Mapas micorrízicos como ferramenta para explorar padrões de colonização e estratégias fúngicas nas raízes de Festuca rubra e zea mays

Resumo

O protocolo aqui descreve os métodos para a avaliação dos padrões de colonização micorrízica arbuscular e a estratégia em raízes para duas espécies: Zea mays e Festuca rubra. O uso do método MycoPatt permite o cálculo de parâmetros, a conversão de estruturas micorrízicas em dados digitais e o mapeamento de sua posição real nas raízes.

Resumo

Os fungos micorrízicos arbusculares são simbiontes nas raízes das plantas. Seu papel é sustentar o desenvolvimento do hospedeiro e manter o equilíbrio nutricional nos ecossistemas. O processo de colonização é dependente de vários fatores, como a ecologia do solo, a diversidade genética dos fungos e hospedeiros e práticas agronômicas. Sua ação sincronizada leva ao desenvolvimento de uma complexa rede hifal e leva ao desenvolvimento secundário de vesículas e arbúsculos nas células radiculares. O objetivo deste trabalho foi analisar a eficiência do método de padrões micorrízicos (MycoPatt) para o posicionamento de estruturas fúngicas nas raízes de Festuca rubra e Zea mays. Outro objetivo foi explorar a estratégia de colonização fúngica revelada pelos mapas micorrízicos de cada espécie. A aquisição e a montagem de múltiplas imagens microscópicas permitem a avaliação da colonização micorrízica em plantas de milho e fescue vermelha para fornecer informações sobre a posição realista das estruturas desenvolvidas. Os padrões micorrízicos observados destacam a eficiência variável de cada planta em termos de desenvolvimento de conexões com fungos simbióticos do solo, causadas por tratamentos aplicados e estágio de crescimento. Mapas detalhados micorrízicos obtidos pelo método MycoPatt são úteis para a detecção precoce da eficiência das plantas na aquisição simbiótica do solo.

Introdução

Os fungos micorrizas arbusculares (MA) são uma categoria de endófitos transmitidos pelo solo que são constantemente uma área de interesse para os pesquisadores. Sua presença nas raízes da maioria das plantas e seu envolvimento nos ciclos de nutrientes as tornam componentes vitais na estabilidade de todos os ecossistemas onde as plantas herbáceas estão presentes ^1,2. Através de seu micélio extra-radicular, o AM atua como uma extensão fúngica para as raízes das plantas, especialmente em áreas de difícil acesso³. A principal atividade é nas raízes das plantas hospedeiras, onde a MA desenvolve grandes redes de hifas e estruturas intracelulares específicas chamadas arbúsculos. A falta de especificidade do hospedeiro permite que o simbionte colonize várias espécies ao mesmo tempo. Essa habilidade fornece à AM o papel da alocação de recursos e da regulação de nutrientes no ecossistema; o fungo também fornece suporte na sobrevivência das plantas e auxilia no desempenho das plantas 4,5,6,7. A reação de espécies de micorrizas arbustivas às raízes hospedeiras é visível na extensão e localização do micélio intra-radicular e na presença e forma dos arbúsculos desenvolvidos intracelularmente. Os arbúsculos intracelulares atuam como um ponto de intercâmbio entre os dois simbiontes e representam áreas caracterizadas por processos de transferência rápida. As estruturas que o AM produz são dependentes da espécie e, além dos arbúsculos, nas raízes, eles também desenvolvem vesículas, esporos e células auxiliares.

