoire plus d’une fois (c.-à-d. jusqu’à trois applications dans le même cas) toutes les deux semaines pour prévenir une irritation et une blessure cutanées excessives. Il est important d’effectuer les mesures dans les 5 à 10 minutes suivant le retrait de la crème dépilatoire, car le développement d’un œdème cutané localisé induit par l’agent dépilatoire peut avoir un impact sur les données d’impédance collectées. La récupération de l’animal est immédiate après l’arrêt de l’anesthésie à l’isoflurane et la procédure ne nécessite pas de traitement analgésique.

2. EIM in vivo du réseau d’aiguilles

1. Anesthésier l’animal et préparer la cuisse en suivant la même procédure que celle décrite aux étapes 1.1 à 1.4. Cependant, il n’est pas nécessaire d’utiliser un agent dépilatoire lors de la réalisation d’EIM in vivo à l’aide d’un réseau d’aiguilles.
2. Connectez le réseau d’aiguilles (Figure 2A-F) au dispositif EIM et laissez-le reposer dans un bateau de pesée contenant une solution saline. Vérifiez la connectivité et la stabilité du signal (indiquées par des barres vertes).
3. Désinfectez la peau et les aiguilles avec de l’alcool. Placez le réseau d’aiguilles dans une position longitudinale par rapport aux myofibres et appuyez fermement dans la peau jusqu’à ce que toutes les aiguilles pénètrent dans la peau et le muscle sous-jacent jusqu’à la protection en plastique sur le réseau. Acquérir des données.
4. Retirez doucement le tableau et réinsérez-le à travers la peau et dans le muscle à un angle de 90° par rapport à la première mesure, dans le sens transversal. Acquérir des données.
   REMARQUE: Lors de l’utilisation de réseaux d’aiguilles, les mesures ne doivent être acquises qu’une seule fois dans chaque direction pour réduire l’impact des électrodes d’aiguille sur la peau et le tissu musculaire. En cas de saignement, essuyez doucement le sang avant d’effectuer la deuxième mesure. La récupération de l’animal est immédiate après l’arrêt de l’anesthésie à l’isoflurane et la procédure ne nécessite pas de traitement analgésique.

3. EIM ex vivo

1. Préparer la cellule diélectrique ex vivo (Figure 2G,H), ajouter une solution saline à la chambre et connecter la cellule au dispositif EIM pour obtenir les valeurs de référence.
   REMARQUE : Les valeurs de phase et de réactance de la solution saline doivent demeurer constantes à zéro ou près de zéro et les valeurs de résistance de la solution saline doivent demeurer constantes à environ 100 ± 25 Ω sur la gamme de fréquences de 1 kHz à 1 MHz.
2. Euthanasier l’animal conformément aux directives respectives de l’IACUC.
3. À l’aide d’une paire de ciseaux, coupez la peau près du tendon d’Achille. À l’aide d’une pince à épiler, tirez la peau dans un mouvement ascendant pour révéler les muscles sous-jacents et le fascia. Disséquez doucement le biceps fémoral recouvrant le muscle gastrocnémien et sectionnez le nerf sciatique.
4. Coupez le tendon d’Achille pour libérer l’extrémité distale des muscles gastrocnémiens et soléaires et tirez doucement le tendon vers le haut tout en utilisant des ciseaux pour enlever les attaches. Une fois que tous les accessoires sont retirés, utilisez des ciseaux pour couper l’extrémité rostrale du muscle soléaire et l’enlever.
5. Utilisez des ciseaux pour disséquer la tête du muscle gastrocnémien autour de la rotule.
   REMARQUE: Après l’ablation du muscle gastrocnémien, il est important de se rappeler l’orientation originale des myofibres.
6. Placez le muscle gastrocnémien sur une feuille de cire dentaire et sectionnez-le à l’aide d’une lame de rasoir et d’une règle pour obtenir une section de 10 mm x 10 mm à partir du centre du muscle gastrocnémien.
   REMARQUE: La taille de la cellule diélectrique peut être personnalisée. Pour les rats, une cellule de 10 mm x 10 mm a été utilisée et pour les souris, une cellule de 5 mm x 5 mm a été utilisée.
7. À l’aide d’une pince à épiler, placez doucement le gastrocnémien dans les cellules diélectriques, en vous assurant que les fibres sont orientées longitudinalement (c.-à-d. que les extrémités caudales et rostrales doivent toucher les électrodes). Assurez-vous que le muscle est complètement en contact avec les électrodes métalliques.
8. Fixez la partie supérieure de la cellule diélectrique et insérez deux aiguilles monopolaires (26 G) dans les deux trous. Connectez les fils du dispositif EIM à la cellule ex vivo dans l’ordre suivant : (1 : I+, 2 : V+, 3 : V-, 4 : I-, où I représente les électrodes de courant et V représente les électrodes de tension). Acquérir la mesure longitudinale.
9. Ouvrez la cellule diélectrique et réorientez le muscle dans le sens transversal en le faisant pivoter de 90°. Refixez le dessus de la cellule diélectrique. Acquérir la mesure transversale.

Résultats

L’EIM peut être obtenue dans de nombreuses conditions, y compris les réseaux in vivo de surface (Figure 1), les réseaux in vivo à aiguilles (Figure 2A-F) et les cellules diélectriques ex vivo (Figure 2G,H).

EIM fournit un instantané quasi instantané de l’état musculaire basé sur les valeurs d’impédance mesurées....

Discussion

Cet article fournit les méthodes de base pour effectuer l’EIM chez les rongeurs, à la fois in vivo et ex vivo. Pour acquérir des mesures fiables, il est essentiel d’effectuer une série d’étapes. Tout d’abord, il faut bien identifier le muscle d’intérêt, car chaque muscle aura des réponses différentes aux maladies, au traitement et à la pathologie. Il faut garder à l’esprit que les données acquises sur un muscle (par exemple, gastrocnémien) ne fourniront pas les mêmes informatio...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile