Выполнение in vivo и ex vivo электроимпедансной миографии у грызунов

Резюме

В этой статье подробно описано, как выполнить in vivo (с использованием поверхностных и игольчатых электродных массивов) и ex vivo (с использованием диэлектрической ячейки) электроимпедансную миографию на икроножной мышце грызунов. Он продемонстрирует технику как на мышах, так и на крысах и подробно расскажет о доступных модификациях (например, тучных животных, щенках).

Аннотация

Электроимпедансная миография (EIM) является удобным методом, который может быть использован в доклинических и клинических исследованиях для оценки здоровья и заболеваний мышечной ткани. EIM получают путем приложения низкоинтенсивного, направленно сфокусированного электрического тока к интересующей мышце в диапазоне частот (т.е. от 1 кГц до 10 МГц) и регистрации результирующих напряжений. Из них получают несколько стандартных компонентов импеданса, включая реактивное сопротивление, сопротивление и фазу. При выполнении измерений ex vivo на иссеченной мышце также могут быть рассчитаны присущие ткани пассивные электрические свойства, а именно проводимость и относительная диэлектрическая проницаемость. EIM широко используется у животных и людей для диагностики и отслеживания мышечных изменений при различных заболеваниях, в связи с простой атрофией неиспользования или в качестве меры терапевтического вмешательства. Клинически EIM предлагает потенциал для отслеживания прогрессирования заболевания с течением времени и оценки воздействия терапевтических вмешательств, тем самым предлагая возможность сократить продолжительность клинических испытаний и уменьшить требования к размеру выборки. Поскольку он может быть выполнен неинвазивно или минимально инвазивно на живых животных моделях, а также на людях, EIM предлагает потенциал для использования в качестве нового трансляционного инструмента, позволяющего как доклинические, так и клинические разработки. В этой статье приведены пошаговые инструкции о том, как выполнять измерения EIM in vivo и ex vivo у мышей и крыс, включая подходы к адаптации методов к конкретным условиям, например, для использования у детенышей или животных с ожирением.

Введение

Электроимпедансная миография (EIM) обеспечивает мощный метод оценки состояния мышц, потенциально позволяющий диагностировать нервно-мышечные расстройства, отслеживать прогрессирование заболевания и оценивать реакцию на терапию ^1,2,3. Он может быть применен аналогично моделям болезней животных и людей, что позволяет относительно беспрепятственно переходить от доклинических к клиническим исследованиям. Измерения EIM легко получены с использованием четырех линейно расположенных электродов, причем два внешних применяют безболезненный, слабый электрический ток в диапазоне частот (обычно от 1 кГц до примерно 2 МГц), а два внутренних регистрируют результирующие напряжения¹. Из этих напряжений можно получить импедансные характеристики ткани, включая сопротивление (R), меру того, насколько трудно току проходить через ткань, и реактивность (X) или «зарядоспособность» ткани, меру, связанную со способностью ткани хранить заряд (емкость). Из реактивности и сопротивления фазовый угол (θ) вычисляется с помощью следующего уравнения: , обеспечивающего единую суммативную меру импеданса. Такие измерения могут быть получены с помощью любого многочастотного биоимпедансного устройства. Поскольку миофибры по существу являются длинными цилиндрами, мышечная ткань также очень анизотропна, причем ток протекает легче вдоль волокон, чем через них ^4,5. Таким образом, EIM часто выполняется в двух направлениях: с массивом, размещенным вдоль волокон таким образом, что ток проходит параллельно им, и поперек мышцы таким, что ток течет перпендикулярно им. Кроме того, при измерениях ex vivo, где известный объем ткани измеряется в измерительной ячейке импеданса, могут быть получены присущие мышце электрические свойства (т.е. проводимость и относительная диэлектрическая проницаемость)⁶.

Термин «нервно-мышечные расстройства» определяет широкий спектр первичных и вторичных заболеваний, которые приводят к структурным изменениям мышц и дисфункции. Это включает в себя боковой амиотрофический склероз и различные формы мышечной дистрофии, а также более простые изменения, связанные со старением (например, саркопения), атрофию неиспользования (например, из-за длительного постельного режима или микрогравитации) или даже травму⁷. В то время как причины многочисленны и могут исходить от двигательного нейрона, нервов, нервно-мышечных соединений или самой мышцы, EIM может быть использован для обнаружения ранних изменений в мышцах из-за многих из этих процессов и для отслеживания прогрессирования или ответа на терапию. Например, у пациентов с мышечной дистрофией Дюшенна (МДД) было показано, что EIM обнаруживает прогрессирование заболевания и реакцию на кортикостероиды⁸. Недавняя работа также показала, что EIM чувствителен к различным состояниям неиспользования, включая фракционную гравитацию⁹, как это было бы на Луне или Марсе, и эффекты старения^10,11. Наконец, применяя алгоритмы прогнозирования и машинного обучения к набору данных, полученным при каждом измерении (многочастотные и зависящие от направления данные), становится возможным вывести гистологические аспекты ткани, включая размер миофибры^12,13, воспалительные изменения и отек¹⁴, а также содержание соединительной ткани и жира^15,16.

Несколько других неинвазивных или минимально инвазивных методов также используются для оценки здоровья мышц у людей и животных, включая игольчатую электромиографию¹⁷ и технологии визуализации, такие как магнитно-резонансная томография, компьютерная томография и ультразвук ^18,19. Тем не менее, EIM демонстрирует явные преимущества по сравнению с этими технологиями. Например, электромиография регистрирует только активные электрические свойства мембран миофибры, а не пассивные свойства, и, таким образом, не может обеспечить истинную оценку мышечного состава или структуры. В определенном отношении методы визуализации более тесно связаны с EIM, так как они также предоставляют информацию о структуре и составе ткани. Но в некотором смысле они предоставляют слишком много данных, требуя детальной сегментации изображений и экспертного анализа, а не просто предоставления количественного результата. Кроме того, учитывая их сложность, методы визуализации также в значительной степени зависят от специфики как используемого аппаратного, так и программного обеспечения, что в идеале требует использования идентичных систем для сравнения наборов данных. Напротив, тот факт, что EIM намного проще, означает, что он меньше подвержен влиянию этих технических проблем и не требует какой-либо формы обработки изображений или экспертного анализа.

Следующий протокол демонстрирует, как выполнять in vivo EIM у крыс и мышей, используя как неинвазивные (поверхностный массив), так и минимально инвазивные (подкожный игольчатый массив), а также ex vivo EIM на свежеиссеченных мышцах.

протокол

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинского центра Бет Исраэль Диаконисс под номерами протокола (031-2019; 025-2019). Носите надлежащее оборудование СИЗ для работы с животными и придерживайтесь руководящих принципов IACUC для всех работ с животными.

1. In vivo поверхность EIM

1. Поместите животное в бокс для анестезии, чтобы вызвать анестезию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для крыс использовали 1,5%-3,5% изофлурана и 2 O₂ л·^мин-1 , а для мышей - 2% изофлурана и 1 O₂ л·^мин-1 .
2. После полного обезболивания, о чем свидетельствует отсутствие реакции после защемления ноги животного, поместите мышь на скамейку в положение лежа и используйте носовой конус для поддержания анестезии с использованием 1,5% изофлурана и потока кислорода 1 л·^мин-1.
3. Поместите ногу животного для анализа под углом 45° тазобедренным суставом (колено вытянуто) и закрепите стопу медицинской лентой.
4. Используйте машинку для стрижки волос, чтобы обрезать мех, накладывающийся на икроножную мышцу.
5. Нанесите толстый слой крема для депиляции на кожу животного и дайте ему постоять в течение 1 мин. Затем используйте насыщенную физиологическим раствором марлю, чтобы удалить средство для депиляции. Повторяйте этот процесс до трех раз, пока не будет удален весь мех, накладывающийся на икроножную мышцу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите марлевую прокладку, смоченную в физиологическом растворе, на кожу, когда измерения не получены, чтобы предотвратить обезвоживание кожи.
6. Подключите поверхностный массив (рисунок 1) к устройству EIM и дайте электродам покоиться на куске марли, смоченной в солевом растворе.
7. Поместите поверхностный массив непосредственно на кожу над икроножной мышцей, ориентированной продольно к мышечным волокнам.
8. После проверки подходящего контакта, на который указывают все полосы, появляющиеся зеленым цветом на программном обеспечении, показывающие стабильность значений сопротивления, реактивности и фазы 50 кГц, получите измерения EIM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кривые должны проверяться в режиме реального времени для обеспечения надлежащего сбора данных.
9. Поверните массив поверхности на 90° и переместите его на кожу над икроножной мышцей, чтобы получить поперечные измерения (проверьте наличие зеленых полос, указывающих на стабильность).
10. Повторите шаги 1.7, 1.8 и 1.9, чтобы получить в общей сложности четыре измерения на мышцу: два продольных и два поперечных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте средство для депиляции более одного раза (т.е. до трех применений в одном и том же случае) каждые две недели, чтобы предотвратить чрезмерное раздражение кожи и травмы. Важно выполнить измерения в течение примерно 5-10 минут после удаления крема для депиляции, поскольку развитие локализованного отека кожи, вызванного депиляционным агентом, может повлиять на собранные данные импеданса. Восстановление животных происходит сразу после прекращения изофлурановой анестезии, и процедура не требует обезболивающего лечения.

2. In vivo игольчатый массив EIM

1. Обезболить животное и подготовить ногу, используя ту же процедуру, которая описана в шагах 1.1-1.4. Тем не менее, нет необходимости использовать депиляционное средство при выполнении in vivo EIM с использованием игольчатого массива.
2. Подключите игольчатый массив (рисунок 2A-F) к устройству EIM и дайте ему отдохнуть в весовой лодке, содержащей солевой раствор. Проверьте возможности подключения и стабильность сигнала (обозначены зелеными полосами).
3. Продезинфицируйте кожу и иглы спиртом. Поместите игольчатый массив в продольное положение по сравнению с миофибрами и плотно вдавите его в кожу, пока все иглы не проникнут в кожу и нижележащую мышцу до пластиковой защиты на массиве. Получение данных.
4. Аккуратно извлеките массив и снова вставьте его через кожу и в мышцу под углом 90° относительно первого измерения, в поперечном направлении. Получение данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании игольчатых массивов измерения следует проводить только один раз в каждом направлении, чтобы уменьшить воздействие игольчатых электродов на кожу и мышечную ткань. При возникновении кровотечения осторожно вытрите кровь перед выполнением второго измерения. Восстановление животных происходит сразу после прекращения изофлурановой анестезии, и процедура не требует обезболивающего лечения.

3. Ex vivo EIM

1. Подготовьте диэлектрическую ячейку ex vivo (рисунок 2G,H), добавьте солевой раствор в камеру и подключите ячейку к устройству EIM для получения эталонных значений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Значения фазы и реактивного сопротивления физиологического раствора должны оставаться постоянными при нуле или около нуля, а значения сопротивления физиологического раствора должны оставаться постоянными на уровне приблизительно 100 ± 25 Ω в диапазоне частот от 1 кГц до 1 МГц.
2. Усыплите животное в соответствии с соответствующими руководящими принципами IACUC.
3. С помощью ножниц отрежьте кожу возле ахиллова сухожилия. Используя пинцет, потяните кожу движением вверх, чтобы раскрыть подлежащие мышцы и фасции. Аккуратно рассекните бицепс бедра, накладывая икроножную мышцу и разрезая седалищный нерв.
4. Отрежьте ахиллово сухожилие, чтобы освободить дистальный конец икроножных и камбаловидных мышц, и осторожно потяните сухожилие вверх, используя ножницы для удаления любых прикреплений. Как только все насадки будут удалены, с помощью ножниц отрежьте ростральный конец камбаловидной мышцы и удалите его.
5. Используйте ножницы, чтобы рассечь головки икроножной мышцы вокруг коленной чашечки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После удаления икроножной мышцы важно помнить первоначальную ориентацию миофибров.
6. Поместите икроножную мышцу на лист зубного воска и разделите ее с помощью лезвия бритвы и линейки, чтобы получить срез 10 мм х 10 мм от центра икроножной мышцы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Размер диэлектрической ячейки может быть настроен. Для крыс использовалась ячейка размером 10 мм x 10 мм, а для мышей — ячейка размером 5 мм x 5 мм.
7. Используя пинцет, осторожно поместите икроножную мышцу в диэлектрические клетки, убедившись, что волокна ориентированы продольно (т. Е. Каудальные и ростральные конечности должны касаться электродов). Убедитесь, что мышца полностью соприкасается с металлическими электродами.
8. Прикрепите верхнюю часть диэлектрической ячейки и вставьте две монополярные иглы (26 G) в два отверстия. Подключите провода от устройства EIM к ячейке ex vivo в следующем порядке: (1: I+, 2: V+, 3: V-, 4: I-, где I представляет электроды тока, а V представляет электроды напряжения). Приобретите продольное измерение.
9. Откройте диэлектрическую ячейку и переориентируйте мышцу в поперечном направлении, повернув ее на 90°. Прикрепите верхнюю часть диэлектрической ячейки. Получите поперечное измерение.

Результаты

EIM может быть получен во многих условиях, включая поверхностные массивы in vivo (рисунок 1), игольчатые массивы in vivo (рисунок 2A-F) и диэлектрические элементы ex vivo (рисунок 2G, H).

EIM обеспечи?...

Обсуждение

В данной статье приведены основные методы проведения EIM у грызунов, как in vivo , так и ex vivo. Для получения надежных измерений крайне важно выполнить ряд шагов. Во-первых, нужно правильно определить интересующую мышцу, так как каждая мышца будет иметь разные реакции на заболевания, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3D Printer	Formlabs Inc.	Form 2 Desktop	3D printer
3D Printer	Shenzhen Creality 3D Technology Co. LTD	Creality Ender 3 V2	3D printer
3M Micropore surgical tape	Fisher	19-027761 and 19-061655	models 1530-0 and 1530-1
3M TRANSPORE surgical tape	Fisher	18-999-380 and 18-999-381	models 1527-0 and 1527-1
Connector header vertical 10 POS 1 mm spacing	Digi-Key (Sullins connector solution)	S9214-ND (SMH100-LPSE-S10-ST-BK)	Plastic spacer 1 mm holes for the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Cotton-tipped applicators	Fisher	22-363-172
Dental Wax	Fisher	NC9377103
Depilatory agent	NAIR	NA	hair remover lotion with softening baby oil
Dumont #7b Forceps	Fine Science Tools	No. 11270-20	Used for dissection, Style: #7b, Tip Shape: Curved, Tips: Standard, Tip Dimensions: 0.17 mm x 0.1 mm, Alloy/Material: Inox, Length: 11 cm
Electronic Digital Caliper	Fisher	14-648-17	Used to measure out the dimensions of the Gastrocnemius muscle
Epoxy adhesive dual cartridge 4 min work life	Devcon	series 14265, model 2217	Glue used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Ex vivo dielectric impedance cell	Custom	NA	Dielectric cells were 3D printed in the Rutkove laboratory
Graefe Forceps	Fine Science Tools	No. 11051-10	Used for muscle to place and adjust, Length: 10 cm, Tip Shape: Curved, Tips: Serrated, Tip Width: 0.8 mm, Tip Dimensions: 0.8 mm x 0.7 mm, Alloy/Material
Hair clipper	Amazon	NA	Wahl professional animal BravMini+
Impedance Animal Device	Myolex	EIM1103	mView system - investigational electrical impedance myography device for use in animal research
In vivo needle arrays	Custom	NA	Custom arrays using 27 G subdermal needles from Ambu. The construction was finalized using a 3D printer in the Rutkove laboratory
In vivo surface array	Custom	NA	The in vivo surface array was printed and assembled in the Rutkove laboratory
Isoflurane	Patterson Veterinary Supplies	07-893-8441 (NDC: 46066-755-04)	Pivetal - 250 mL bottle
Non-woven gauze	Fisher	22-028-559	2 x 2 inch
Polystyrene Weighing Dishes	Fisher	S67090A	Dimensions (L x W x H): 88.9 mm x 88.9 mm x 25.4 mm
Razor Blades	Fisher	12-640	Used to cut muscle to right dimensions, Single-edge carbon steel blades
Student Fine Scissors	Fine Science Tools	No. 91460-11	Used for dissection, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Student Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 20 mm, Length: 11.5 cm, Feature: Student Quality
Subdermal needles 27 G Neuroline	Ambu	745 12-50/24	Needles used in the rat in vivo array displayed in Figure 2A
Surgical Scissors - Sharp	Fine Science Tools	No. 14002-13	Used to cut skin, Tips: Sharp-Sharp, Alloy/Material: Stainless Steel, Serrated: No, Tip Shape: Straight, Cutting Edge: 42 mm, Length: 13 cm
TECA ELITE monopolar needle electrodes	Natus	902-DMG50-S	0.46 mm diameter (26 G). Blue hub
Teknova 0.9% saline solution	Fisher	S5815	1000 mL sterile