Les cartes mycorhiziennes comme outil pour explorer les modèles de colonisation et les stratégies fongiques dans les racines de Festuca rubra et Zea mays

Résumé

Le protocole décrit ici les méthodes d’évaluation des modèles et de la stratégie de colonisation mycorhizienne arbusculaire dans les racines de deux espèces: Zea mays et Festuca rubra. L’utilisation de la méthode MycoPatt permet le calcul de paramètres, la conversion de structures mycorhiziennes en données numériques et la cartographie de leur position réelle dans les racines.

Résumé

Les champignons mycorhiziens arbusculaires sont des symbiotes dans les racines des plantes. Leur rôle est de soutenir le développement de l’hôte et de maintenir l’équilibre nutritionnel dans les écosystèmes. Le processus de colonisation dépend de plusieurs facteurs tels que l’écologie du sol, la diversité génétique des champignons et de l’hôte, et les pratiques agronomiques. Leur action synchronisée conduit au développement d’un réseau hyphe complexe et conduit au développement secondaire de vésicules et d’arbuscules dans les cellules racinaires. Le but de cette recherche était d’analyser l’efficacité de la méthode des motifs mycorhiziens (MycoPatt) pour le positionnement des structures fongiques dans les racines de Festuca rubra et Zea mays. Un autre objectif était d’explorer la stratégie de colonisation fongique révélée par les cartes mycorhiziennes de chaque espèce. L’acquisition et l’assemblage de multiples images microscopiques permettent d’évaluer la colonisation mycorhizienne chez les plants de maïs et de fétuque rouge afin de fournir des informations sur la position réaliste des structures développées. Les schémas mycorhiziens observés mettent en évidence l’efficacité variable de chaque plante en termes de développement de connexions avec les champignons symbiotiques du sol, causées par les traitements appliqués et le stade de croissance. Les cartes détaillées mycorhiziennes obtenues par la méthode MycoPatt sont utiles pour la détection précoce de l’efficacité des plantes dans l’acquisition symbiotique du sol.

Introduction

Les mycorhizes arbusculaires (MA) sont une catégorie d’endophytes terricoles qui sont constamment un domaine d’intérêt pour les chercheurs. Leur présence dans les racines de la plupart des plantes et leur implication dans les cycles des nutriments en font des composantes essentielles de la stabilité de tout écosystème où des plantes herbacées sont présentes ^1,2. Grâce à leur mycélium extra-radiculaire, la FA agit comme une extension fongique pour les racines des plantes, en particulier dans les zones difficiles d’accès³. L’activité principale est dans les racines des plantes hôtes, où la FA développe de grands réseaux d’hyphes et des structures intracellulaires spécifiques appelées arbuscules. Le manque de spécificité de l’hôte permet au symbiote de coloniser plusieurs espèces en même temps. Cette capacité confère à la FA le rôle de l’allocation des ressources et de la régulation des nutriments dans l’écosystème; Le champignon fournit également un soutien à la survie des plantes et aide à la performance des plantes 4,5,6,7. La réaction des espèces AM aux racines hôtes est visible dans l’extension et l’emplacement du mycélium intra-radiculaire et la présence et la forme des arbuscules développés intracellulairement. Les arbuscules intracellulaires agissent comme un point d’échange entre les deux symbiotes et représentent des zones caractérisées par des processus de transfert rapides. Les structures produites par l’AM dépendent de l’espèce et, en plus des arbuscules, dans les racines, elles développent également des vésicules, des spores et des cellules auxiliaires.

L’évaluation des symbiotes AM dans les racines des plantes ^8,9 présente de nombreux défis. Le premier est leur développement constant pendant toute la période de végétation des hôtes, ce qui entraîne de multiples changements dans la structure arbusculaire hyphe. Les différents stades de croissance arbusculaire, jusqu’à leur effondrement, sont clairement présents dans les racines, mais les structures AM sénescentes sont parfois digérées, ce qui ne les rend que partiellement visibles¹⁰. Le deuxième défi est représenté par la méthode et le protocole de coloration, la grande diversité des systèmes racinaires, la dimension de leurs cellules et les différences d’épaisseur, qui rendent difficile la proposition d’une méthode unifiée. Le dernier défi est représenté par l’évaluation et la notation de la colonisation de la FA. Il existe de nombreuses méthodes qui notent la FA avec différents degrés d’objectivité, et la plupart d’entre elles sont encore limitées aux techniques de microscopie. Les plus simples sont basés sur la présence / absence de structures dans le cortex racinaire, tandis que les plus complexes sont basés sur la notation visuelle et l’utilisation de classes de colonisation, avec l’intégration de la fréquence et de l’intensité du phénomène de colonisation. De nombreuses données ont été produites au cours des dernières décennies sur le statut mycorhizien de plusieurs espèces, mais la plupart des méthodes sont limitées à la valeur observée de la colonisation sans indiquer la position réelle de chaque structure dans le cortex racinaire. En réponse à la nécessité de résultats plus précis sur la colonisation de la MA, une méthode basée sur l’analyse microscopique des motifs mycorhiziens (MycoPatt) dans les racines a été développée pour assembler, sous forme numérique, les cartes mycorhiziennes détaillées¹¹. En outre, la méthode permet le calcul objectif des paramètres de colonisation et la détermination de la position réelle de chaque structure dans la racine.

La position des structures fongiques AM peut être importante pour répondre aux deux questions suivantes. La première est liée à l’analyse de la colonisation à un moment précis du cycle de végétation d’une plante. Dans ce contexte, il est très utile d’observer l’abondance des arbusculaires / vésicules, de signaler comment elles sont situées dans la racine et de fournir une image et des paramètres de colonisation très clairs. La seconde est liée à la détection de la stratégie fongique et de son orientation et même à la prévision de son développement futur. Une application du MycoPatt peut être pour les plantes analysées quotidiennement, tous les 2-3 jours, chaque semaine ou pendant divers stades de croissance. Dans ce contexte, l’emplacement des vésicules/arbuscules est important pour mieux comprendre le mécanisme biologique de la colonisation par la MA. Ces paramètres et observations sont très utiles pour compléter les paramètres mathématiques.

Le but de cet article est de démontrer la capacité du système MycoPatt à explorer le potentiel et la stratégie de colonisation des champignons AM indigènes dans les racines de Zea mays (maïs) à différents stades de développement et dans les racines de Festuca rubra (fétuque rouge) dans différentes conditions de fécondation à long terme. Pour atteindre cet objectif, deux grandes bases de données issues de deux expériences ont été analysées. L’expérience sur le maïs a été établie à Cojocna (46°44′56 » lat. N et 23°50′0 » de long. E), dans la ferme didactique expérimentale de l’Université des sciences agricoles et de médecine vétérinaire de Cluj sur un phaeoziom avec un sol à texture limoneuse¹². L’expérience sur la fétuque rouge fait partie d’un site expérimental plus vaste établi en 2001 à Ghețari, dans les montagnes Apuseni (46°49'064 » lat. N et 22°81'418'' de long. E), sur un sol préluvosol (terra rossa) de type^13,14. Le maïs a été récolté dans cinq phénophases de croissance^{différentes 12} : B1 = 2-4 feuilles (comme point de contrôle pour le début de la colonisation mycorhizienne); B2 = 6 feuilles; B3 = 8-10 feuilles; B4 = formation d’épis; B5 = maturité physiologique. À partir du stade 2-4 feuilles (A0), un traitement organique a été appliqué, ce qui a entraîné un facteur de graduation à deux (A1 = témoin et A2 = traité). Les racines de fétuque rouge ont été recueillies à la floraison à partir d’une expérience avec cinq fertilisations à long terme^13,14: V1 = témoin^, non fertilisé; V2 = 10 t·^ha-1 fumier; V3 = 10 t·ha-1 fumier + N 50 kg·^ha-1, P 2 O₅ 25 kg·ha-1, K₂O 25 kg·^ha-1; V4 = N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1; V5 = 10 t·ha-1 fumier + N 100 kg·^ha-1, P 2 O₅ 50 kg·ha-1, K₂O 50 kg·^ha-1. Cinq plantes ont été collectées à chaque stade de développement de chaque variante de fertilisation. Les protocoles de coloration et leur performance en termes de temps de traitement des échantillons et de qualité de coloration ont été analysés. La relation entre le développement des hyphes AM et la présence de ses structures dans les racines a été analysée séparément pour chaque espèce et s’est poursuivie avec l’identification des racines les plus permissives pour la colonisation. Les modèles de colonisation spécifiques de chaque système racinaire ont été analysés en fonction des cartes de colonisation et de la valeur des paramètres AM.

Le maïs est une plante annuelle, ce qui implique une croissance continue des racines, et c’était la principale raison d’appliquer le MycoPatt dans les stades de croissance. La fétuque rouge est une plante vivace provenant d’une prairie traitée depuis longtemps avec différents engrais. Ses racines ont un développement plus court de 1 an, et l’anthèse est considérée comme le point de végétation lorsque la plante change son métabolisme de végétatif à génératif. Pour capturer ces plantes pendant ces périodes d’activité intense, les points temporels susmentionnés ont été choisis. L’échantillonnage pendant la période de végétation est difficile pour cette espèce lorsqu’elle est cultivée dans des prairies naturelles.

Protocole

1. Sélection du matériel biologique, échantillonnage des racines et entreposage

1. Recueillir toute la racine des plantes à l’aide d’une pelle (figure 1A) séparément pour chaque variante et la répliquer. Retirez doucement, à la main, les gros agrégats de terre des racines. Lavez tout le système racinaire et mesurez-le sur une échelle avec des cellules de 1 cm x 1 cm (Figure 1B). Coupez les racines séparément pour chaque plante et placez-les dans un sac en plastique.
2. Rassemblez toutes les racines propres de chaque plante dans un sac en plastique et collectez tous les échantillons d’une variante dans un sac plus grand. Inscrivez sur chaque sac le nom de la scène/variante et la date d’échantillonnage. Conservez les racines au réfrigérateur ou au congélateur à une température comprise entre −4 °C et −20 °C jusqu’à la transformation.

2. Traitement des racines, nettoyage et coloration pour la microscopie

REMARQUE : Utilisez des gants, un masque et une cagoule microbiologique/chimique pour cette étape du protocole.

1. Assurez-vous que le processus de décongélation des racines se fait lentement à température ambiante. Pour toutes les étapes du traitement, utilisez de petits pots (30-50 ml) pour réduire la quantité d’agents nécessaires.
2. Effectuez les quatre étapes suivantes de la procédure de nettoyage et de coloration lents¹⁵. Faites toutes les étapes à température ambiante. Cette méthode permet le traitement d’un grand nombre d’échantillons en même temps sans utiliser de bain-marie pour l’ébullition.
   1. Nettoyage des racines: Placez toutes les racines d’une plante dans un bocal. Préparez une solution de NaOH à 10% avec de l’eau du robinet et versez-la dans chaque pot jusqu’à ce qu’elle recouvre complètement les racines. Agiter vigoureusement les pots pendant 1 min ou 2 min pour produire une dispersion homogène de la solution de clairage dans les racines. Répétez cette procédure après 24 heures et laissez les racines dans la solution de nettoyage pendant au moins 48 heures.
      REMARQUE: Les racines propres ont un aspect jaune pâle (jusqu’à blanc) et la consistance est douce (elles peuvent être facilement écrasées en appuyant avec une pince à épiler).
   2. Rinçage des racines: Passez le contenu d’un pot à la fois à travers un tamis. Recyclez la solution de compensation. Rincer les racines plusieurs fois à l’eau du robinet jusqu’à ce que la solution de nettoyage soit complètement éliminée.
      REMARQUE: Si la solution de nettoyage n’est pas complètement éliminée, cela affectera la qualité de la procédure de coloration.
   3. Coloration des racines: Placez les racines rincées dans un bocal propre. Préparer une solution d’encre-vinaigre à 5 % : 5 % avec de l’eau du robinet (5 mL d’encre bleue + 5 mL d’acide acétique à 9 % + 90 mL d’eau du robinet). Versez la solution dans chaque pot jusqu’à ce qu’elle recouvre complètement les racines. Agiter vigoureusement les pots pendant 1 min ou 2 min pour produire une dispersion homogène de la solution de coloration dans les racines. Répétez cette procédure après 24 h et laissez les racines dans cette solution pendant 48 h.
      NOTE: Les racines tachées ont une couleur bleue intense.
   4. Décoloration partielle des racines: Rincer les racines tachées dans l’eau du robinet pendant 1-2 min. Secouez vigoureusement les pots pour enlever la solution de coloration supplémentaire. Répétez la procédure si la coloration est trop intense et ne permet pas une évaluation microscopique claire.
      REMARQUE : Les racines tachées peuvent être conservées dans l’eau du robinet jusqu’à 1 semaine à température ambiante sans altérer la qualité des taches (figure 2). Pendant de plus longues périodes, les racines peuvent être maintenues jusqu’à 2-3 mois dans une solution commerciale de vinaigre de pomme à 5% (acide acétique à 5%).

3. Traitement des racines pour la microscopie

1. Segmentation des racines : Placer les racines colorées de chaque échantillon sur une planche à découper à l’échelle (figure 3A). Couper les racines en segments de 1 cm (figure 3B). Choisissez 15 segments pour chaque variante.
2. Méthode de broyage doux pour la préparation des segments: Étaler les racines sur une lame. Utilisez une poche de laminage pour couvrir les racines et écrasez-les doucement à partir d’un bord (figure 3C,D). Utilisez un outil en plastique souple, par exemple une pince à épiler, un manche de scalpel, un stylo ou un crayon avec une gomme, pour afficher lentement les racines sur la lame. Retirez délicatement la pochette de laminage et recouvrez l’échantillon d’une lamelle de couverture (Figure 3E).
   REMARQUE: Les racines ont une forme tubulaire, il est donc nécessaire de les séparer dans un plan bidimensionnel. Cette action suppose la séparation des racines sur le point médian, conduisant à l’affichage des deux parties du diamètre interne. L’utilisation de sachets de laminage dans la procédure de broyage doux permet d’afficher les racines, qui ont une forme de cylindre, en deux morceaux - un à gauche et un à droite - vers leur point médian. De cette façon, la racine entière est analysée en profondeur, et le degré de colonisation est le paramètre qui montre la colonisation volumétrique (décrite dans le travail original sur MycoPatt¹¹). En gros, nous coupons un cylindre en deux, et après cela, nous le reconstruisons mathématiquement.
3. Ajouter de l’eau dans un coin de la lame à l’aide d’une pipette et laisser l’eau se répandre lentement sur la lame (Figure 3F). Retirez l’eau supplémentaire avec une serviette en papier.

4. Analyse microscopique des échantillons de racines

1. Utilisez un microscope équipé d’une caméra à bonne résolution.
2. Analysez les diapositives à partir d’une extrémité. Capturez chaque champ microscopique. Renommez chaque image capturée avec un code qui permettra le post-assemblage réel des parties racines. Pour les racines épaisses, utilisez le grossissement 10x ou 40x, et pour les racines minces, utilisez le grossissement 40x. Utilisez le même objectif et le même grossissement pour l’ensemble des racines d’une espèce.

5. Assemblage d’images post-microscopiques

1. Utilisez un logiciel de présentation pour concevoir une planche à dessin pour l’assemblage d’images. Définissez la largeur 2-3 cm plus large que la largeur de l’image. Ajoutez toutes les images capturées à partir d’un segment dans l’ordre de leur capture et reconstruisez toute la longueur du segment racine (Figure 4A).
   1. En bref, collectez un total de 15 images pour chaque segment de 1 cm et organisez-les verticalement, en commençant par 1 à 15, dans le logiciel de présentation pour reconstruire le segment.
2. Alignez les images au centre. Utilisez l’alignement vertical pour vous assurer que chaque image suit la précédente. Sur toutes les images, placez une grille de 10 cellules x 150 cellules pour couvrir tout le segment racine.
   1. De plus, sur chaque image individuelle, placez une grille de 10 x 10 et, dans chaque cellule de cette grille, insérez un nombre de un à six si une structure AM est visible ou laissez vide si aucune structure AM n’est présente. De cette façon, la précision du processus est maximale sans erreur dans l’emplacement des structures de FA observées.
3. Ajoutez un tableau pour une grille de 10 cellules de largeur et de 150 cellules de longueur (15 carrés de 10 cellules x 10 cellules). Remplacez les dimensions de la largeur du tableau par la largeur des images. Modifiez la longueur du tableau pour qu’il comprenne toutes les images (Figure 4B).

6. Notation de la colonisation mycorhizienne

1. Utilisez le numéro unique pour noter chaque type de structure comme décrit dans la méthode des motifs mycorhiziens¹¹: 1 pour les hyphes; 2 pour les arbuscules; 3 pour les vésicules; 4 pour les spores; 5 pour les cellules auxiliaires; et 6 pour les points d’entrée (figure 4C). Noter chaque structure mycorhizienne observée à partir de chaque cellule des grilles précédemment appliquées (Figure 4D).

7. Analyse des données brutes et extraction des résultats

1. Insérez tous les scores obtenus dans la feuille de calcul MycoPatt¹¹. Utilisez la fonction copier/coller pour transférer toutes les partitions de la présentation dans la première feuille nommée rawdata (Figure 5).
2. Analyse primaire des résultats : Utilisez la troisième feuille nommée paramètres dans le tableur MycoPatt pour visualiser les résultats sous forme de pourcentages (%) séparément sous trois formes (Figure 6A-C). Utiliser les colonnes A à K pour analyser l’image horizontale de la colonisation; colonnes M à W pour analyser l’image verticale de la colonisation; et les colonnes Y à AI pour analyser la colonisation transversale (moyenne) pour chacun des 15 carrés 10 x 10 (lignes 2-17) et la colonisation moyenne finale (lignes 19-20).
   NOTE: La colonisation moyenne transversale est utilisée pour le calcul des paramètres de colonisation réels, liés à l’analyse horizontale et verticale. De cette façon, aucune erreur ne peut être commise par rapport à si seule l’analyse horizontale ou verticale est utilisée (décrite en détail dans l’œuvre originale¹¹). En outre, cet ensemble de paramètres est calculé pour toute la surface du champ microscopique.
   1. Utilisez les définitions et formules, spécifiques à chaque paramètre, pour analyser les résultats¹¹. Utilisez les paramètres de colonisation suivants : fréquence de colonisation (%), intensité de la colonisation (%), arbuscules (%) et vésicules (%), spores (%) et cellules auxiliaires (%), points d’entrée (%), pourcentage de zones non mycorhiziennes (%), degré global de colonisation (%) et rapport des zones mycorhiziennes/non mycorhiziennes.
      REMARQUE: Si les arbuscules, les vésicules, les spores, les cellules auxiliaires et les points d’entrée sont manquants dans les échantillons analysés, la feuille de calcul MycoPatt les notera à zéro (0).
3. Production et extraction de cartes mycorhiziennes : Visualiser l’image obtenue à partir de la conversion du code des structures mycorhiziennes en couleurs dans la deuxième feuille des graphes nommés MycoPatt (Figure 7A). Exportez l’image résultante dans la feuille de graphiques en tant qu’image (Figure 7B). Utilisez le code couleur dans la légende pour l’analyse des motifs mycorhiziens.
4. Analyse cartographique mycorhizienne: Identifier les structures les plus importantes et leur assemblage sur les cartes mycorhiziennes. Décrire le schéma de colonisation mycorhizienne observé dans les racines analysées. Décrire la stratégie de colonisation mycorhizienne basée sur le développement structurel observé dans la racine, le modèle de ramification et le développement des arbuscules / vésicules.

Résultats

L’utilisation correcte de la méthode de broyage doux des racines après les procédures de coloration fournit de bons détails sur les structures mycorhiziennes, à la fois pour Zea mays (Figure 8A-C) et Festuca rubra (Figure 9A-E), un bon contraste entre les structures mycorhiziennes et les cellules racinaires, et une confirmation de la stèle due à la couleur bleue. Si le...

Discussion

Les études sur la colonisation mycorhizienne sont vitales pour le développement de nouvelles stratégies dans le domaine agronomique. Le potentiel de multiples plantes cultivées à former une association symbiotique avec les mycorhizes arbusculaires en a fait une composante importante du développement durable de l’agroécosystème et du maintien de sa santé 16,17,18,19,20.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apple vinegar 5%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE MERE	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-mere
Blue Ink	Pelikan	4001	https://www.pelikan.com/pulse/Pulsar/ro_RO.Store.displayStore.224848./cerneal%C4%83-4001-de-la-pelikan
Cover slips	Menzel-Glaser	D 263 M	https://si.vwr.com/store/product/20545757/cover-glasses-menzel-glaser
Forceps, PMP	Vitalab	9.171 411	http://shop.llg.de/info881_Forceps_PMP_lang_UK. htm?UID=55005bf838d8000000000000 &OFS=33
Glass jar 47 mL	Indigo Cards	BORCAN 47 ML HEXAGONAL	https://indigo.com.ro/borcan-47-ml-hexagonal
Laminating Pouches	Peach	PP525-08	Business Card (60x90mm) / https://supremoffice.ro/folie-laminare-60x90mm-125mic-carte-vizita-100-top-peach-pp525-08-510328
Microflow Class II ABS Cabinet	Bioquell UK Ltd	Microflow Class II ABS Cabinet	http://www.laboratoryanalysis.co.uk/graphics/products/034_11%20CLASS%202BSC%20(STD).pdf
Microscope slides	Deltalab	D100001	https://distrimed.ro/lame-microscop-matuite-la-un-capat-26x76-mm-deltalab/?utm_source=Google%20Shopping&utm_campaign= google%20shopping%20distrimed&utm_medium=cpc& utm_term=1647&gclid=CjwKCAjwu YWSBhByEiwAKd_n_odzr8CaCXQ hl9VQkAB3p-ODo2Ssuou9cnoRtz1Gb xsjqPY7F05HmhoCj6oQAvD_BwE
Microsoft Office 365	Microsoft	Office 365	Excel and Powerpoint; spreadsheet and presentation
NaOH	Oltchim	01-2119457892-27-0065	http://www.sodacaustica.com.ro/pdf/fisa-tehnica-soda-caustica.pdf
Nitrile gloves	SemperGuard	816780637	https://www.sigmaaldrich.com/RO/en/product/aldrich/816780637?gclid=CjwKCAjwuYWSBhByEiwAKd _n_rmo4RRt8zBql7ul8ox AAYhwhxuXHWZcw4hlR x0Iro_4IyVt69aFHRoCmd wQAvD_BwE
Optika camera	OPTIKA	CP-8; P8 Pro Camera, 8.3 MP CMOS, USB 3.0	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/c-p-series/
Optika Microscope	OPTIKA	B383pL	https://www.optikamicroscopes.com/optikamicroscopes/product/b-380-series/
Protective mask FFP3	Hermes Gift	HERMES000100	EN 149-2001+A1:2009 / https://www.emag.ro/set-10-masti-de-protectie-respiratorie-hermes-gift-ffp3-5-straturi-albe-hermes000100/pd/DTZ8CXMBM/#specification-section
Scalpel	Cutfix	9409814	https://shop.thgeyer-lab.com/erp/catalog/search/search.action;jsessionid=C258CA 663588CD1CBE65BF 100F85241B?model.query=9409809
White wine vinegar 9%	FABRICA DE CONSERVE RAURENI S.R.L.	OȚET DE VIN ALB	https://www.raureni.ro/ro-ro/produs/otet-de-vin-alb