Микоризные карты как инструмент для изучения моделей колонизации и грибковых стратегий в корнях Festuca rubra и Zea mays

Резюме

В протоколе здесь описываются методы оценки паттернов и стратегии арбускулярной микоризной колонизации в корнях для двух видов: Zea mays и Festuca rubra. Использование метода MycoPatt позволяет рассчитывать параметры, преобразовывать микоризные структуры в цифровые данные, отображать их реальное положение в корнях.

Аннотация

Арбускулярные микоризные грибы являются симбионтами в корнях растений. Их роль заключается в поддержании развития хозяев и поддержании равновесия питания в экосистемах. Процесс колонизации зависит от нескольких факторов, таких как экология почвы, генетическое разнообразие грибов и хозяина, а также агрономические методы. Их синхронизированное действие приводит к развитию сложной гифальной сети и приводит к вторичному развитию везикул и арбускул в корневых клетках. Целью данного исследования был анализ эффективности метода микоризных паттернов (MycoPatt) для позиционирования грибковых структур в корнях Festuca rubra и Zea mays. Другая цель состояла в том, чтобы исследовать стратегию грибковой колонизации, выявленную микоризными картами каждого вида. Получение и сборка нескольких микроскопических изображений позволяют оценить микоризную колонизацию как кукурузы, так и красной овсяницы для получения информации о реалистичном положении развитых структур. Наблюдаемые микоризные паттерны подчеркивают переменную эффективность каждого растения с точки зрения развития связей с почвенными симбиотическими грибами, вызванных прикладными обработками и стадией роста. Микоризные подробные карты, полученные с помощью метода MycoPatt, полезны для раннего выявления эффективности растений при симбиотическом приобретении из почвы.

Введение

Грибы arbuscular mycorrhiza (AM) представляют собой категорию почвенных эндофитов, которые постоянно представляют интерес для исследователей. Их присутствие в корнях большинства растений и их участие в циклах питательных веществ делает их жизненно важными компонентами в стабильности каждой экосистемы, где присутствуют травянистые растения ^1,2. Благодаря своему внеколесковому мицелию AM действует как грибковое расширение для корней растений, особенно в труднодоступных районах³. Основная деятельность находится в корнях растений-хозяев, где AM развивает большие гифные сети и специфические внутриклеточные структуры, называемые арбускулами. Отсутствие специфичности хозяина позволяет симбионту колонизировать несколько видов одновременно. Эта способность обеспечивает АМ роль распределения ресурсов и регулирования питательных веществ в экосистеме; гриб также обеспечивает поддержку в выживании растений и помогает в производительности растений 4,5,6,7. Реакция видов AM на корни хозяина видна в расширении и расположении внутрикорешкового мицелия, а также в наличии и форме арбускул, развитых внутриклеточным образом. Внутриклеточные арбускулы действуют как обменная точка между двумя симбионтами и представляют собой области, характеризующиеся быстрыми процессами переноса. Структуры, которые производят АМ, зависят от вида, и, помимо арбускул, в корнях они также развивают везикулы, споры и вспомогательные клетки.

Существует много проблем в оценке AM симбионтов в корнях растений ^8,9. Первый – это их постоянное развитие в течение всего вегетационного периода хозяев, что приводит к множественным изменениям в гифальной арбускулярной структуре. Различные стадии роста арбускулярных соединений, вплоть до их коллапса, явно присутствуют в корнях, но стареющие структуры AM иногда перевариваются, что делает их^{видимыми лишь частично 10}. Вторая проблема представлена методом и протоколом окрашивания, большим разнообразием корневых систем, размерами их клеток и различиями в толщине, которые затрудняют предложение единого метода. Последняя задача заключается в оценке и оценке колонизации АМ. Существует множество методов, которые оценивают АМ с разной степенью объективности, и большинство из них по-прежнему ограничены методами микроскопии. Простые основаны на наличии/отсутствии структур в корневой коре, в то время как более сложные основаны на визуальной оценке и использовании классов колонизации, с интеграцией частоты и интенсивности феномена колонизации. За последние десятилетия было получено много данных о микоризном статусе нескольких видов, но большинство методов ограничены наблюдаемой ценностью колонизации, не указывая на реальное положение каждой структуры в корневой коре. В ответ на необходимость получения более точных результатов по колонизации АМ был разработан метод, основанный на микроскопическом анализе микоризных паттернов (MycoPatt) в корнях для сборки в цифровом виде подробных микоризных карт¹¹. Также метод позволяет объективно рассчитать параметры колонизации и определить фактическое положение каждой структуры в корне.

Положение грибковых структур AM может быть важным в ответе на следующие два вопроса. Первый связан с анализом колонизации в один конкретный момент из вегетационного цикла растения. В этом контексте очень полезно наблюдать за обилием арбускулярных/пузырьков, сообщать, как они расположены в корне, и обеспечивать очень четкое изображение и параметры колонизации. Второй связан с выявлением грибковой стратегии и ее направленностью и даже прогнозом ее дальнейшего развития. Одно применение MycoPatt может быть для растений, анализируемых ежедневно, каждые 2-3 дня, еженедельно или во время различных стадий роста. В этом контексте расположение везикул / арбускул важно для лучшего понимания биологического механизма колонизации AM. Эти параметры и наблюдения очень полезны для дополнения математических параметров.

Целью данной статьи является демонстрация способности системы MycoPatt исследовать потенциал и стратегию колонизации нативных грибов AM в корнях Zea mays (кукуруза) на разных стадиях развития и в корнях Festuca rubra (красная овсяница) при различных долгосрочных условиях оплодотворения. Для выполнения поставленной цели были проанализированы две большие базы данных из двух экспериментов. Эксперимент с кукурузой был установлен в Кожокне (46°44′56" широты и 23°50′0" длиной. E), в Экспериментальной дидактической ферме Университета сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины Клуж на феозиом с суглинистой текстурой^{почвы 12}. Эксперимент с красной овсяницей является частью более крупного экспериментального участка, созданного в 2001 году в Гецари, горы Апусени (46°49'064" широты n и 22°81'418'' длиной. Е), на прелювосоле (terra rossa) почвы типа ^13,14. Кукурузу собирали в пять различных фенофаз роста¹²: В1 = 2-4 листа (в качестве контрольной точки для начала микоризной колонизации); B2 = 6 листьев; B3 = 8-10 листьев; B4 = образование початков; B5 = физиологическая зрелость. Начиная со стадии 2-4 листьев (А0), применялась органическая обработка, в результате которой получался двухградуальный фактор (А1 = контроль и А2 = обработанный). Корни красной овсяницы собирали при цветении из эксперимента с пятью многолетними оплодотворениями^13,14: V1 = контрольный, неоплодотворенный; V2 = 10 т·^га-1 навоз; V3 = 10 т·^га-1 навоз + N 50 кг·^га-1,_Р2О₅ 25 кг·^га-1, К₂О 25 кг·^га-1; V4 = N 100 кг·^га-1, P₂O₅ 50 кг·^га-1, K₂O 50 кг·^га-1; V5 = 10 т·^га-1 навоз + N 100 кг·^га-1,_Р2О₅ 50 кг·^га-1, К₂О 50 кг·^га-1. Пять растений были собраны на каждой стадии развития из каждого варианта удобрения. Проанализированы протоколы окрашивания и их производительность с точки зрения времени обработки образца и качества окрашивания. Связь между развитием гиф АМ и наличием ее структур в корнях анализировалась отдельно для каждого вида и продолжалась выявлением наиболее разрешительных корней для колонизации. Конкретные модели колонизации каждой корневой системы были проанализированы на основе карт колонизации и значения параметров AM.

Кукуруза является однолетним растением, которое подразумевает непрерывный рост корней, и это стало основной причиной применения MycoPatt на стадиях выращивания. Овсяница красная – многолетнее растение с луга, долгое время обработанное различными удобрениями. Его корни имеют более короткое развитие на 1 год, а антез считается точкой вегетации, когда растение меняет свой метаболизм с вегетативного на генеративный. Чтобы поймать эти растения в эти периоды интенсивной активности, были выбраны вышеупомянутые временные точки. Отбор проб в течение вегетационного периода затруднен для этого вида при выращивании на естественных лугах.

протокол

1. Отбор биологического материала, отбор проб корней и хранение

1. Соберите весь корень растений лопатой (рисунок 1А) отдельно для каждого варианта и воспроизведите. Аккуратно, вручную, удалите крупные почвенные агрегаты с корней. Промыть всю корневую систему и измерить ее по шкале с клетками размером 1 см х 1 см (рисунок 1B). Обрежьте корни отдельно для каждого растения и поместите их в полиэтиленовый пакет.
2. Соберите все чистые корни каждого растения в полиэтиленовый пакет и соберите все образцы из одного варианта в один большой пакет. Напишите на каждой сумке название этапа/варианта и дату выборки. Храните корни в холодильнике или морозильной камере при температуре от −4 °C до −20 °C до момента обработки.

2. Обработка, очистка и окрашивание корней для микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перчатки, маску и микробиологический/химический капюшон для этого этапа протокола.

1. Убедитесь, что процесс оттаивания корней выполняется медленно при комнатной температуре. Для всех этапов обработки используйте небольшие баночки (30-50 мл), чтобы уменьшить количество необходимых средств.
2. Выполните следующие четыре шага процедуры медленной очистки и окрашивания¹⁵. Делайте все шаги при комнатной температуре. Этот метод позволяет обрабатывать большое количество образцов одновременно без использования водяной бани для кипячения.
   1. Очистка корней: Поместите все корни одного растения в банку. Приготовьте 10% раствор NaOH с водопроводной водой и вылейте его в каждую банку, пока он полностью не покроет корни. Энергично встряхните банки в течение 1 мин или 2 мин, чтобы получить однородную дисперсию очищающего раствора в корнях. Повторите эту процедуру через 24 ч и оставьте корни в очищающем растворе не менее 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чистые корни имеют бледно-желтый (до белого) вид, а консистенция мягкая (их можно легко измельчить, придавив пинцетом).
   2. Промывка корней: пропускайте содержимое одной банки за раз через сито. Утилизируйте решение для очистки. Промойте корни несколько раз в водопроводной воде до полного удаления очищающего раствора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если очищающий раствор не будет полностью удален, это повлияет на качество процедуры окрашивания.
   3. Окрашивание корней: Поместите промытые корни в чистую банку. Приготовьте 5%:5% раствор чернил-уксуса с водопроводной водой (5 мл синих чернил + 5 мл 9% уксусной кислоты + 90 мл водопроводной воды). Вылейте раствор в каждую банку до тех пор, пока он полностью не покроет корни. Энергично встряхните банки в течение 1 мин или 2 мин, чтобы получить однородную дисперсию окрашивающего раствора в корнях. Повторите эту процедуру через 24 ч и оставьте корни в этом растворе на 48 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные корни имеют интенсивный синий цвет.
   4. Частичное опускание корней: Промыть окрашенные корни в водопроводной воде на 1-2 мин. Энергично встряхните банки, чтобы удалить лишний раствор для окрашивания. Повторите процедуру, если окрашивание слишком интенсивное и не позволяет провести четкую микроскопическую оценку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные корни можно хранить в водопроводной воде до 1 недели при комнатной температуре без изменения качества окрашивания (рисунок 2). В течение более длительных периодов корни могут сохраняться до 2-3 месяцев в 5% растворе коммерческого яблочного уксуса (5% уксусная кислота).

3. Корневая обработка для микроскопии

1. Сегментация корней: Поместите окрашенные корни из каждого образца на масштабированную разделочную доску (рисунок 3A). Нарежьте корни на сегменты по 1 см (рисунок 3B). Выберите 15 сегментов для каждого варианта.
2. Щадящий метод дробления для подготовки сегмента: Выкладываем корни на горку. Используйте ламинирующий мешочек для покрытия корней и аккуратно раздавите их, начиная с края (рисунок 3C,D). Используйте мягкий пластиковый инструмент, например, пинцет, ручку скальпеля, ручку или карандаш с ластиком, чтобы медленно отображать корни на слайде. Аккуратно снимите ламинирующий мешочек и накройте образец крышкой (рисунок 3E).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Корни имеют трубчатую форму, поэтому их необходимо разделять в двумерной плоскости. Это действие предполагает разделение корней на средней точке, что приводит к отображению двух частей внутреннего диаметра. Использование ламинирующих мешочков в щадящей процедуре дробления позволяет отображать корни, которые имеют цилиндрическую форму, в двух частях - один слева и один справа - к их средней точке. Таким образом, весь корень анализируется углубленно, а степень колонизации является параметром, который показывает объемную колонизацию (описанную в оригинальной работе на MycoPatt¹¹). По сути, мы разрезаем цилиндр пополам, а после этого перестраиваем его математически.
3. Добавьте воду в угол горки с помощью пипетки и дайте воде медленно распределиться по горке (рисунок 3F). Удалите лишнюю воду бумажным полотенцем.

4. Микроскопический анализ образцов корней

1. Используйте микроскоп, оснащенный камерой с хорошим разрешением.
2. Анализируйте слайды, начиная с конечности. Захватите каждое микроскопическое поле. Переименуйте каждое изображение, захваченное с помощью кода, который позволит выполнять реальную пост-ассамбляж корневых частей. Для толстых корней используйте 10-кратное или 40-кратное увеличение, а для тонких корней используйте 40-кратное увеличение. Используйте одну и ту же цель и увеличение для всего набора корней от вида.

5. Сборка изображений после микроскопии

1. Используйте презентационное программное обеспечение для проектирования чертежной доски для сборки изображений. Установите ширину на 2-3 см шире ширины изображения. Добавьте все захваченные изображения из одного сегмента в порядке их захвата и реконструируйте всю длину корневого сегмента (рисунок 4A).
   1. Короче говоря, соберите в общей сложности 15 изображений для каждого сегмента 1 см и организуйте их вертикально, начиная с 1 до 15, в презентационном программном обеспечении для реконструкции сегмента.
2. Выровняйте изображения по центру. Используйте вертикальное выравнивание, чтобы убедиться, что каждое изображение следует за предыдущим. На всех рисунках поместите сетку из 10 x 150 ячеек, чтобы покрыть весь корневой сегмент.
   1. Кроме того, на каждом отдельном рисунке поместите сетку 10 x 10 и в каждую ячейку этой сетки вставьте число от одного до шести, если видна структура AM, или оставьте пустым, если структура AM отсутствует. Таким образом, точность процесса максимальна без ошибок в местоположении наблюдаемых структур AM.
3. Добавьте таблицу для сетки шириной 10 ячеек и длиной 150 ячеек (15 квадратов по 10 ячеек x 10 ячеек). Измените размеры ширины таблицы на ширину изображений. Измените длину таблицы, чтобы она включала все изображения (рисунок 4B).

6. Подсчет очков микоризной колонизации

1. Используйте уникальный номер для оценки каждого типа структуры, как описано в методе микоризных паттернов¹¹: 1 для гиф; 2 для арбускул; 3 для везикул; 4 для спор; 5 для вспомогательных ячеек; и 6 для точек входа (рисунок 4С). Оцените каждую наблюдаемую микоризную структуру из каждой клетки ранее нанесенных сеток (рисунок 4D).

7. Анализ необработанных данных и извлечение результатов

1. Вставьте все полученные оценки в таблицу MycoPatt¹¹. Используйте функцию копирования/вставки для переноса всех оценок из презентации на первый лист с именем rawdata (рисунок 5).
2. Первичный анализ результатов: Используйте третий лист с именами параметров в инструменте электронных таблиц MycoPatt для визуализации результатов в процентах (%) отдельно в трех формах (рисунок 6A-C). Используйте столбцы от А до К для анализа горизонтального изображения колонизации; столбцы от M до W для анализа вертикального изображения колонизации; и столбцы от Y до AI для анализа поперечной (средней) колонизации для каждого из 15 квадратов 10 х 10 (линии 2-17) и конечной средней колонизации (линии 19-20).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поперечная средняя колонизация используется для расчета реальных параметров колонизации, связанных как с горизонтальным, так и с вертикальным анализом. Таким образом, никакие ошибки не могут быть допущены по сравнению с тем, если используется только горизонтальный или вертикальный анализ (подробно описанный в оригинальной работе¹¹). Также этот набор параметров рассчитывается для всей поверхности микроскопического поля.
   1. Используйте определения и формулы, специфичные для каждого параметра, для анализа результатов¹¹. Используйте следующие параметры колонизации: частота колонизации (%), интенсивность колонизации (%), арбускулы (%) и везикулы (%), споры (%) и вспомогательные клетки (%), точки входа (%), процент немикоризных областей (%), общая степень колонизации (%) и отчет о микоризных/немикоризных областях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в анализируемых образцах отсутствуют арбускулы, везикулы, споры, вспомогательные клетки и точки входа, электронная таблица MycoPatt оценит их как ноль (0).
3. Производство и извлечение микоризных карт: Визуализация изображения, полученного в результате преобразования кода микоризных структур в цвета на втором листе названных графиков MycoPatt (рисунок 7A). Экспортируйте полученное изображение в лист графиков в виде изображения (рисунок 7B). Используйте цветовой код в легенде для анализа микоризных паттернов.
4. Анализ микоризных карт: Определение наиболее важных структур и их сборки на микоризных картах. Опишите картину микоризной колонизации, наблюдаемую в анализируемых корнях. Опишите стратегию микоризной колонизации, основанную на наблюдаемом структурном развитии в корне, ветвящемся паттерне и развитии арбускулы/везикулы.

Результаты

Правильное использование щадящего метода дробления корней после процедур окрашивания обеспечивает хорошую детализацию микоризных структур, как для Zea mays (рисунок 8A-C), так и для Festuca rubra (рисунок 9A-E), хороший к...

Обсуждение

Исследования по микоризной колонизации имеют жизненно важное значение для разработки новой стратегии в агрономической области. Потенциал нескольких культурных растений для формирования симбиотической ассоциации с арбускулярными микоризами сделал их важным компонентом устойчивог?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb