Inducción de la inflamación de la superficie ocular y recolección de tejidos afectados

Resumen

La inflamación de la superficie ocular daña los tejidos de la superficie ocular y compromete las funciones vitales del ojo. El presente protocolo describe un método para inducir inflamación ocular y recolectar tejidos comprometidos en un modelo de ratón de disfunción de la glándula de Meibomio (MGD).

Resumen

Las enfermedades de la superficie ocular incluyen una variedad de trastornos que alteran las funciones y estructuras de la córnea, la conjuntiva y la red de glándulas de la superficie ocular asociada. Las glándulas de Meibomio (MG) secretan lípidos que crean una capa de cobertura que evita la evaporación de la parte acuosa de la película lagrimal. Neutrófilos y trampas de ADN extracelular pueblan MG y la superficie ocular en un modelo de ratón de enfermedad ocular alérgica. Las trampas extracelulares agregadas de neutrófilos (aggNET) formulan una matriz en forma de malla compuesta de cromatina extracelular que ocluye las salidas de MG y condiciona la disfunción de MG. Aquí, se presenta un método para inducir inflamación de la superficie ocular y disfunción de MG. Los procedimientos para recolectar órganos relacionados con la superficie ocular, como la córnea, la conjuntiva y los párpados, se describen en detalle. Utilizando técnicas establecidas para procesar cada órgano, también se muestran las principales características morfológicas e histopatológicas de la disfunción de MG. Los exudados oculares ofrecen la oportunidad de evaluar el estado inflamatorio de la superficie ocular. Estos procedimientos permiten la investigación de intervenciones antiinflamatorias tópicas y sistémicas a nivel preclínico.

Introducción

Cada parpadeo de un ojo repone la suave película lagrimal dispersa sobre la córnea. Los epitelios de la superficie ocular facilitan la distribución y correcta orientación de la película lagrimal sobre la superficie ocular. Las mucinas son proporcionadas por la córnea y las células epiteliales de la conjuntiva para ayudar a colocar la parte acuosa de la película lagrimal proveniente de las glándulas lagrimales en la superficie de los ojos. Finalmente, la MG secreta lípidos que crean una capa de recubrimiento que evita la evaporación de la parte acuosa de la película lagrimal ^1,2,3. De esta manera, las funciones coordinadas de todos los órganos oculares protegen la superficie ocular de patógenos invasores o lesiones y apoyan una visión cristalina sin ningún dolor o molestia.

En una superficie ocular sana, la secreción ocular que fluye o el reuma ocular barre el polvo, las células epiteliales muertas, las bacterias, el moco y las células inmunitarias. Las trampas extracelulares agregadas de neutrófilos (aggNET) formulan una matriz en forma de malla compuesta de cromatina extracelular e incorporan estos componentes en el reuma del ojo. Los AggNET resuelven la inflamación por la degradación proteolítica de citoquinas y quimiocinas proinflamatorias⁴. Sin embargo, cuando se vuelven disfuncionales, estos aggNET aberrantes impulsan la patogénesis de enfermedades como las oclusiones vasculares en COVID-19⁵, cálculos biliares⁶ y sialolitiasis⁷. Del mismo modo, los aggNET en la superficie ocular desempeñan un papel protector y contribuyen a resolver la inflamación de la superficie altamente expuesta⁸. Una formación exagerada o la falta de aggNET en la superficie ocular pueden afectar la estabilidad de la película lagrimal y / o causar heridas corneales, conjuntivitis cicatrizante y enfermedad del ojo seco. Por ejemplo, la obstrucción de la MG es una de las principales causas de enfermedad del ojo seco⁹. También se sabe que los AggNET tapan el flujo de secreción de lípidos de los conductos de MG y causan disfunción de la glándula de Meibomio (MGD). La congestión de los orificios de MG por aggNETs causa una falta de líquido graso que envuelve la superficie ocular y líquido retrógrado embotellado, lo que resulta en disfunción de la función de la glándula y daño acinar. Esta disfunción puede provocar evaporación de la película lagrimal, fibrosis de los márgenes de los párpados, inflamación ocular y daño perjudicial a la MG^10,11.

Varios modelos animales se han desarrollado a lo largo de los años para imitar el proceso patológico de MGD en humanos. Por ejemplo, los ratones C57BL/6 de 1 año de edad han ayudado a estudiar los efectos relacionados con la edad sobre la enfermedad del ojo seco (DED) y la MGD, reflejando la patología de la enfermedad ocular en pacientes de 50 años o más^12,13,14. Además, los conejos son modelos apropiados para investigar los efectos de las intervenciones farmacológicas. Por lo tanto, la inducción de MGD en conejos ha sido reportada por la administración tópica de epinefrina o la introducción sistémica de ácido 13-cis-retinoico (isotretinoína)15,16,17,18,19.

Aunque estos modelos animales fueron adecuados para determinar los diferentes factores que contribuyen a la fisiopatología de la DGM, fueron restringidos en su utilización. Por ejemplo, el modelo murino de DGM relacionado con la edad era ideal para descifrar elementos solo en adultos mayores y, por lo tanto, los conejos parecían ser el modelo animal más adecuado para estudiar las enfermedades de la superficie ocular, ya que permiten la investigación de múltiples mecanismos fisiopatológicos. Sin embargo, debido a la falta de herramientas analíticas integrales para detectar proteínas en la superficie ocular y debido a que muchas partes del genoma del conejo no están anotadas, están limitadas para las investigaciones^20,21.

Además, estos modelos animales utilizados para investigar la patogénesis de la enfermedad del ojo seco no proporcionaron detalles adecuados para analizar el brazo inmunológico del trastorno que instiga la inflamación de la superficie ocular. En consecuencia, el modelo murino de DGM desarrollado por Reyes et al. mostró una asociación entre la enfermedad ocular alérgica en ratones y la DGM en humanos y destacó la etiología inmune responsable de la MGD obstructiva²¹. Este modelo asocia la enfermedad ocular alérgica con una respuesta TH17 que recluta neutrófilos a la conjuntiva y al párpado, causando DGM e inflamación ocular crónica²¹. La inducción de DGM e inflamación ocular en este modelo murino es una herramienta valiosa para investigar eventos aguas arriba durante el desarrollo de inflamación local impulsada por una respuesta inmune continua²¹. El protocolo actual describe la inflamación de la superficie ocular acompañada de DGM obstructiva. En este método, los ratones son inmunizados y, después de 2 semanas, desafiados en la superficie ocular con el inmunógeno durante 7 días. Además, se describen los pasos para aislar el exudado ocular y los órganos oculares asociados durante la inflamación aguda y la disección de la córnea, la conjuntiva y los párpados.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices institucionales sobre bienestar animal y aprobadas por la comisión de bienestar animal de la Universidad Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU) (número de permiso: 55.2.2-2532-2-1217). Para el presente estudio se utilizaron ratones hembra C57Bl/6, de 7 a 9 semanas de edad. Los ratones se obtuvieron de fuentes comerciales (ver Tabla de materiales) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos con ciclos de día / noche de 12 h.

1. Inducción de inflamación murina de la superficie ocular

1. Realizar la preparación de inmunógenos para la inmunización.
   1. Preparar el inmunógeno recién el día de la inmunización, mezclando ovoalbúmina (OVA, 50 mg/ml) y toxina pertussis (100 μg/ml) en solución salina y el hidróxido de aluminio adyuvante (40 mg/ml) (ver Tabla de materiales) en una proporción de 1:1.
      PRECAUCIÓN: Realice la apertura, reconstitución y preparación de inmunógenos de la toxina pertussis en un gabinete de seguridad laminar. Use ropa protectora y evite cualquier contacto con la piel.
   2. Incubar la mezcla de inmunógeno y adyuvante a temperatura ambiente durante 30 min y cargar 100 μL en una jeringa de 1 ml.
   3. Realizar la inyección intraperitoneal de la solución de inmunógeno en un ratón no anestesiado.
      1. Sostenga el mouse suavemente por la cola mientras agarra la rejilla de la jaula. Sostenga firmemente la piel de la espalda y la región del cuello entre el pulgar y el índice y fije la cola y las extremidades inferiores entre el dedo anular y meñique contra la palma de la mano.
      2. Mantenga el ratón fijo con la cabeza hacia abajo.
      3. Inyecte 100 μL de la solución de inmunógeno preparada en el cuadrante derecho o izquierdo de la cavidad abdominal inferior.
2. Realizar la exposición a la superficie ocular 2 semanas después de la inmunización.
   1. Anestesiar al ratón con isoflurano (2,5%).
   2. Aplique 5 μL de OVA (50 mg/ml) o solución salina (0,9 % de NaCl) por ojo en ambos ojos y espere hasta que la gota sea absorbida por el ojo. Esto toma ~ 5 min.
   3. Repita el procedimiento 1 veces al día durante 7 días.
      NOTA: La administración tópica de medicamentos se puede hacer de la misma manera.

2. Recolección de exudados oculares

1. Recuperar los exudados oculares formados durante la fase de provocación aplicando 50 μL de solución salina estéril en el ojo inmediatamente después de la provocación.
2. Para obtener una suspensión unicelular, tratar la secreción ocular recogida con MNasa recombinante (2 x 10⁶ gel U/mL, ver Tabla de materiales) que contiene el cofactor calcio (5 mM) a 37 °C durante 20 min.
3. Centrifugar a 400 x g durante 7 min a temperatura ambiente.
4. Aísle el sobrenadante y mida las citocinas y quimiocinas utilizando ELISA multiplexado de acuerdo con las instrucciones del fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: El sobrenadante obtenido se puede utilizar para el análisis de proteínas y el pellet para ensayos funcionales como inmunofenotipado, fagocitosis, degranulación y expresión génica.

