フェストゥカルブラとゼアメイズの根におけるコロニー形成パターンと真菌戦略を探索するためのツールとしての菌根マップ

要約

ここでのプロトコルでは、アーバスキュラー菌根のコロニー形成パターンの評価方法と、 Zea mays と Festuca rubraの2つの種の根の戦略について説明しています。MycoPatt法を使用すると、パラメータの計算、菌根構造のデジタルデータへの変換、および根におけるそれらの実際の位置のマッピングが可能になります。

要約

アーバスキュラー菌根菌は植物の根に共生しています。それらの役割は、宿主の発達を維持し、生態系の栄養平衡を維持することです。植民地化プロセスは、土壌生態学、真菌と宿主の遺伝的多様性、農学的慣行などのいくつかの要因に依存しています。それらの同期作用は、複雑な菌糸網の発達をもたらし、そして根細胞における小胞およびアーバスキュールの二次発達をもたらす。本研究の目的は,菌根パターン(MycoPatt)法によるフェ ストゥカ・ルブラ と ゼア・メイスの根における真菌構造の位置決め効率を解析することであった。もう一つの目的は、各種菌根マップによって明らかにされた真菌コロニー形成戦略を探求することでした。複数の顕微鏡画像の取得と組み立てにより、トウモロコシとレッドフェスクの両方の植物における菌根コロニー形成評価が可能になり、開発された構造の現実的な位置に関する情報が提供されます。観察された菌根パターンは、適用された処理と成長段階によって引き起こされる土壌共生菌とのつながりを発達させるという点で、各植物のさまざまな効率を強調しています。MycoPatt法で得られた菌根詳細マップは、土壌からの共生獲得における植物の効率の早期発見に有用である。

概要

アーバスキュラー菌根(AM)菌は、研究者にとって常に関心のある分野である土壌媒介性内生植物のカテゴリーです。ほとんどの植物の根に存在し、栄養循環に関与しているため、草本植物が存在するすべての生態系の安定性に不可欠な要素になっています^1,2。AMは、その根外菌糸体を介して、特に手の届きにくい地域で、植物の根の真菌延長として機能します³。主な活動は宿主植物の根であり、AMは大きな菌糸ネットワークとアーバスキュールと呼ばれる特定の細胞内構造を発達させます。宿主特異性の欠如は、共生生物が同時に複数の種にコロニーを形成することを可能にする。この能力は、生態系における資源配分と栄養素調節の役割をAMに提供します。真菌はまた、植物の生存をサポートし、植物のパフォーマンスを助けます^4,5,6,7。宿主の根に対するAM種の反応は、根内菌糸体の伸長と位置、および細胞内に発達したアーバスキュールの存在と形状に見られます。細胞内のアーバスキュールは、2つの共生生物間の交換点として機能し、高速移動プロセスを特徴とする領域を表します。AMが生成する構造は種に依存し、アーバスキュールに加えて、根には小胞、胞子、および補助細胞も発達します。

植物の根におけるAM共生生物の評価には多くの課題があります^8,9。第一のものは、宿主の全植生期間を通してそれらの絶え間ない発達であり、それは菌糸アーバスキュラー構造における複数の変化をもたらす。崩壊までのアーバスキュラー成長のさまざまな段階は根にはっきりと存在しますが、老化したAM構造は時々消化されるため、部分的にしか見えません¹⁰。2番目の課題は、染色方法とプロトコル、根系の多様性、細胞の寸法、および厚さの違いによって表され、統一された方法を提案することは困難です。最後の課題は、AM植民地化の評価と採点によって表されます。さまざまな客観性でAMをスコアリングする方法は数多くありますが、それらのほとんどは依然として顕微鏡技術に限定されています。単純なものは根皮質の構造の有無に基づいていますが、より複雑なものは視覚的なスコアリングとコロニー形成クラスの使用に基づいており、コロニー形成現象の頻度と強度を統合しています。過去数十年間に複数の種の菌根の状態に関する多くのデータが作成されてきましたが、ほとんどの方法は、根皮質の各構造の実際の位置を指すことなく、コロニー形成の観察値に制限されています。AMコロニー形成に関するより正確な結果の必要性への対応として、根の菌根パターンの顕微鏡分析(MycoPatt)に基づく方法が開発され、詳細な菌根マップをデジタル形式で組み立てました¹¹。また、この方法は、コロニー形成パラメータの客観的な計算および根における各構造の実際の位置の決定を可能にする。

AM真菌構造の位置は、次の2つの質問に答える上で重要です。1つ目は、植物の植生サイクルからの特定の瞬間におけるコロニー形成の分析に関連しています。これに関連して、アーバスキュラー/ベシクルの存在量を観察し、それらが根にどのように配置されているかを報告し、非常に明確なコロニー形成の画像とパラメーターを提供することは非常に有用です。2つ目は、真菌戦略とその方向性の検出、さらにはその将来の発展の予測に関連しています。MycoPattの1つの用途は、毎日、2〜3日ごと、毎週、またはさまざまな成長段階で分析される植物に使用できます。これに関連して、小胞/アーバスキュールの位置は、AMコロニー形成の生物学的メカニズムをよりよく理解するために重要です。これらのパラメータとオブザベーションは、数学的パラメータを補完するのに非常に役立ちます。

この記事の目的は、MycoPattシステムがネイティブAM菌のコロニー形成の可能性と戦略を調査する能力を実証することです さまざまな開発段階のZea mays(トウモロコシ)根とさまざまな長期施肥条件下でのFestuca rubra(レッドフェスク)根。この目的を達成するために、2つの実験からの2つの大規模なデータベースが分析されました。トウモロコシの実験はコジョクナ(北緯46度44分56秒、長さ23度50分0秒)で確立されました。E)、農業科学獣医学大学の実験的教訓農場で、ローム質の質感の土壌¹²のフェオジオムに。レッドフェスク実験は、2001年にアプセニ山脈のゲシャリ(北緯46度49分064秒、長さ22°81'418'')に設立されたより大きな実験サイトの一部です。E)、プレルボソル(テラロッサ)土壌タイプ^13,14。トウモロコシは、5つの異なる成長表現期¹²で集められた:B1 = 2〜4葉(菌根コロニー形成の開始のための対照点として)。B2 = 6葉;B3 = 8-10葉;B4 =穂軸形成;B5 =生理学的成熟度。2〜4葉の段階(A0)から開始して、有機処理が適用され、その結果、2つの目盛り因子(A1 =対照およびA2 =処理)が得られました。赤いフェスクの根は、5つの長期受精^13,14の実験から開花時に収集されました:V1 =対照、非受精;V2 = 10トン·^ha-1肥料;V3 = 10 t·ha-1肥料+ N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1;V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1;V5 = 10トン·ha-1肥料+ N 100 kg·ha-1、P 2 O₅ 50 kg·ha-1、K₂O 50 kg·^ha-1。各受精変異体から各開発段階で5つの植物を採取した。染色プロトコルと、サンプル処理時間と染色品質に関するそれらの性能を分析しました。AM菌糸の発達と根におけるその構造の存在との関係は、種ごとに別々に分析され、コロニー形成に最も寛容な根の特定を続けました。各根系の特定のコロニー形成パターンは、コロニー形成マップとAMパラメータの値に基づいて分析されました。

トウモロコシは一年生植物であり、それは根の継続的な成長を意味し、それが成長段階でMycoPattを適用する主な理由でした。レッドフェスクは、さまざまな肥料で長期間処理された草原からの多年生植物です。その根の発達は1年と短く、植物が栄養から生殖に代謝を変えるときの植生点と見なされます。これらの激しい活動期間中にこれらの植物を捕まえるために、上記の時点が選択されました。植生期のサンプリングは、自然の草原で育てられた場合、この種にとって困難です。

プロトコル

1.生物学的材料の選択、根のサンプリング、および保管

1. 植物の根全体をシャベルで集め(図1A)、バリアントごとに別々に複製します。根から大きな土の骨材を手でやさしく取り除きます。根系全体を洗浄し、1 cm x 1 cmの細胞を含むスケールで測定します(図1B)。植物ごとに根を別々に切り、ビニール袋に入れます。
2. 各植物からすべてのきれいな根をビニール袋に集め、1つの大きな袋に1つの亜種からすべてのサンプルを収集します。各バッグにステージ/バリアント名とサンプリング日を記入してください。根は、処理されるまで-4°Cから-20°Cの間の温度で冷蔵庫または冷凍庫に保管してください。

2.顕微鏡検査のための根の処理、透明化、染色

注意: プロトコルのこのステップでは、手袋、マスク、および微生物学的/化学的フードを使用してください。

1. 根の解凍プロセスが室温でゆっくりと行われることを確認してください。処理のすべてのステップで、必要な薬剤の量を減らすために小さな瓶(30-50 mL)を使用してください。
2. 緩慢透明化および染色手順¹⁵の以下の4つのステップを実行する。すべての手順を室温で実行します。この方法は、沸騰のための水浴を使用せずに同時に多数のサンプルを処理することを可能にする。
   1. 根のクリア:1つの植物からのすべての根を瓶に入れます。水道水で10%NaOH溶液を調製し、根を完全に覆うまで各瓶に注ぎます。ジャーを1分または2分間激しく振って、根に透明溶液の均一な分散を生成します。24時間後にこの手順を繰り返し、根を少なくとも48時間透明溶液に入れたままにします。
      注:きれいな根は淡黄色(最大白)の側面を持ち、粘稠度は柔らかいです(ピンセットで押すことで簡単に押しつぶすことができます)。
   2. 根のすすぎ:一度に1つの瓶の中身をふるいに通します。清算液をリサイクルします。透明溶液が完全に除去されるまで、根を水道水で数回すすいでください。
      注意: 透明溶液が完全に除去されない場合、染色手順の品質に影響します。
   3. 根の染色:すすいだ根をきれいな瓶に入れます。水道水(5 mLの青インク+ 5 mLの9%酢酸+ 90 mLの水道水)で5%:5%のインク酢溶液を調製します。それが根を完全に覆うまで各瓶に溶液を注ぎます。ジャーを1分または2分間激しく振って、根に染色液の均一な分散を生成します。24時間後にこの手順を繰り返し、根をこの溶液に48時間放置します。
      注:染色された根は濃い青色をしています。
   4. 根の部分的な脱色:汚れた根を水道水で1〜2分間すすぎます。ジャーを激しく振って、余分な染色液を取り除きます。染色が強すぎて明確な顕微鏡評価ができない場合は、この手順を繰り返します。
      注:染色された根は、染色品質を変えることなく、室温で最大1週間水道水に保持できます(図2)。長期間、根は5%市販のリンゴ酢溶液(5%酢酸)で最大2〜3か月間維持できます。

3. 顕微鏡のための根の加工

1. 根のセグメンテーション:各サンプルの染色した根をスケーリングされたまな板に置きます(図3A)。根を1 cmのセグメントに切ります(図3B)。バリエーションごとに 15 個のセグメントを選択します。
2. セグメント調製のための穏やかな粉砕方法:スライドの上に根を広げます。根を覆うためにラミネートポーチを使用し、端から始めてそれらをそっと押しつぶします(図3C、D)。ピンセット、メスの柄、ペン、消しゴム付きの鉛筆などの柔らかいプラスチック製のツールを使用して、スライドに根をゆっくりと表示します。ラミネートポーチを慎重に取り外し、サンプルをカバーガラスで覆います(図3E)。
   注:根は管状であるため、それらを二次元平面で分離する必要があります。このアクションは、中間点での根の分離を前提としており、内径の2つの部分が表示されます。穏やかな破砕手順でラミネートパウチを使用すると、円筒形の根を左側と右側の2つのピースで中央に向かって表示できます。このようにして、根全体が詳細に分析され、コロニー形成度は体積コロニー形成を示すパラメータである(MycoPatt¹¹に関する元の研究に記載されている)。基本的に、円柱を半分に切り、その後、数学的に再構築します。
3. ピペットでスライドの角に水を加え、水をスライドにゆっくりと広げます(図3F)。ペーパータオルで余分な水を取り除きます。

4.根のサンプルの顕微鏡分析

1. 高解像度のカメラを備えた顕微鏡を使用してください。
2. 四肢からスライドを分析します。各微視的なフィールドをキャプチャします。キャプチャされた各画像の名前を、ルートパーツの実際のポストアセンブラージュを許可するコードに変更します。太い根の場合は10倍または40倍の倍率を使用し、細い根の場合は40倍の倍率を使用します。種からの根のセット全体に同じ対物レンズと倍率を使用します。

5. 顕微鏡後の画像集合

1. プレゼンテーションソフトウェアを使用して、画像アセンブリの製図板を設計します。幅を画像の幅より2〜3cm広く設定します。1つのセグメントからキャプチャされたすべての画像をキャプチャ順に追加し、ルートセグメントの全長を再構築します(図4A)。
   1. 簡単に言うと、1cmのセグメントごとに合計15枚の写真を収集し、プレゼンテーションソフトウェアで1〜15から垂直に整理して、セグメントを再構築します。
2. 画像を中央に揃えます。垂直方向の配置を使用して、各画像が前の画像に従っていることを確認します。すべての画像に、ルートセグメント全体をカバーするように10セルx150セルのグリッドを配置します。
   1. さらに、個々の画像に 10 x 10 のグリッドを配置し、このグリッドのすべてのセルに、AM 構造が表示されている場合は 1 から 6 までの数値を挿入し、AM 構造が存在しない場合は空白のままにします。このようにして、プロセスの精度は最大であり、観察されるAM構造の位置の誤差はありません。
3. 幅 10 セル、長さ 150 セルのグリッドの表を追加します (10 セルの正方形 15 x 10 セル)。テーブルの幅のサイズを画像の幅に変更します。すべての画像で構成されるようにテーブルの長さを変更します(図4B)。

6.菌根コロニー形成のスコアリング

1. 菌糸の菌根パターン法¹¹:1で説明されているように、各タイプの構造をスコアリングするために一意の番号を使用します。アーバスキュールの場合は2。小胞の場合は3。胞子の場合は4。補助セルの場合は5。エントリポイントの場合は6です(図4C)。以前に適用されたグリッドの各細胞から観察された各菌根構造をスコアリングする(図4D)。

7.生データの分析と結果の抽出

1. 取得したすべてのスコアをMycoPattスプレッドシート¹¹に挿入します。コピー/貼り付け機能を使用して、プレゼンテーションのすべてのスコアを rawdata という名前の最初のシートに転送します (図 5)。
2. 結果の一次分析:MycoPattスプレッドシートツールのパラメーターという名前の3番目のシートを使用して、結果を3つの形式で個別にパーセンテージ(%)として視覚化します(図6A-C)。列AからKを使用して、植民地化の水平画像を分析します。植民地化の垂直画像を分析するための列MからW。列YからAIは、15個の10 x 10の正方形(2〜17行目)のそれぞれの横方向(平均)コロニー形成と最終的な平均コロニー形成(19〜20行目)を分析します。
   注:横平均コロニー形成は、水平分析と垂直解析の両方に関連する実際のコロニー形成パラメータの計算に使用されます。このように、水平分析または垂直分析のみを使用する場合と比較してエラーを犯すことはできません(元の作業¹¹で詳細に説明されています)。また、このパラメータセットは、微視的場の表面全体について計算されます。
   1. 各パラメータに固有の定義と式を使用して、結果を分析します¹¹。次のコロニー形成パラメータを使用します:コロニー形成の頻度(%)、コロニー形成の強度(%)、アーバスキュール(%)および小胞(%)、胞子(%)および補助細胞(%)、エントリポイント(%)、非菌根領域の割合(%)、全体的なコロニー形成度(%)、および菌根/非菌根領域のレポート。
      注:アーバスキュール、小胞、胞子、補助細胞、およびエントリポイントが分析されたサンプルから欠落している場合、MycoPattスプレッドシートはそれらをゼロ(0)としてスコア付けします。
3. 菌根マップの作成と抽出:MycoPattという名前のグラフの2枚目のシートで、菌根構造コードを色に変換して得られた画像を視覚化 します (図7A)。グラフシート内の結果の画像を画像としてエクスポートします(図7B)。菌根パターンの分析には、凡例のカラーコードを使用します。
4. 菌根マップ分析:菌根マップ上で最も重要な構造とその集合体を特定します。分析された根で観察された菌根コロニー形成パターンを説明してください。根の観察された構造発達、分岐パターン、およびアーバスキュール/小胞の発達に基づく菌根コロニー形成戦略を説明してください。

結果

染色手順後の根の穏やかな破砕方法を正しく使用すると、Zea mays(図8A-C)とFestuca rubra(図9A-E)の両方の菌根構造の良好な詳細、菌根構造と根細胞の良好なコントラスト、および青色による石碑の確認が得られます。透明化および染色手順が成功しない場合、根のサンプルは粉砕するのが?...

ディスカッション

菌根のコロニー形成に関する研究は、農学分野における新しい戦略開発に不可欠です。複数の栽培植物がアーバスキュラー菌根と共生関係を形成する可能性は、それらを農業生態系の持続可能な開発とその健康の維持の重要な要素にしました16,17,18,19,20。したがって、植...

資料

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