Há muitos desafios na avaliação de simbiontes de micorrizas arbusculares em raízes de plantas ^8,9. O primeiro deles é o seu constante desenvolvimento durante todo o período de vegetação dos hospedeiros, o que leva a múltiplas mudanças na estrutura arbuscular hifal. Os diferentes estágios do crescimento arbuscular, até o seu colapso, estão claramente presentes nas raízes, mas as estruturas arbusculares senescentes às vezes são digeridas, o que as torna apenas parcialmente visíveis¹⁰. O segundo desafio é representado pelo método e protocolo de coloração, pela grande diversidade de sistemas radiculares, pela dimensão de suas células e pelas diferenças de espessura, que dificultam a proposição de um método unificado. O último desafio é representado pela avaliação e pontuação da colonização da MA. Existem inúmeros métodos que pontuam a MA com diferentes graus de objetividade, e a maioria deles ainda está restrita às técnicas de microscopia. As simples baseiam-se na presença/ausência de estruturas no córtex radicular, enquanto as mais complexas baseiam-se no escore visual e no uso de classes de colonização, com a integração da frequência e intensidade do fenômeno de colonização. Muitos dados foram produzidos nas últimas décadas sobre o status micorrízico de múltiplas espécies, mas a maioria dos métodos se restringe ao valor observado da colonização sem apontar para a posição real de cada estrutura no córtex radicular. Como resposta à necessidade de resultados mais precisos sobre a colonização por MA, foi desenvolvido um método baseado na análise microscópica de padrões micorrízicos (MycoPatt) em raízes para montar, em formato digital, os mapas micorrízicos detalhados¹¹. Além disso, o método permite o cálculo objetivo dos parâmetros de colonização e a determinação da posição real de cada estrutura na raiz.

A posição das estruturas fúngicas da micorrizas do miocárdio pode ser importante para responder às duas perguntas a seguir. A primeira está relacionada à análise da colonização em um momento específico do ciclo vegetacional de uma planta. Nesse contexto, é muito útil observar a abundância de arbusculares/vesículas, relatar como elas estão localizadas na raiz e fornecer uma imagem e parâmetros de colonização muito claros. A segunda está relacionada à detecção da estratégia fúngica e sua orientação e até mesmo à previsão de seu desenvolvimento futuro. Uma aplicação do MycoPatt pode ser para plantas analisadas diariamente, a cada 2-3 dias, semanalmente ou durante vários estágios de crescimento. Nesse contexto, a localização das vesículas/arbúsculos é importante para melhor compreensão do mecanismo biológico da colonização por MA. Estes parâmetros e observações são muito úteis para complementar os parâmetros matemáticos.

O objetivo deste artigo é demonstrar a capacidade do sistema MycoPatt de explorar o potencial e a estratégia de colonização de fungos de micorrizas arbusculares nativos em raízes de Zea mays (milho) durante diferentes estágios de desenvolvimento e em raízes de Festuca rubra (fescue vermelha) sob diferentes condições de fertilização a longo prazo. Para cumprir o objetivo, foram analisadas duas grandes bases de dados de dois experimentos. O experimento com milho foi estabelecido em Cojocna (46°44′56" lat. N e 23°50′0" de comprimento. E), na Fazenda Didática Experimental da Universidade de Ciências Agrárias e Medicina Veterinária de Cluj sobre um feozoima com textura argilosa do solo¹². O experimento de fescue vermelha é uma parte de um local experimental maior estabelecido em 2001 em Ghețari, Montanhas Apuseni (46°49'064" lat. N e 22°81'418'' de comprimento. E), em um solo preluvosol (terra rossa) tipo^13,14. O milho foi coletado em cinco diferentes fenófases de crescimento¹²: B1 = 2-4 folhas (como ponto de controle para o início da colonização micorrízica); B2 = 6 folhas; B3 = 8-10 folhas; B4 = formação de espiga ; B5 = maturidade fisiológica. A partir do estágio de 2-4 folhas (A0), aplicou-se um tratamento orgânico, que resultou em um fator de duas graduações (A1 = controle e A2 = tratado). Raízes de fescue vermelha foram coletadas na floração de um experimento com cinco adubações de longa duração^13,14: V1 = controle^, não adubado; V2 = 10 t·^ha-1 de estrume; V3 = 10 t·ha-1 de estrume + N 50 kg·ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 de estrume + N 100 kg·ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Cinco plantas foram coletadas em cada estágio de desenvolvimento de cada variante de fertilização. Foram analisados os protocolos de coloração e seu desempenho em termos de tempo de processamento da amostra e qualidade da coloração. A relação entre o desenvolvimento das hifas de micorrizas arbustivas e a presença de suas estruturas nas raízes foi analisada separadamente para cada espécie e continuou com a identificação das raízes mais permissivas para colonização. Os padrões específicos de colonização de cada sistema radicular foram analisados com base em mapas de colonização e no valor dos parâmetros de MA.

O milho é uma planta anual, o que implica o crescimento contínuo das raízes, e essa foi a principal razão para aplicar o MycoPatt nos estágios de crescimento. A fescue vermelha é uma planta perene de uma pastagem tratada por um longo tempo com diferentes fertilizantes. Suas raízes têm um desenvolvimento mais curto de 1 ano, e a antese é considerada como o ponto de vegetação quando a planta muda seu metabolismo de vegetativo para generativo. Para a captura dessas plantas durante esses períodos de intensa atividade, foram escolhidos os pontos de tempo acima mencionados. A amostragem durante o período de vegetação é difícil para esta espécie quando cultivada em pastagens naturais.

Protocolo

1. Seleção de material biológico, amostragem radicular e armazenamento

1. Coletar toda a raiz das plantas com uma pá (Figura 1A) separadamente para cada variante e replicar. Retire suavemente, à mão, os grandes agregados de solo das raízes. Lavar todo o sistema radicular e medi-lo em uma escala com células de 1 cm x 1 cm (Figura 1B). Corte as raízes separadamente para cada planta e coloque-as em um saco plástico.
2. Colete todas as raízes limpas de cada planta em um saco plástico e colete todas as amostras de uma variante em um saco maior. Escreva em cada saco o nome do estágio/variante e a data de amostragem. Conservar as raízes num frigorífico ou congelador a uma temperatura entre -4 °C e -20 °C até ao processamento.

2. Processamento de raiz, limpeza e coloração para microscopia

NOTA: Use luvas, uma máscara e um exaustor microbiológico/químico para esta etapa do protocolo.

1. Certifique-se de que o processo de descongelamento da raiz seja feito lentamente à temperatura ambiente. Para todas as etapas do processamento, use frascos pequenos (30-50 mL) para reduzir a quantidade de agentes necessários.
2. Execute as quatro etapas a seguir do procedimento lento de limpeza e coloração¹⁵. Faça todos os passos à temperatura ambiente. Este método permite o processamento de um grande número de amostras ao mesmo tempo sem o uso de um banho de água para ferver.
   1. Limpeza de raízes: Coloque todas as raízes de uma planta em um frasco. Prepare uma solução de NaOH a 10% com água da torneira e despeje-a em cada frasco até cobrir completamente as raízes. Agite vigorosamente os frascos durante 1 min ou 2 min para produzir uma dispersão homogénea da solução de limpeza nas raízes. Repita este procedimento após 24 h e deixe as raízes na solução de limpeza por pelo menos 48 h.
      NOTA: As raízes limpas têm um aspecto amarelo pálido (até branco) e a consistência é macia (elas podem ser facilmente esmagadas pressionando com um tweezer).
   2. Enxágue radicular: Passe o conteúdo de um frasco de cada vez através de uma peneira. Recicle a solução de limpeza. Lave as raízes várias vezes em água da torneira até que a solução de limpeza seja completamente removida.
      NOTA: Se a solução de limpeza não for completamente removida, isso afetará a qualidade do procedimento de coloração.
   3. Coloração da raiz: Coloque as raízes enxaguadas em um frasco limpo. Prepare uma solução de tinta-vinagre a 5%:5% com água da torneira (5 ml de tinta azul + 5 ml de ácido acético a 9% + 90 ml de água da torneira). Despeje a solução em cada frasco até cobrir completamente as raízes. Agitar vigorosamente os frascos durante 1 min ou 2 min para produzir uma dispersão homogénea da solução de coloração nas raízes. Repita este procedimento após 24 h e deixe as raízes nesta solução por 48 h.
      NOTA: As raízes manchadas têm uma cor azul intensa.
   4. Coloração parcial da raiz: Lave as raízes coradas em água da torneira por 1-2 min. Agite os frascos vigorosamente para remover a solução de coloração extra. Repita o procedimento se a coloração for muito intensa e não permitir uma avaliação microscópica clara.
      NOTA: As raízes coradas podem ser mantidas em água da torneira por até 1 semana à temperatura ambiente sem alterar a qualidade da coloração (Figura 2). Por períodos mais longos, as raízes podem ser mantidas por até 2-3 meses em uma solução comercial de vinagre de maçã a 5% (ácido acético a 5%).

3. Processamento de raiz para microscopia

1. Segmentação radicular: Colocar as raízes coradas de cada amostra em uma tábua de corte em escala (Figura 3A). Corte as raízes em segmentos de 1 cm (Figura 3B). Escolha 15 segmentos para cada variante.
2. Método de esmagamento suave para preparação do segmento: Espalhe as raízes em uma lâmina. Use uma bolsa de laminação para cobrir as raízes e esmagá-las suavemente a partir de uma borda (Figura 3C,D). Use uma ferramenta de plástico macio, por exemplo, pinça, alça de bisturi, caneta ou um lápis com borracha, para exibir lentamente as raízes na lâmina. Retirar cuidadosamente a bolsa de laminação e cobrir a amostra com uma folha de cobertura (Figura 3E).
   NOTA: As raízes têm uma forma tubular, por isso é necessário separá-las em um plano bidimensional. Esta ação pressupõe a separação das raízes no ponto médio, levando à exibição das duas partes do diâmetro interno. O uso de bolsas de laminação no procedimento de esmagamento suave permite a exibição das raízes, que têm uma forma de cilindro, em duas peças - uma à esquerda e outra à direita - em direção ao seu ponto médio. Dessa forma, toda a raiz é analisada em profundidade, sendo o grau de colonização o parâmetro que mostra a colonização volumétrica (descrita no trabalho original sobre o MycoPatt¹¹). Basicamente, cortamos um cilindro ao meio e, depois disso, o reconstruímos matematicamente.
3. Adicione água a um canto da lâmina com uma pipeta e deixe a água se espalhar lentamente na lâmina (Figura 3F). Retire a água extra com uma toalha de papel.

4. Análise microscópica das amostras de raiz

1. Use um microscópio equipado com uma câmera de boa resolução.
2. Analise os slides a partir de uma extremidade. Capture cada campo microscópico. Renomeie cada imagem capturada com um código que permitirá a pós-montagem real de peças raiz. Para raízes grossas, use a ampliação de 10x ou 40x e, para raízes finas, use a ampliação de 40x. Use o mesmo objetivo e ampliação para todo o conjunto de raízes de uma espécie.

5. Montagem de imagens pós-microscopia

1. Use o software de apresentação para projetar uma prancheta de desenho para montagem de imagens. Defina a largura 2-3 cm mais larga do que a largura da imagem. Adicione todas as imagens capturadas de um segmento na ordem de captura e reconstrua todo o comprimento do segmento raiz (Figura 4A).
   1. Em resumo, coletar um total de 15 figuras para cada segmento de 1 cm e organizá-las verticalmente, começando com 1 a 15, no software de apresentação para reconstruir o segmento.
2. Alinhe as imagens no centro. Use o alinhamento vertical para garantir que cada imagem esteja seguindo a anterior. Em todas as imagens, coloque uma grade de 10 células x 150 células para cobrir todo o segmento raiz.
   1. Além disso, em cada imagem individual, coloque uma grade de 10 x 10 e, em cada célula dessa grade, insira um número de um a seis se uma estrutura AM estiver visível ou deixe em branco se nenhuma estrutura AM estiver presente. Desta forma, a precisão do processo é máxima, sem que se observem erros na localização das estruturas de MA.
3. Adicione uma tabela para uma grade de 10 células de largura e 150 células de comprimento (15 quadrados de 10 células x 10 células). Altere as dimensões da largura da tabela para a largura das imagens. Altere o comprimento da tabela para incluir todas as imagens (Figura 4B).

6. Pontuação da colonização micorrízica

1. Use o número único para pontuar cada tipo de estrutura, conforme descrito no método de padrões micorrízicos¹¹: 1 para hifas; 2 para arbúsculos; 3 para vesículas; 4 para esporos; 5 para células auxiliares; e 6 para pontos de entrada (Figura 4C). Escore cada estrutura micorrízica observada de cada célula das grades previamente aplicadas (Figura 4D).

7. Análise de dados brutos e extração de resultados

1. Insira todos os escores obtidos na planilha MycoPatt¹¹. Use a função copiar/colar para transferir todas as pontuações da apresentação para a primeira planilha denominada como rawdata (Figura 5).
2. Análise primária dos resultados: Use a terceira folha denominada parâmetros na ferramenta de planilha MycoPatt para visualizar os resultados como porcentagens (%) separadamente em três formas (Figura 6A-C). Use as colunas A a K para analisar a imagem horizontal da colonização; colunas M a W para analisar a imagem vertical da colonização; e colunas Y a AI para analisar a colonização transversal (média) para cada um dos 15 10 x 10 quadrados (linhas 2-17) e a colonização média final (linhas 19-20).
   NOTA: A colonização média transversal é utilizada para o cálculo dos parâmetros reais de colonização, relacionados à análise horizontal e vertical. Desta forma, nenhum erro pode ser cometido em comparação com se apenas a análise horizontal ou vertical for usada (descrita em detalhes no trabalho original¹¹). Além disso, esse conjunto de parâmetros é calculado para toda a superfície do campo microscópico.
   1. Utilizar as definições e fórmulas, específicas para cada parâmetro, para analisar os resultados¹¹. Use os seguintes parâmetros de colonização: frequência de colonização (%), intensidade da colonização (%), arbúsculos (%) e vesículas (%), esporos (%) e células auxiliares (%), pontos de entrada (%), porcentagem de áreas não micorrízicas (%), grau geral de colonização (%) e relato de áreas micorrízicas/não micorrízicas.
      NOTA: Se arbúsculos, vesículas, esporos, células auxiliares e pontos de entrada estiverem ausentes das amostras analisadas, a planilha do MycoPatt os pontuará como zero (0).
3. Produção e extração de mapas micorrízicos: Visualize a imagem obtida a partir da conversão do código de estruturas micorrízicas em cores na segunda folha dos gráficos nomeados pelo MycoPatt (Figura 7A). Exporte a imagem resultante na folha de gráficos como uma imagem (Figura 7B). Use o código de cores na legenda para a análise de padrões micorrízicos.
4. Análise de mapas micorrízicos: Identificar as estruturas mais importantes e sua assembleia em mapas micorrízicos. Descrever o padrão de colonização micorrízica observado nas raízes analisadas. Descrever a estratégia de colonização micorrízica com base no desenvolvimento estrutural observado na raiz, no padrão de ramificação e no desenvolvimento de arbúsculo/vesícula.

Resultados

O uso correto do método de esmagamento suave das raízes após os procedimentos de coloração fornece bons detalhes das estruturas micorrízicas, tanto para Zea mays (Figura 8A-C) quanto para Festuca rubra (Figura 9A-E), bom contraste entre estruturas micorrízicas e células radiculares e confirmação da estela devido à cor azul. Se os procedimentos de limpeza e coloraçã...

Discussão

Estudos sobre colonização micorrízica são vitais para o desenvolvimento de novas estratégias no campo agronômico. O potencial de múltiplas plantas cultivadas para formar uma associação simbiótica com micorrizas arbusculares tornou-as um importante componente do desenvolvimento sustentável do agroecossistema e da manutenção de sua saúde 16,17,18,19,20.^<...

Materiais

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Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
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