3. Escisión de los tejidos de la superficie ocular

1. Disecciona los párpados y el globo ocular siguiendo los pasos a continuación.
   1. Eutanasia del ratón por asfixia de_CO2 y luxación cervical.
   2. Coloque el ratón sobre una superficie uniforme.
   3. Desinfecte el área orbitaria alrededor del ojo con un hisopo impregnado con etanol al 70%.
   4. Haga una incisión entre la oreja y el seno retroorbitario y a lo largo de la superficie por encima del hueso escamoso verticalmente, extendiendo la incisión horizontalmente debajo del párpado inferior a lo largo del hueso maxilar y por encima del párpado superior a lo largo del hueso frontal. Esto forma una incisión alrededor del ojo (Figura 1).
   5. Sostenga cuidadosamente el tejido disecado alrededor del ojo con pinzas curvas y saque el tejido y el globo ocular.
   6. Coloque los órganos extirpados en PBS estéril.
   7. Recorte el exceso de tejido muscular facial alrededor de los párpados superiores extirpados con un bisturí y bajo el microscopio estereoscópico.
2. Recoge la conjuntiva siguiendo los pasos a continuación.
   1. Coloque el párpado superior sobre una placa de Petri seca bajo el microscopio estereoscópico.
   2. Usando pinzas finas y un bisturí, retire la capa blanquecina-mucosa muy suavemente de la superficie interna del párpado.
3. A continuación, disecciona la córnea siguiendo los pasos a continuación.
   1. Coloque el globo ocular en una nueva placa de Petri seca sobre hielo seco durante 3 minutos.
   2. Coloque la placa de Petri sobre la superficie del banco en una posición estable.
   3. Haga una pequeña incisión en el borde de la córnea junto al limbo con tijeras finas y afiladas.
   4. Prolongar la incisión con el bisturí alrededor del globo ocular, separando la esclerótica de la córnea.
   5. Retire los restos del iris y el cristalino de la parte posterior de la córnea enjuagando generosamente con solución salina.

4. Documentación de la obstrucción de la glándula de Meibomio (MG)

1. Para evaluar el MG y sus orificios, coloque los párpados extirpados en posición vertical bajo el microscopio estereoscópico (Figura 2).
2. Capture imágenes con epiiluminación de luz blanca de acuerdo con el tiempo de exposición de la cámara y la configuración ISO.
   NOTA: El análisis morfométrico de estas imágenes proporciona una cuantificación fiable del tamaño del tapón en la salida de las glándulas. La cuantificación se puede realizar delineando con la herramienta varita los tapones oculares y ejecutando el comando "Analizar partículas" del software Image J (ver Tabla de materiales).

5. Transiluminación de párpados (morfología de la glándula de Meibomio)

1. Para evaluar el área de MG, coloque los párpados extirpados en posición horizontal y encienda la retroiluminación del estereomicroscopio equipado con una cámara infrarroja (Figura 3).
2. Capture imágenes ajustando el tiempo de exposición de acuerdo con el ISO de la cámara (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Las imágenes infrarrojas de estos párpados transiluminados bajo el microscopio estereoscópico pueden ayudar a medir la forma y el tamaño de cada acino. El análisis morfométrico de estas imágenes proporciona una cuantificación fiable del tamaño y número de MG. La cuantificación se puede realizar delineando el MG con la herramienta varita y ejecutando el comando "Analizar partículas" del software Image J.

Resultados

El presente protocolo describe los pasos secuenciales para establecer un modelo murino de inflamación de la superficie ocular. Los protocolos tienen como objetivo mostrar cómo aplicar la terapéutica localmente, obtener exudados oculares y extirpar órganos accesorios asociados, como párpados sanos e inflamados (Figura 2), la córnea y la conjuntiva. Se debe prestar atención cuando se diseccionan los párpados superiores para el aislamiento de la conjuntiva, y debe almacenarse en 1x PBS ...

Discusión

La secreción oleosa de las glándulas de Meibomio es de gran importancia para un ojo sano²². Sin embargo, la obstrucción de estas glándulas sebáceas por trampas extracelulares agregadas de neutrófilos (aggNETs) que se alinean como hebras paralelas ubicadas en las placas tarsales de ambos párpados puede alterar la película lagrimal²³. Esta alteración resulta en disfunción de la glándula de Meibomio (DGM)¹ y evaporación lagrimal acelerada y ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco
Aluminium Hydroxide	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks	Charles River Laboratories
Calcium	Carl roth	CN93.1	1 M Final Concentration: 5 mM
Curved forceps	FST by Dumont SWITZERLAND	5/45 11251-35
Fine sharp scissor	FST Stainless steel, Germany	15001-08
Laminar safety cabinet	Herasafe
Macrophotography Camera	Canon	EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter)	Nikon	D5300
Mnase	New England biolabs	M0247S	2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)	Biolegend	CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline)	B.Braun
Ovalbumin (OVA)	Endofit, Invivogen	9006-59-1	10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin	ThermoFisher Scientific	PHZ1174	50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish	Greiner bio-one	628160
Scalpel	Feather disposable scalpel	No. 21	Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope	Zaiss	Stemi508
Syringe (corneal/iris washing)	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization)	BD Microlane	24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm