Festuca rubra와 Zea mays의 뿌리에서 식민지화 패턴과 곰팡이 전략을 탐구하는 도구로서의 균근 지도

요약

여기의 프로토콜은 Zea mays 와 Festuca rubra의 두 종에 대한 뿌리의 arbuscular mycorrhizal 식민지화 패턴과 전략을 평가하는 방법을 설명합니다. MycoPatt 방법을 사용하면 매개 변수 계산, 균근 구조를 디지털 데이터로 변환하고 뿌리에서 실제 위치를 매핑 할 수 있습니다.

초록

Arbuscular 균근 곰팡이는 식물의 뿌리에있는 공생체입니다. 그들의 역할은 숙주 발달을 유지하고 생태계의 영양 균형을 유지하는 것입니다. 식민지화 과정은 토양 생태학, 곰팡이와 숙주의 유전 적 다양성, 농업 관행과 같은 여러 요인에 따라 달라집니다. 그들의 동기화 된 작용은 복잡한 균사 네트워크의 발달로 이어지고 뿌리 세포에서 소포와 arbuscules의 2 차 발달로 이어진다. 이 연구의 목적은 Festuca rubra 및 Zea mays의 뿌리에서 곰팡이 구조의 위치를위한 균근 패턴 (MycoPatt) 방법의 효율성을 분석하는 것이 었습니다. 또 다른 목표는 각 종의 균근 지도에 의해 밝혀진 곰팡이 식민지화 전략을 탐구하는 것이었습니다. 여러 현미경 이미지의 획득 및 조립을 통해 옥수수 및 적색 페스 큐 식물 모두에서 균근 집락 평가를 통해 개발 된 구조의 실제 위치에 대한 정보를 제공 할 수 있습니다. 관찰 된 균근 패턴은 적용된 처리 및 성장 단계로 인한 토양 공생 균류와의 연결 개발 측면에서 각 식물의 다양한 효율성을 강조합니다. MycoPatt 방법을 통해 얻은 Mycorrhizal 상세지도는 토양에서 공생 획득에서 식물 효율성을 조기에 감지하는 데 유용합니다.

서문

Arbuscular mycorrhiza (AM) 곰팡이는 연구자들에게 지속적으로 관심있는 토양 매개 내생 식물의 범주입니다. 대부분의 식물의 뿌리에 존재하고 영양 순환에 관여하기 때문에 초본 식물이 존재하는 모든 생태계의 안정성에 중요한 구성 요소가 됩니다 ^1,2. 그들의 여분의 방사상 균사체를 통해 AM은 특히 도달하기 어려운 지역에서 식물 뿌리에 대한 곰팡이 확장 역할을합니다³. 주요 활동은 숙주 식물 뿌리에 있으며, AM은 큰 균사 네트워크와 arbuscules라고하는 특정 세포 내 구조를 개발합니다. 숙주 특이성이 없기 때문에 공생체가 동시에 여러 종을 식민지화 할 수 있습니다. 이 능력은 AM에게 생태계에서 자원 할당 및 영양 조절의 역할을 제공합니다. 곰팡이는 또한 식물 생존을 지원하고 식물 성능 4,5,6,7을 돕습니다. 숙주 뿌리에 대한 AM 종의 반응은 방사상 내 균사체의 확장 및 위치 및 세포 내에서 발달 된 arbuscules의 존재와 모양에서 볼 수 있습니다. 세포 내 arbuscules는 두 공생 사이의 교환 지점 역할을하며 빠른 전달 과정을 특징으로하는 영역을 나타냅니다. AM이 생산하는 구조는 종 의존적이며 뿌리에서 arbuscules 외에도 소포, 포자 및 보조 세포를 개발합니다.

식물 뿌리 ^8,9에서 AM 공생체를 평가하는 데는 많은 어려움이 있습니다. 첫 번째는 숙주의 전체 식생 기간 동안 지속적으로 발달하여 균사 arbuscular 구조에 여러 가지 변화를 가져옵니다. 붕괴까지의 arbuscular 성장의 여러 단계는 뿌리에 분명히 존재하지만, 노화 AM 구조는 때때로 소화되어 부분적으로 만 볼 수 있습니다¹⁰. 두 번째 과제는 염색 방법 및 프로토콜, 뿌리 시스템의 다양성, 세포의 크기 및 두께의 차이로 대표되며, 이로 인해 통일 된 방법을 제안하기가 어렵습니다. 마지막 도전은 AM 식민지화의 평가 및 점수로 표현됩니다. 다양한 객관성으로 AM에 점수를 매기는 방법은 여러 가지가 있으며 대부분은 여전히 현미경 기술로 제한됩니다. 단순한 것들은 뿌리 피질의 구조 유무를 기반으로하는 반면, 더 복잡한 것들은 식민지 현상의 빈도와 강도의 통합과 함께 시각적 점수 매기기와 식민지화 클래스의 사용을 기반으로합니다. 지난 수십 년 동안 여러 종의 균근 상태에 대한 많은 데이터가 생성되었지만 대부분의 방법은 뿌리 피질의 각 구조의 실제 위치를 가리 키지 않고 관찰 된 식민지화 값으로 제한됩니다. AM 집락화에 대한 보다 정확한 결과의 필요성에 대한 응답으로, 뿌리의 균근 패턴(MycoPatt)의 현미경 분석에 기초한 방법이 개발되어 상세한 균근 지도(¹¹)를 디지털 형태로 조립했습니다. 또한이 방법을 사용하면 식민지화 매개 변수를 객관적으로 계산하고 루트에서 각 구조의 실제 위치를 결정할 수 있습니다.

AM 곰팡이 구조의 위치는 다음 두 가지 질문에 답하는 데 중요 할 수 있습니다. 첫 번째는 식물의 식생주기에서 특정 순간의 식민지화 분석과 관련이 있습니다. 이러한 맥락에서 수목/소포 풍부도를 관찰하고, 뿌리에 어떻게 위치하는지 보고하고, 매우 명확한 식민지화 이미지와 매개변수를 제공하는 것이 매우 유용합니다. 두 번째는 곰팡이 전략의 탐지와 그 방향, 심지어 미래 발전의 예측과 관련이 있습니다. MycoPatt의 한 가지 응용 분야는 매일, 2-3일마다, 매주 또는 다양한 성장 단계에서 분석된 식물을 위한 것입니다. 이러한 맥락에서 소포 / arbuscules의 위치는 AM 식민지화의 생물학적 메커니즘을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이러한 매개 변수와 관찰은 수학적 매개 변수를 보완하는 데 매우 유용합니다.

이 기사의 목적은 MycoPatt 시스템이 다양한 발달 단계에서 Zea mays (옥수수) 뿌리와 다양한 장기 수정 조건에서 Festuca rubra (붉은 페스 큐) 뿌리에서 토착 AM 곰팡이 식민지화 잠재력과 전략을 탐구 할 수있는 능력을 입증하는 것입니다. 목표를 달성하기 위해 두 번의 실험에서 두 개의 큰 데이터베이스를 분석했습니다. 옥수수 실험은 Cojocna (북위 46 ° 44′ 56 "및 길이 23 ° 50′0")에서 확립되었습니다. E), 농업 과학 및 수의학 대학의 실험 교훈 농장에서 Cluj는 양토 질감의 토양을 가진 phaeoziom에¹². 적색 페스큐 실험은 2001년 아푸세니 산맥의 게샤리(북위 46°49'064" 및 길이 22°81'418'')에 설립된 더 큰 실험 사이트의 일부입니다. E), 프렐루보솔(테라로사) 토양 유형^13,14. 옥수수는 5 개의 다른 성장 표현상¹²에서 수집되었다 : B1 = 2-4 잎 (균근 식민지화 시작을위한 조절점으로서); B2 = 6 잎; B3 = 8-10 잎; B4 = 개암 나무 열매 형성; B5 = 생리적 성숙도. 2-4 잎 단계 (A0)에서 시작하여 유기 처리가 적용되어 2 개의 눈금 계수 (A1 = 대조군 및 A2 = 처리)가 발생했습니다. 붉은 fescue의 뿌리는 5 개의 장기 수정^13,14 실험에서 개화시 수집되었습니다 : V1 = 대조군^, 비 수정; V2 = 10 t·^ha-1 분뇨; V3 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P2O5 50 kg·ha-1,_K2O50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 분뇨 + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. 각 개발 단계에서 모든 수정 변종에서 5 개의 식물을 수집했습니다. 염색 프로토콜과 샘플 처리 시간 및 염색 품질 측면에서 그 성능을 분석했습니다. AM 균사 발달과 뿌리에서의 구조 존재 사이의 관계는 각 종에 대해 개별적으로 분석되었으며 식민지화에 가장 관대 한 뿌리를 식별하는 것으로 계속되었습니다. 각 루트 시스템의 특정 식민지화 패턴은 식민지화 맵과 AM 매개 변수의 값을 기반으로 분석되었습니다.

옥수수는 뿌리의 지속적인 성장을 의미하는 일년생 식물이며, 이것이 성장 단계에서 MycoPatt를 적용하는 주된 이유였습니다. Red fescue는 다른 비료로 오랫동안 처리 된 초원의 다년생 식물입니다. 그것의 뿌리는 1 년의 더 짧은 발달을 가지고 있고, anthesis는 식물이 신진 대사를 식물에서 생식으로 바꿀 때 식생 지점으로 간주됩니다. 이 강렬한 활동 기간 동안 이러한 식물을 잡기 위해 위에서 언급 한 시점이 선택되었습니다. 식생 기간 동안의 샘플링은 자연 초원에서 재배 될 때이 종에 대해 어렵습니다.

프로토콜

1. 생물학적 물질 선택, 뿌리 샘플링 및 저장

1. 각 변종에 대해 별도로 삽 (그림 1A)으로 식물의 전체 뿌리를 수집하고 복제하십시오. 뿌리에서 큰 토양 응집체를 손으로 부드럽게 제거하십시오. 전체 뿌리 시스템을 씻고 1cm x 1cm 셀로 눈금으로 측정하십시오 (그림 1B). 각 식물에 대해 뿌리를 따로 자르고 비닐 봉지에 넣으십시오.
2. 비닐 봉지에 각 식물의 깨끗한 뿌리를 모두 모으고 하나의 큰 봉지에 한 변종의 모든 샘플을 수집하십시오. 각 가방에 스테이지/변형 이름과 샘플링 날짜를 적습니다. 가공할 때까지 뿌리를 -4°C에서 -20°C 사이의 온도에서 냉장고 또는 냉동고에 보관하십시오.

2. 현미경을 위한 뿌리 처리, 제거 및 염색

알림: 프로토콜의 이 단계에서는 장갑, 마스크 및 미생물학적/화학적 후드를 사용하십시오.

1. 루트 해동 과정이 실온에서 천천히 수행되는지 확인하십시오. 모든 가공 단계에서 작은 항아리 (30-50 mL)를 사용하여 필요한 약제의 양을 줄이십시오.
2. 서른 클리어링 및 염색 절차¹⁵의 다음 4단계를 수행한다. 실온에서 모든 단계를 수행하십시오. 이 방법을 사용하면 끓기 위해 수조를 사용하지 않고도 동시에 많은 수의 샘플을 처리 할 수 있습니다.
   1. 뿌리 정리 : 한 식물의 모든 뿌리를 항아리에 넣습니다. 수돗물로 10 % NaOH 용액을 준비하고 뿌리를 완전히 덮을 때까지 각 병에 부어 넣으십시오. 항아리를 1 분 또는 2 분 동안 격렬하게 흔들어 뿌리에 균일 한 맑은 용액이 분산되도록합니다. 24 시간 후에이 절차를 반복하고 적어도 48 시간 동안 클리어링 용액에 뿌리를 두십시오.
      알림: 깨끗한 뿌리는 옅은 노란색 (흰색까지) 측면을 가지며 일관성이 부드럽습니다 (핀셋으로 눌러 쉽게 분쇄 할 수 있음).
   2. 뿌리 헹굼 : 한 번에 한 병의 내용물을 체에 통과시킵니다. 클리어링 용액을 재활용하십시오. 클리어링 용액이 완전히 제거 될 때까지 수돗물로 뿌리를 여러 번 헹굽니다.
      알림: 투명화 용액이 완전히 제거되지 않으면 염색 절차의 품질에 영향을 미칩니다.
   3. 뿌리 염색 : 헹군 뿌리를 깨끗한 병에 넣으십시오. 수돗물(파란색 잉크 5mL + 9% 아세트산 5mL + 수돗물 90mL)로 5%:5% 잉크 식초 용액을 준비합니다. 뿌리를 완전히 덮을 때까지 각 병에 용액을 붓습니다. 항아리를 1 분 또는 2 분 동안 격렬하게 흔들어 뿌리에 균일 한 염색 용액 분산을 생성합니다. 24 시간 후에이 절차를 반복하고이 용액에 뿌리를 48 시간 동안 그대로 두십시오.
      참고: 얼룩진 뿌리는 강렬한 파란색을 띠고 있습니다.
   4. 뿌리 부분 얼룩 제거: 얼룩진 뿌리를 수돗물에 1-2분 동안 헹굽니다. 항아리를 세게 흔들어 여분의 얼룩 용액을 제거하십시오. 염색이 너무 강렬하고 명확한 현미경 평가를 허용하지 않는 경우 절차를 반복하십시오.
      참고: 염색된 뿌리는 염색 품질을 변경하지 않고 실온에서 최대 1주일 동안 수돗물에 보관할 수 있습니다(그림 2). 더 오랜 기간 동안 뿌리는 5 % 상업용 사과 식초 용액 (5 % 아세트산)에서 최대 2-3 개월 동안 유지 될 수 있습니다.

3. 현미경 검사를위한 루트 처리

1. 뿌리 분할: 각 샘플의 염색된 뿌리를 스케일링된 도마에 놓습니다(그림 3A). 뿌리를 1cm 세그먼트로 자릅니다 (그림 3B). 각 변형에 대해 15개의 세그먼트를 선택합니다.
2. 세그먼트 준비를위한 부드러운 분쇄 방법 : 슬라이드에 뿌리를 펼칩니다. 라미네이팅 파우치를 사용하여 뿌리를 덮고 가장자리에서 시작하여 부드럽게 분쇄합니다(그림 3C, D). 핀셋, 메스 손잡이, 펜 또는 지우개가 달린 연필과 같은 부드러운 플라스틱 도구를 사용하여 슬라이드에 뿌리를 천천히 표시합니다. 라미네이팅 파우치를 조심스럽게 제거하고 커버슬립으로 샘플을 덮습니다(그림 3E).
   참고 : 뿌리는 관형이므로 2 차원 평면에서 분리해야합니다. 이 동작은 중간 지점에서 뿌리가 분리되어 내경의 두 부분이 표시된다고 가정합니다. 부드러운 분쇄 절차에서 라미네이팅 파우치를 사용하면 실린더 형태의 뿌리를 왼쪽과 오른쪽에 하나씩 중간 지점을 향해 두 조각으로 표시 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 전체 루트를 심층적으로 분석하고 집락 정도는 체적 식민지화를 보여주는 매개 변수입니다 (MycoPatt¹¹의 원래 작업에 설명 됨). 기본적으로 실린더를 반으로 자른 후 수학적으로 다시 만듭니다.
3. 피펫으로 슬라이드 모서리에 물을 넣고 물이 슬라이드에 천천히 퍼지도록 합니다(그림 3F). 종이 타월로 여분의 물을 제거하십시오.

4. 뿌리 샘플의 현미경 분석

1. 좋은 해상도의 카메라가 장착 된 현미경을 사용하십시오.
2. 말단에서 시작하여 슬라이드를 분석합니다. 각 미세한 필드를 캡처합니다. 캡처된 각 이미지의 이름을 루트 파트의 실제 사후 조립을 허용하는 코드로 바꿉니다. 두꺼운 뿌리의 경우 10x 또는 40x 배율을 사용하고 얇은 뿌리의 경우 40x 배율을 사용합니다. 종의 전체 뿌리 집합에 대해 동일한 대물렌즈와 배율을 사용합니다.

5. 현미경 후 이미지 조립

1. 프레젠테이션 소프트웨어를 사용하여 이미지 조립을 위한 드로잉 보드를 디자인합니다. 너비를 이미지 너비보다 2-3cm 넓게 설정하십시오. 캡처 순서대로 한 세그먼트에서 캡처된 모든 이미지를 추가하고 루트 세그먼트의 전체 길이를 재구성합니다(그림 4A).
   1. 간단히 말해서, 각 1cm 세그먼트에 대해 총 15개의 사진을 수집하고 프레젠테이션 소프트웨어에서 1에서 15까지 수직으로 구성하여 세그먼트를 재구성합니다.
2. 이미지를 가운데에 맞춥니다. 수직 정렬을 사용하여 각 이미지가 이전 이미지를 따르도록 합니다. 모든 그림에서 전체 루트 세그먼트를 덮도록 10 셀 x 150 셀의 격자를 배치하십시오.
   1. 또한 각 개별 그림에 10 x 10 격자를 배치하고 이 격자의 모든 셀에 AM 구조가 표시되는 경우 1에서 6까지의 숫자를 삽입하고 AM 구조가 없는 경우 비워 둡니다. 이러한 방식으로 공정의 정확도는 관찰되는 AM 구조의 위치에 오류가 없이 최대입니다.
3. 너비가 10셀이고 길이가 150셀인 그리드에 대한 표를 추가합니다(10셀로 구성된 15제곱 x 10셀). 테이블 너비 치수를 이미지 너비로 변경합니다. 모든 이미지를 포함하도록 테이블의 길이를 변경합니다(그림 4B).

6. 균근 집락의 점수 매기기

1. 균근 패턴 방법¹¹에 설명 된대로 각 유형의 구조를 점수화하기 위해 고유 번호를 사용하십시오 : 균사에 대한 1; 2 arbuscules; 소포의 경우 3; 포자의 경우 4; 보조 셀의 경우 5; 진입점의 경우 6입니다(그림 4C). 이전에 적용된 그리드의 각 세포에서 관찰된 각 균근 구조에 점수를 매깁니다(그림 4D).

7. 원시 데이터 분석 및 결과 추출

1. 획득한 모든 점수를 MycoPatt 스프레드시트(¹¹)에 삽입한다. 복사/붙여넣기 기능을 사용하여 프레젠테이션의 모든 점수를 rawdata 라는 첫 번째 시트로 전송합니다(그림 5).
2. 결과의 기본 분석: MycoPatt 스프레드시트 도구에서 매개 변수라는 세 번째 시트를 사용하여 결과를 세 가지 형식으로 개별적으로 백분율(%)로 시각화합니다(그림 6A-C). A에서 K 열을 사용하여 식민지화의 수평 이미지를 분석합니다. 컬럼 M 내지 W 를 이용하여 식민지화의 수직 이미지를 분석하는 단계; 그리고 열 Y에서 AI로 15 개의 10 x 10 사각형 (2-17 행) 각각에 대한 횡단 (평균) 식민지화와 최종 평균 식민지화 (19-20 행)를 분석합니다.
   참고: 횡단 평균 식민지화는 수평 및 수직 분석과 관련된 실제 식민지화 매개변수의 계산에 사용됩니다. 이러한 방식으로, 수평 또는 수직 분석만이 사용되는 경우와 비교하여 오류가 발생할 수 없다(원본 작업⁽¹¹)에서 상세히 설명됨). 또한이 매개 변수 세트는 현미경 필드의 전체 표면에 대해 계산됩니다.
   1. 각 매개 변수에 특정한 정의와 공식을 사용하여 결과를 분석하십시오¹¹. 식민지화 빈도 (%), 식민지화 강도 (%), arbuscules (%) 및 소포 (%), 포자 (%) 및 보조 세포 (%), 진입 점 (%), 비 균근 영역의 백분율 (%), 전체 식민지화 정도 (%) 및 균근 / 비 균근 영역의보고.
      참고: 분석된 샘플에서 arbuscules, 소포, 포자, 보조 세포 및 진입점이 누락된 경우 MycoPatt 스프레드시트는 이를 영(0)으로 채점합니다.
3. 균근 지도의 생성 및 추출: MycoPatt 명명된 그래프의 두 번째 시트에서 균근 구조 코드를 색상으로 변환하여 얻은 이미지를 시각화 합니다 (그림 7A). 그래프 시트의 결과 이미지를 이미지로 내보냅니다(그림 7B). 균근 패턴 분석을 위해 범례의 색상 코드를 사용하십시오.
4. 균근 지도 분석: 균근 지도에서 가장 중요한 구조와 그 집합을 식별합니다. 분석된 뿌리에서 관찰된 균근 집락화 패턴을 설명하십시오. 뿌리에서 관찰된 구조적 발달, 분기 패턴 및 수목/소포 발달을 기반으로 한 균근 집락화 전략을 설명합니다.

결과

염색 절차 후 뿌리의 부드러운 분쇄 방법을 올바르게 사용하면 Zea mays (그림 8A-C)와 Festuca rubra (그림 9A-E) 모두에 대해 균근 구조에 대한 좋은 세부 사항, 균근 구조와 뿌리 세포 사이의 좋은 대비, 파란색으로 인한 비석 확인. 세척 및 염색 절차가 성공하지 못하면 뿌리 샘플을 분쇄하기 어?...

토론

균근 식민지화에 대한 연구는 농업 분야의 새로운 전략 개발에 필수적입니다. 여러 재배 식물이 arbuscular mycorrhizas와 공생 관계를 형성 할 수있는 잠재력은 농업 생태계의 지속 가능한 발전과 건강 유지의 중요한 구성 요소가되었습니다 16,17,18,19,20. 따라서 식물이 토양의 영?...

자료

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