Esecuzione della miografia ad impedenza elettrica in vivo ed ex vivo nei roditori

Riepilogo

Questo articolo descrive in dettaglio come eseguire la miografia ad impedenza elettrica in vivo (utilizzando array di elettrodi di superficie e ad ago) ed ex vivo (utilizzando una cella dielettrica) sul muscolo gastrocnemio dei roditori. Dimostrerà la tecnica sia nei topi che nei ratti e dettaglierà le modifiche disponibili (cioè animali obesi, cuccioli).

Abstract

La miografia ad impedenza elettrica (EIM) è una tecnica conveniente che può essere utilizzata in studi preclinici e clinici per valutare la salute e la malattia del tessuto muscolare. L'EIM si ottiene applicando una corrente elettrica a bassa intensità, focalizzata direzionalmente, a un muscolo di interesse attraverso una gamma di frequenze (cioè da 1 kHz a 10 MHz) e registrando le tensioni risultanti. Da questi, si ottengono diversi componenti di impedenza standard, tra cui la reattanza, la resistenza e la fase. Quando si eseguono misurazioni ex vivo sul muscolo asportato, è possibile calcolare anche le proprietà elettriche passive intrinseche del tessuto, vale a dire la conducibilità e la permittività relativa. L'EIM è stato ampiamente utilizzato negli animali e nell'uomo per diagnosticare e monitorare le alterazioni muscolari in una varietà di malattie, in relazione alla semplice atrofia da disuso o come misura di intervento terapeutico. Dal punto di vista clinico, l'EIM offre il potenziale per monitorare la progressione della malattia nel tempo e valutare l'impatto degli interventi terapeutici, offrendo così l'opportunità di abbreviare la durata della sperimentazione clinica e ridurre i requisiti di dimensione del campione. Poiché può essere eseguito in modo non invasivo o minimamente invasivo in modelli animali viventi e nell'uomo, EIM offre il potenziale per fungere da nuovo strumento traslazionale che consente sia lo sviluppo preclinico che clinico. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate su come eseguire misurazioni EIM in vivo ed ex vivo in topi e ratti, compresi gli approcci per adattare le tecniche a condizioni specifiche, come per l'uso in cuccioli o animali obesi.

Introduzione

La miografia ad impedenza elettrica (EIM) fornisce un potente metodo per valutare le condizioni muscolari, consentendo potenzialmente la diagnosi di disturbi neuromuscolari, il monitoraggio della progressione della malattia e la valutazione della risposta alla terapia ^1,2,3. Può essere applicato analogamente ai modelli di malattie animali e agli esseri umani, consentendo una traduzione relativamente fluida dagli studi preclinici a quelli clinici. Le misure EIM sono facilmente ottenute utilizzando quattro elettrodi posizionati linearmente, con i due esterni che applicano una corrente elettrica indolore e debole su un intervallo di frequenze (generalmente tra 1 kHz e circa 2 MHz), e i due interni che registrano le tensioni risultanti¹. Da queste tensioni si possono ottenere le caratteristiche di impedenza del tessuto, tra cui la resistenza (R), una misura di quanto sia difficile per la corrente passare attraverso il tessuto, e la reattanza (X) o "caricabilità" del tessuto, una misura correlata alla capacità del tessuto di immagazzinare carica (capacità). Dalla reattanza e dalla resistenza, l'angolo di fase (θ) viene calcolato tramite la seguente equazione: , fornendo una singola misura sommativa dell'impedenza. Tali misurazioni possono essere ottenute utilizzando qualsiasi dispositivo di bioimpedenza multifrequenza. Poiché le miofibre sono essenzialmente cilindri lunghi, il tessuto muscolare è anche altamente anisotropo, con la corrente che scorre più facilmente lungo le fibre che attraverso di esse ^4,5. Pertanto, l'EIM viene spesso eseguito in due direzioni: con l'array posizionato lungo le fibre in modo tale che la corrente scorra parallela a loro e attraverso il muscolo in modo tale che la corrente fluisca perpendicolarmente a loro. Inoltre, nelle misurazioni ex vivo, in cui un volume noto di tessuto viene misurato in una cella di misurazione dell'impedenza, è possibile derivare le proprietà elettriche intrinseche del muscolo (cioè la conducibilità e la permittività relativa)⁶.

Il termine "disturbi neuromuscolari" definisce una vasta gamma di malattie primarie e secondarie che portano ad alterazioni e disfunzioni muscolari strutturali. Ciò include la sclerosi laterale amiotrofica e varie forme di distrofia muscolare, nonché cambiamenti più semplici legati all'invecchiamento (ad esempio, sarcopenia), atrofia da disuso (ad esempio, a causa di riposo a letto prolungato o microgravità) o persino lesioni⁷. Mentre le cause sono abbondanti e possono provenire dal motoneurone, dai nervi, dalle giunzioni neuromuscolari o dal muscolo stesso, l'EIM può essere utilizzato per rilevare alterazioni precoci nel muscolo a causa di molti di questi processi e per monitorare la progressione o la risposta alla terapia. Ad esempio, nei pazienti con distrofia muscolare di Duchenne (DMD), l'EIM ha dimostrato di rilevare la progressione della malattia e la risposta ai corticosteroidi⁸. Recenti lavori hanno anche dimostrato che l'EIM è sensibile ai vari stati di disuso, tra cui la gravità frazionaria⁹, come si sperimenterebbe sulla Luna o su Marte, e gli effetti dell'invecchiamento^10,11. Infine, applicando algoritmi predittivi e di machine learning al set di dati ottenuti con ogni misurazione (dati multifrequenza e direzionalmente dipendenti), diventa possibile dedurre aspetti istologici del tessuto, tra cui la dimensione della miofibra 12,13, le alterazioni infiammatorie e l'edema 14, e il tessuto connettivo e il contenuto di grasso ^15,16.

Diversi altri metodi non invasivi o minimamente invasivi sono utilizzati anche per valutare la salute muscolare negli esseri umani e negli animali, tra cui l'elettromiografia con ago¹⁷ e tecnologie di imaging come la risonanza magnetica, la tomografia computerizzata e gli ultrasuoni^18,19. Tuttavia, EIM dimostra vantaggi distinti rispetto a queste tecnologie. Ad esempio, l'elettromiografia registra solo le proprietà elettriche attive delle membrane miofibre e non le proprietà passive, e quindi non può fornire una vera valutazione della composizione o della struttura muscolare. In un certo senso, i metodi di imaging sono più strettamente correlati all'EIM, in quanto anch'essi forniscono informazioni sulla struttura e la composizione del tessuto. Ma in un certo senso, forniscono troppi dati, richiedendo una segmentazione dettagliata delle immagini e un'analisi di esperti piuttosto che fornire solo un output quantitativo. Inoltre, data la loro complessità, le tecniche di imaging sono anche fortemente influenzate dalle specifiche sia dell'hardware che del software utilizzati, idealmente richiedendo l'uso di sistemi identici in modo che i set di dati possano essere confrontati. Al contrario, il fatto che EIM sia molto più semplice significa che è meno influenzato da questi problemi tecnici e non richiede alcuna forma di elaborazione delle immagini o analisi di esperti.

Il seguente protocollo dimostra come eseguire EIM in vivo in ratti e topi, utilizzando tecniche non invasive (array di superficie) e minimamente invasive (array di aghi subdermici), nonché EIM ex vivo su muscoli appena asportati.

Protocollo

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Beth Israel Deaconess Medical Center con numeri di protocollo (031-2019; 025-2019). Indossare attrezzature DPI adeguate per gestire gli animali e aderire alle linee guida IACUC per tutto il lavoro animale.

1. EIM di superficie in vivo

1. Metti l'animale in una scatola per anestesia per indurre l'anestesia.
   NOTA: Per i ratti sono stati utilizzati l'1,5%-3,5% di isoflurano e 2 O 2 L·min-1, e per i topi sono stati utilizzati il 2% di isoflurano e 1 O₂ L·^min-1.
2. Una volta completamente anestetizzato, come indicato dall'assenza di risposta dopo aver pizzicato il piede dell'animale, posizionare il topo sulla panca in posizione prona e utilizzare il cono nasale per mantenere l'anestesia utilizzando l'1,5% di isoflurano e un flusso di ossigeno di 1 L·^min-1.
3. Posizionare la zampa dell'animale da analizzare con un angolo di 45° con l'articolazione dell'anca (ginocchio esteso) e fissare il piede con nastro adesivo medico.
4. Utilizzare un tagliacapelli per tagliare la pelliccia che si sovrappone al muscolo gastrocnemio.
5. Applicare uno spesso strato di crema depilatoria sulla pelle dell'animale e lasciarlo riposare per 1 minuto. Quindi, utilizzare una garza satura di soluzione salina per rimuovere l'agente depilatorio. Ripeti questo processo fino a tre volte fino a quando tutta la pelliccia che si sovrappone al muscolo gastrocnemio viene rimossa.
   NOTA: Posizionare una garza imbevuta di soluzione salina sulla pelle quando le misurazioni non vengono acquisite per prevenire la disidratazione della pelle.
6. Collegare l'array di superficie (Figura 1) al dispositivo EIM e lasciare riposare gli elettrodi su un pezzo di garza imbevuto di soluzione salina.
7. Posizionare la matrice di superficie direttamente sulla pelle sopra il muscolo gastrocnemio, orientata longitudinalmente alle fibre muscolari.
8. Dopo aver controllato il contatto appropriato, che è indicato da tutte le barre che appaiono verdi sul software che mostrano la stabilità dei valori di resistenza, reattanza e fase a 50 kHz, acquisire le misurazioni EIM.
   NOTA: le curve devono essere controllate in tempo reale per garantire la corretta acquisizione dei dati.
9. Ruotare la matrice di superficie di 90° e riposizionarla sulla pelle sopra il gastrocnemio per ottenere le misure trasversali (verificare la presenza di barre verdi che indicano la stabilità).
10. Ripeti i passaggi 1.7, 1.8 e 1.9 per ottenere un totale di quattro misurazioni per muscolo: due longitudinali e due trasversali.
    NOTA: Non utilizzare un agente depilatorio più di una volta (cioè fino a tre applicazioni nella stessa istanza) ogni due settimane per prevenire eccessive irritazioni e lesioni cutanee. È importante eseguire le misurazioni entro circa 5-10 minuti dalla rimozione della crema depilatoria poiché lo sviluppo di edema cutaneo localizzato indotto dall'agente depilatorio può influire sui dati di impedenza raccolti. Il recupero degli animali è immediato dopo l'interruzione dell'anestesia con isoflurano e la procedura non richiede un trattamento analgesico.

2. Array di aghi in vivo EIM

1. Anestetizzare l'animale e preparare la gamba usando la stessa procedura descritta nei punti 1.1-1.4. Tuttavia, non è necessario utilizzare un agente depilatorio quando si esegue EIM in vivo utilizzando un array di aghi.
2. Collegare l'array di aghi (Figura 2A-F) al dispositivo EIM e lasciarlo riposare in un recipiente di pesatura contenente soluzione salina. Verificare la connettività e la stabilità del segnale (indicata da barre verdi).
3. Disinfettare la pelle e gli aghi con alcool. Posizionare l'array di aghi in posizione longitudinale rispetto alle miofibre e premerlo saldamente nella pelle fino a quando tutti gli aghi penetrano nella pelle e nel muscolo sottostante fino alla protezione plastica sull'array. Acquisire dati.
4. Rimuovere delicatamente l'array e reinserirlo attraverso la pelle e nel muscolo con un angolo di 90° rispetto alla prima misurazione, nella direzione trasversale. Acquisire dati.
   NOTA: Quando si utilizzano array di aghi, le misurazioni devono essere acquisite solo una volta in ciascuna direzione per ridurre l'impatto degli elettrodi ad ago sulla pelle e sul tessuto muscolare. Se si verifica sanguinamento, asciugare delicatamente il sangue prima di eseguire la seconda misurazione. Il recupero degli animali è immediato dopo l'interruzione dell'anestesia con isoflurano e la procedura non richiede un trattamento analgesico.

3. EIM ex vivo

1. Preparare la cella dielettrica ex vivo (Figura 2G,H), aggiungere soluzione salina alla camera e collegare la cella al dispositivo EIM per ottenere i valori di riferimento.
   NOTA: I valori di fase e di reattanza della soluzione salina devono rimanere costanti a zero o quasi a zero e i valori di resistenza della soluzione salina devono rimanere costanti a circa 100 ± 25 Ω nell'intervallo di frequenza da 1 kHz a 1 MHz.
2. Eutanasia dell'animale secondo le rispettive linee guida IACUC.
3. Usando un paio di forbici, tagliare la pelle vicino al tendine di Achille. Usando una pinzetta, tira la pelle con un movimento verso l'alto per rivelare i muscoli sottostanti e la fascia. Sezionare delicatamente il bicipite femorale sovrapposto al muscolo gastrocnemio e sezionare il nervo sciatico.
4. Tagliare il tendine di Achille per liberare l'estremità distale dei muscoli gastrocnemio e soleo e tirare delicatamente il tendine verso l'alto mentre si usano le forbici per rimuovere eventuali attacchi. Una volta rimossi tutti gli accessori, utilizzare le forbici per tagliare l'estremità rostrale del muscolo soleo e rimuoverlo.
5. Usa le forbici per sezionare le teste del muscolo gastrocnemio intorno alla rotula.
   NOTA: Dopo la rimozione del muscolo gastrocnemio, è importante ricordare l'orientamento originale delle miofibre.
6. Posizionare il muscolo gastrocnemio su un foglio di cera dentale e sezionarlo usando una lama di rasoio e un righello per ottenere una sezione di 10 mm x 10 mm dal centro del muscolo gastrocnemio.
   NOTA: la dimensione della cella dielettrica può essere personalizzata. Per i ratti è stata utilizzata una cella di 10 mm x 10 mm e per i topi è stata utilizzata una cella di 5 mm x 5 mm.
7. Usando una pinzetta, posiziona delicatamente il gastrocnemio nelle celle dielettriche, assicurandoti che le fibre siano orientate longitudinalmente (cioè le estremità caudali e rostrali dovrebbero toccare gli elettrodi). Assicurarsi che il muscolo sia completamente a contatto con gli elettrodi metallici.
8. Collegare la parte superiore della cella dielettrica e inserire due aghi monopolari (26 G) nei due fori. Collegare i fili dal dispositivo EIM alla cella ex vivo nel seguente ordine: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, dove I rappresenta gli elettrodi di corrente e V rappresenta gli elettrodi di tensione). Acquisire la misura longitudinale.
9. Aprire la cellula dielettrica e riorientare il muscolo in direzione trasversale ruotandolo di 90°. Riattaccare la parte superiore della cella dielettrica. Acquisire la misura trasversale.

Risultati

L'EIM può essere ottenuto in molte condizioni, tra cui array in vivo di superficie (Figura 1), array di aghi in vivo (Figura 2A-F) e celle dielettriche ex vivo (Figura 2G,H).

EIM fornisce un'istantanea quasi istantanea della condizione muscolare in base ai valori di impedenza misurati. Le misurazioni vengono acquisite rapidamen...

Discussione

Questo articolo fornisce i metodi di base per eseguire EIM nei roditori, sia in vivo che ex vivo. Per acquisire misurazioni affidabili, è fondamentale eseguire una serie di passaggi. In primo luogo, è necessario identificare correttamente il muscolo di interesse, poiché ogni muscolo avrà risposte diverse a malattie, trattamenti e patologie. Bisogna essere consapevoli che i dati acquisiti su un muscolo (ad esempio, gastrocnemio) non forniranno le stesse informazioni di un altro muscolo (ad esempio, t...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile