Mapas de micorrizas como herramienta para explorar patrones de colonización y estrategias fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays

Resumen

El protocolo aquí describe los métodos para la evaluación de los patrones de colonización de micorrizas arbusculares y la estrategia en raíces para dos especies: Zea mays y Festuca rubra. El uso del método MycoPatt permite el cálculo de parámetros, la conversión de estructuras micorrízicas en datos digitales y el mapeo de su posición real en raíces.

Resumen

Los hongos micorrízicos arbusculares son simbiontes en las raíces de las plantas. Su función es sostener el desarrollo del huésped y mantener el equilibrio nutricional en los ecosistemas. El proceso de colonización depende de varios factores como la ecología del suelo, la diversidad genética de los hongos y el huésped, y las prácticas agronómicas. Su acción sincronizada conduce al desarrollo de una compleja red hifal y conduce al desarrollo secundario de vesículas y arbúsculos en las células de la raíz. El objetivo de esta investigación fue analizar la eficiencia del método de patrones micorrícicos (MycoPatt) para el posicionamiento de estructuras fúngicas en las raíces de Festuca rubra y Zea mays. Otro objetivo fue explorar la estrategia de colonización fúngica revelada por los mapas micorrícicos de cada especie. La adquisición y ensamblaje de múltiples imágenes microscópicas permite la evaluación de la colonización micorrízica tanto en plantas de maíz como de festuca roja para proporcionar información sobre la posición realista de las estructuras desarrolladas. Los patrones micorrízicos observados resaltan la eficiencia variable de cada planta en términos de desarrollar conexiones con hongos simbióticos del suelo, causados por los tratamientos aplicados y la etapa de crecimiento. Los mapas detallados de micorrizas obtenidos a través del método MycoPatt son útiles para la detección temprana de la eficiencia de la planta en la adquisición simbiótica del suelo.

Introducción

Los hongos micorrizas arbusculares (AM) son una categoría de endófitos transmitidos por el suelo que son constantemente un área de interés para los investigadores. Su presencia en las raíces de la mayoría de las plantas y su participación en los ciclos de nutrientes los convierte en componentes vitales en la estabilidad de todos los ecosistemas donde las plantas herbáceas están presentes ^1,2. A través de su micelio extrarradicular, AM actúa como una extensión fúngica para las raíces de las plantas, especialmente en áreas de difícil acceso³. La actividad principal es en las raíces de la planta huésped, donde la AM desarrolla grandes redes de hifas y estructuras intracelulares específicas llamadas arbúsculos. La falta de especificidad del huésped permite que el simbionte colonice múltiples especies al mismo tiempo. Esta capacidad proporciona a la AM el papel de la asignación de recursos y la regulación de nutrientes en el ecosistema; El hongo también proporciona apoyo en la supervivencia de la planta y ayuda en el rendimiento de la planta 4,5,6,7. La reacción de las especies AM a las raíces huésped es visible en la extensión y localización del micelio intrarradicular y la presencia y forma de los arbúsculos desarrollados intracelularmente. Los arbúsculos intracelulares actúan como un punto de intercambio entre los dos simbiontes y representan áreas caracterizadas por procesos de transferencia rápida. Las estructuras que produce la AM dependen de la especie y, además de los arbúsculos, en las raíces, también desarrollan vesículas, esporas y células auxiliares.

Existen muchos desafíos en la evaluación de simbiontes AM en raíces de plantas ^8,9. El primero es su desarrollo constante durante todo el período vegetativo de los huéspedes, lo que conduce a múltiples cambios en la estructura arbuscular hifal. Las diferentes etapas del crecimiento arbuscular, hasta su colapso, están claramente presentes en las raíces, pero las estructuras AM senescentes a veces se digieren, lo que las hace solo parcialmente visibles¹⁰. El segundo desafío está representado por el método y el protocolo de tinción, la gran diversidad de sistemas radiculares, la dimensión de sus células y las diferencias de grosor, que dificultan la propuesta de un método unificado. El último desafío está representado por la evaluación y puntuación de la colonización AM. Existen numerosos métodos que puntúan AM con diferentes grados de objetividad, y la mayoría de ellos todavía están restringidos a las técnicas de microscopía. Los simples se basan en la presencia/ausencia de estructuras en la corteza radicular, mientras que los más complejos se basan en la puntuación visual y el uso de clases de colonización, con la integración de la frecuencia e intensidad del fenómeno de colonización. Se han producido muchos datos en las últimas décadas sobre el estado micorrízico de múltiples especies, pero la mayoría de los métodos se limitan al valor observado de la colonización sin apuntar a la posición real de cada estructura en la corteza radicular. Como respuesta a la necesidad de resultados más precisos sobre la colonización de AM, se desarrolló un método basado en el análisis microscópico de patrones de micorrizas (MycoPatt) en raíces para ensamblar, en forma digital, los mapas micorrícicos detallados¹¹. Además, el método permite el cálculo objetivo de los parámetros de colonización y la determinación de la posición real de cada estructura en la raíz.

La posición de las estructuras fúngicas AM puede ser importante para responder a las siguientes dos preguntas. El primero está relacionado con el análisis de la colonización en un momento específico del ciclo vegetativo de una planta. En este contexto, es muy útil observar la abundancia arbuscular/vesicular, informar cómo se ubican en la raíz y proporcionar una imagen y parámetros de colonización muy claros. El segundo está relacionado con la detección de la estrategia fúngica y su orientación e incluso la previsión de su desarrollo futuro. Una aplicación del MycoPatt puede ser para plantas analizadas diariamente, cada 2-3 días, semanalmente o durante varias etapas de crecimiento. En este contexto, la ubicación de las vesículas/arbúsculas es importante para comprender mejor el mecanismo biológico de la colonización AM. Estos parámetros y observaciones son muy útiles para complementar los parámetros matemáticos.

El objetivo de este artículo es demostrar la capacidad del sistema MycoPatt para explorar el potencial y la estrategia de colonización de hongos AM nativos en raíces de Zea mays (maíz) durante diferentes etapas de desarrollo y en raíces de Festuca rubra (festuca roja) bajo diferentes condiciones de fertilización a largo plazo. Para cumplir con el objetivo, se analizaron dos grandes bases de datos de dos experimentos. El experimento de maíz se estableció en Cojocna (46°44′56" lat. N y 23°50′0" de largo. E), en la Granja Didáctica Experimental de la Universidad de Ciencias Agrícolas y Veterinarias de Cluj sobre un feozión con un suelo de textura arcillosa¹². El experimento de la festuca roja es parte de un sitio experimental más grande establecido en 2001 en Ghețari, montañas Apuseni (46 ° 49'064 "lat. N y 22 ° 81'418 '' de largo. E), sobre un suelo preluvosol (terra rossa) tipo^13,14. El maíz se recolectó en cinco fenofases de crecimiento diferentes¹²: B1 = 2-4 hojas (como punto de control para el inicio de la colonización micorrízica); B2 = 6 hojas; B3 = 8-10 hojas; B4 = formación de mazorca; B5 = madurez fisiológica. A partir de la etapa de 2-4 hojas (A0), se aplicó un tratamiento orgánico, que resultó en un factor de dos graduación (A1 = control y A2 = tratado). Las raíces de festuca roja fueron recolectadas en la floración de un experimento con cinco fertilizaciones a largo plazo^13,14: V1 = control^, no fertilizada; V2 = 10 t·^ha-1 estiércol; V3 = 10 t·ha-1 estiércol + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 estiércol + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Se recolectaron cinco plantas en cada etapa de desarrollo de cada variante de fertilización. Se analizaron los protocolos de tinción y su rendimiento en términos de tiempo de procesamiento de la muestra y calidad de la tinción. La relación entre el desarrollo de las hifas AM y la presencia de sus estructuras en las raíces se analizó por separado para cada especie y se continuó con la identificación de las raíces más permisivas para la colonización. Los patrones de colonización específicos de cada sistema radicular se analizaron en base a mapas de colonización y el valor de los parámetros AM.

El maíz es una planta anual, lo que implica un crecimiento continuo de las raíces, y esa fue la razón principal para aplicar el MycoPatt en las etapas de crecimiento. La festuca roja es una planta perenne de un pastizal tratada durante mucho tiempo con diferentes fertilizantes. Sus raíces tienen un desarrollo más corto de 1 año, y la antesis se considera como el punto de vegetación cuando la planta cambia su metabolismo de vegetativo a generativo. Para capturar estas plantas durante estos intensos períodos de actividad, se eligieron los puntos de tiempo mencionados anteriormente. El muestreo durante el período de vegetación es difícil para esta especie cuando se cultiva en pastizales naturales.

Protocolo

1. Selección del material biológico, muestreo radicular y almacenamiento

1. Recoja toda la raíz de las plantas con una pala (Figura 1A) por separado para cada variante y replíquela. Retire suavemente, a mano, los grandes agregados de tierra de las raíces. Lave todo el sistema radicular y mídalo en una escala con células de 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Corte las raíces por separado para cada planta y colóquelas en una bolsa de plástico.
2. Recoja todas las raíces limpias de cada planta en una bolsa de plástico y recoja todas las muestras de una variante en una bolsa más grande. Escriba en cada bolsa el nombre de la etapa/variante y la fecha de muestreo. Almacene las raíces en un refrigerador o congelador a una temperatura entre -4 ° C y -20 ° C hasta el procesamiento.

2. Procesamiento radicular, limpieza y tinción para microscopía

NOTA: Use guantes, una máscara y una capucha microbiológica/química para este paso del protocolo.

1. Asegúrese de que el proceso de descongelación de la raíz se realiza lentamente a temperatura ambiente. Para todos los pasos del procesamiento, use frascos pequeños (30-50 ml) para reducir la cantidad de agentes necesarios.
2. Realice los siguientes cuatro pasos del procedimiento de limpieza y tinción lenta¹⁵. Haga todos los pasos a temperatura ambiente. Este método permite el procesamiento de una gran cantidad de muestras al mismo tiempo sin el uso de un baño de agua para hervir.
   1. Limpieza de raíces: Coloque todas las raíces de una planta en un frasco. Prepare una solución de NaOH al 10% con agua del grifo y viértala en cada frasco hasta que cubra completamente las raíces. Agite los frascos vigorosamente durante 1 minuto o 2 minutos para producir una dispersión homogénea de la solución de aclaramiento en las raíces. Repita este procedimiento después de 24 h y deje las raíces en la solución de aclaramiento durante al menos 48 h.
      NOTA: Las raíces limpias tienen un aspecto amarillo pálido (hasta blanco), y la consistencia es suave (se pueden aplastar fácilmente presionando con una pinza).
   2. Enjuague de raíces: Pase el contenido de un frasco a la vez a través de un tamiz. Recicle la solución de limpieza. Enjuague las raíces varias veces con agua del grifo hasta que la solución de limpieza se elimine por completo.
      NOTA: Si la solución de limpieza no se elimina por completo, afectará la calidad del procedimiento de tinción.
   3. Tinción de la raíz: Coloque las raíces enjuagadas en un frasco limpio. Prepare una solución de vinagre de tinta al 5%:5% con agua del grifo (5 ml de tinta azul + 5 ml de ácido acético al 9% + 90 ml de agua del grifo). Vierta la solución en cada frasco hasta que cubra completamente las raíces. Agite los frascos vigorosamente durante 1 minuto o 2 minutos para producir una dispersión homogénea de la solución de tinción en las raíces. Repita este procedimiento después de 24 h y deje las raíces en esta solución durante 48 h.
      NOTA: Las raíces manchadas tienen un color azul intenso.
   4. Decoloración parcial de la raíz: Enjuague las raíces manchadas con agua del grifo durante 1-2 minutos. Agite los frascos vigorosamente para eliminar la solución de tinción adicional. Repita el procedimiento si la tinción es demasiado intensa y no permite una evaluación microscópica clara.
      NOTA: Las raíces teñidas se pueden mantener en agua del grifo hasta por 1 semana a temperatura ambiente sin alterar la calidad de la tinción (Figura 2). Durante períodos más largos, las raíces se pueden mantener hasta 2-3 meses en una solución comercial de vinagre de manzana al 5% (ácido acético al 5%).

3. Procesamiento radicular para microscopía

1. Segmentación de raíces: Coloque las raíces teñidas de cada muestra en una tabla de cortar a escala (Figura 3A). Corte las raíces en segmentos de 1 cm (Figura 3B). Elija 15 segmentos para cada variante.
2. Método de trituración suave para la preparación de segmentos: Extienda las raíces en un portaobjetos. Use una bolsa laminadora para cubrir las raíces y aplastarlas suavemente comenzando desde un borde (Figura 3C, D). Use una herramienta de plástico blando, por ejemplo, pinzas, mango de bisturí, bolígrafo o un lápiz con un borrador, para mostrar lentamente las raíces en la diapositiva. Retire con cuidado la bolsa laminadora y cubra la muestra con un cubreobjetos (Figura 3E).
   NOTA: Las raíces tienen una forma tubular, por lo que es necesario separarlas en un plano bidimensional. Esta acción supone la separación de raíces en el punto medio, lo que lleva a la visualización de las dos partes del diámetro interno. El uso de bolsas laminadas en el procedimiento de trituración suave permite la visualización de las raíces, que tienen forma de cilindro, en dos piezas, una a la izquierda y otra a la derecha, hacia su punto medio. De esta manera, toda la raíz se analiza en profundidad, y el grado de colonización es el parámetro que muestra la colonización volumétrica (descrito en el trabajo original sobre MycoPatt¹¹). Básicamente, cortamos un cilindro por la mitad, y después de eso, lo reconstruimos matemáticamente.
3. Agregue agua a una esquina del tobogán con una pipeta y deje que el agua se extienda lentamente sobre el portaobjetos (Figura 3F). Retire el exceso de agua con una toalla de papel.

4. Análisis microscópico de las muestras radiculares

1. Utilice un microscopio equipado con una cámara de buena resolución.
2. Analice las diapositivas a partir de una extremidad. Captura cada campo microscópico. Cambie el nombre de cada imagen capturada con un código que permita el post-ensamblaje real de las partes raíz. Para raíces gruesas, use el aumento de 10x o 40x, y para raíces delgadas, use el aumento de 40x. Utilice el mismo objetivo y aumento para todo el conjunto de raíces de una especie.

5. Ensamblaje de imágenes post-microscopía

1. Utilice software de presentación para diseñar un tablero de dibujo para el ensamblaje de imágenes. Establezca el ancho 2-3 cm más ancho que el ancho de la imagen. Agregue todas las imágenes capturadas de un segmento en el orden de su captura y reconstruya toda la longitud del segmento raíz (Figura 4A).
   1. En resumen, reúna un total de 15 imágenes para cada segmento de 1 cm y organícelas verticalmente, comenzando con 1 a 15, en el software de presentación para reconstruir el segmento.
2. Alinee las imágenes en el centro. Utilice la alineación vertical para asegurarse de que cada imagen sigue a la anterior. En todas las imágenes, coloque una cuadrícula de 10 celdas x 150 celdas para cubrir todo el segmento de raíz.
   1. Además, en cada imagen individual, coloque una cuadrícula de 10 x 10, y en cada celda de esta cuadrícula, inserte un número del uno al seis si una estructura AM es visible o déjela en blanco si no hay ninguna estructura AM presente. De esta manera, la precisión del proceso es máxima sin errores en la ubicación de las estructuras AM que se observan.
3. Agregue una tabla para una cuadrícula de 10 celdas de ancho y 150 celdas de largo (15 cuadrados de 10 celdas x 10 celdas). Cambie las dimensiones del ancho de la tabla al ancho de las imágenes. Cambie la longitud de la tabla para que comprenda todas las imágenes (Figura 4B).

6. Puntuación de la colonización micorrízica

1. Utilice el número único para puntuar cada tipo de estructura como se describe en el método de patrones micorrícicos¹¹: 1 para hifas; 2 para arbúsculos; 3 para vesículas; 4 para esporas; 5 para las células auxiliares; y 6 para los puntos de entrada (Figura 4C). Puntúe cada estructura micorrízica observada de cada celda de las cuadrículas aplicadas previamente (Figura 4D).

7. Análisis de datos brutos y extracción de resultados

1. Inserte todas las puntuaciones obtenidas en la hoja de cálculo¹¹ de MycoPatt. Utilice la función de copiar/pegar para transferir todas las puntuaciones de la presentación a la primera hoja denominada rawdata (Figura 5).
2. Análisis primario de resultados: Utilice la tercera hoja con nombres de parámetros en la herramienta de hoja de cálculo MycoPatt para visualizar los resultados como porcentajes (%) por separado en tres formas (Figura 6A-C). Utilice las columnas A a K para analizar la imagen horizontal de la colonización; columnas M a W para analizar la imagen vertical de la colonización; y las columnas Y a AI para analizar la colonización transversal (promedio) para cada uno de los 15 cuadrados de 10 x 10 (líneas 2-17) y la colonización promedio final (líneas 19-20).
   NOTA: La colonización media transversal se utiliza para el cálculo de los parámetros de colonización real, relacionados con el análisis horizontal y vertical. De esta manera, no se pueden cometer errores en comparación con si solo se utiliza el análisis horizontal o vertical (descrito en detalle en el trabajo original¹¹). Además, este conjunto de parámetros se calcula para toda la superficie del campo microscópico.
   1. Utilice las definiciones y fórmulas, específicas para cada parámetro, para analizar los resultados¹¹. Utilice los siguientes parámetros de colonización: frecuencia de colonización (%), intensidad de colonización (%), arbúsculos (%) y vesículas (%), esporas (%) y células auxiliares (%), puntos de entrada (%), el porcentaje de áreas no micorrízicas (%), el grado general de colonización (%) y el informe de áreas micorrizas/no micorrízicas.
      NOTA: Si faltan arbúsculos, vesículas, esporas, células auxiliares y puntos de entrada en las muestras analizadas, la hoja de cálculo MycoPatt las calificará como cero (0).
3. Producción y extracción de mapas de micorrizas: Visualizar la imagen obtenida de la conversión de código de estructuras micorrízicas en colores en la segunda hoja de los gráficos de MycoPatt (Figura 7A). Exporte la imagen resultante en la hoja de gráficos como una imagen (Figura 7B). Utilice el código de color en la leyenda para el análisis de patrones micorrízicos.
4. Análisis de mapas de micorrizas: Identificar las estructuras más importantes y su ensamblaje en mapas de micorrizas. Describir el patrón de colonización micorrízica observado en las raíces analizadas. Describir la estrategia de colonización micorrízica basada en el desarrollo estructural observado en la raíz, el patrón de ramificación y el desarrollo de arbúsculas/vesículas.

Resultados

El uso correcto del método de trituración suave de las raíces después de los procedimientos de tinción proporciona buenos detalles de las estructuras micorrízicas, tanto para Zea mays (Figura 8A-C) como para Festuca rubra (Figura 9A-E), buen contraste entre las estructuras micorrízicas y las células radiculares, y una confirmación de la estela debido al color azul. Si ...

Discusión

Los estudios sobre la colonización micorrízica son vitales para el desarrollo de nuevas estrategias en el campo agronómico. El potencial de múltiples plantas cultivadas para formar una asociación simbiótica con las micorrizas arbusculares las convirtió en un componente importante del desarrollo sostenible del agroecosistema y del mantenimiento de su salud 16,17,18,19,20.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	O?ET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb