Induktion der Augenoberflächenentzündung und Ansammlung von betroffenen Geweben

Zusammenfassung

Eine Entzündung der Augenoberfläche schädigt das Augenoberflächengewebe und beeinträchtigt lebenswichtige Funktionen des Auges. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Induktion einer Augenentzündung und zur Sammlung von kompromittiertem Gewebe in einem Mausmodell der Meibom-Drüsendysfunktion (MGD).

Zusammenfassung

Zu den Erkrankungen der Augenoberfläche gehören eine Reihe von Erkrankungen, die die Funktionen und Strukturen der Hornhaut, der Bindehaut und des damit verbundenen Augenoberflächennetzwerks stören. Meibom-Drüsen (MG) sezernieren Lipide, die eine Deckschicht bilden, die die Verdunstung des wässrigen Teils des Tränenfilms verhindert. Neutrophile und extrazelluläre DNA-Fallen bevölkern MG und die Augenoberfläche in einem Mausmodell für allergische Augenerkrankungen. Aggregierte extrazelluläre Neutrophilenfallen (aggNETs) formulieren eine netzartige Matrix, die aus extrazellulärem Chromatin besteht, die MG-Ausgänge verdeckt und MG-Dysfunktion konditioniert. Hier wird eine Methode zur Induktion von Augenoberflächenentzündungen und MG-Dysfunktion vorgestellt. Die Verfahren zur Entnahme von Organen im Zusammenhang mit der Augenoberfläche, wie Hornhaut, Bindehaut und Augenlider, werden detailliert beschrieben. Mit etablierten Techniken zur Verarbeitung jedes Organs werden auch die wichtigsten morphologischen und histopathologischen Merkmale der MG-Dysfunktion gezeigt. Augenexsudate bieten die Möglichkeit, den Entzündungszustand der Augenoberfläche zu beurteilen. Diese Verfahren ermöglichen die Untersuchung topischer und systemischer entzündungshemmender Interventionen auf präklinischer Ebene.

Einleitung

Jeder Wimpernschlag füllt den glatten Tränenfilm, der über die Hornhaut verteilt ist, wieder auf. Die Augenoberflächenepithel erleichtern die Verteilung und korrekte Ausrichtung des Tränenfilms auf der Augenoberfläche. Mucine werden von den Hornhaut- und Bindehautepithelzellen bereitgestellt, um den wässrigen Teil des Tränenfilms aus den Tränendrüsen auf der Augenoberfläche zu positionieren. Schließlich sondert MG Lipide ab, die eine Deckschicht bilden, die die Verdunstung des wässrigen Teils des Tränenfilms ^1,2,3 verhindert. Auf diese Weise schützen die aufeinander abgestimmten Funktionen aller Augenorgane die Augenoberfläche vor eindringenden Krankheitserregern oder Verletzungen und unterstützen eine kristallklare Sicht ohne Schmerzen oder Beschwerden.

In einer gesunden Augenoberfläche fegt der okuläre fließende Ausfluss oder Augenrheum Staub, tote Epithelzellen, Bakterien, Schleim und Immunzellen weg. Aggregierte extrazelluläre Neutrophilenfallen (aggNETs) formulieren eine netzartige Matrix aus extrazellulärem Chromatin und bauen diese Komponenten in das Augenrheum ein. AggNETs lösen Entzündungen durch den proteolytischen Abbau von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen^{auf 4}. Wenn sie jedoch dysfunktional werden, treiben diese aberranten aggNETs die Pathogenese von Krankheiten wie Gefäßverschlüssen bei COVID-19⁵, Gallensteinen⁶ und Sialolithiasis⁷ voran. In ähnlicher Weise spielen aggNETs auf der Augenoberfläche eine schützende Rolle und tragen zur Auflösung von Entzündungen der stark exponierten Oberfläche bei⁸. Entweder eine übertriebene Bildung oder ein Mangel an aggNETs in der Augenoberfläche kann die Stabilität des Tränenfilms beeinträchtigen und/oder Hornhautwunden, vernarbende Konjunktivitis und Erkrankungen des trockenen Auges verursachen. Zum Beispiel ist die Obstruktion von MG eine Hauptursache für die Erkrankung des trockenen Auges⁹. Es ist auch bekannt, dass AggNETs den Fluss der Lipidsekretion aus den MG-Kanälen verstopfen und eine Meibom-Drüsendysfunktion (MGD) verursachen. Die Stauung von MG-Öffnungen durch aggNETs verursacht einen Mangel an Fettflüssigkeit, die die Augenoberfläche umhüllt, und retrograde abgefüllte Flüssigkeit, was zu Funktionsstörungen der Drüsenfunktion und Azinusschäden führt. Diese Dysfunktion kann zu Tränenfilmverdunstung, Fibrose der Ränder an den Augenlidern, Augenentzündungen und schädlichen Schäden am MG^10,11 führen.

Im Laufe der Jahre wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um den pathologischen Prozess der MGD beim Menschen nachzuahmen. Zum Beispiel haben C57BL / 6-Mäuse im Alter von 1 Jahr dazu beigetragen, altersbedingte Auswirkungen auf die Krankheit des trockenen Auges (DED) und MGD zu untersuchen, was die Pathologie der Augenerkrankung bei Patienten im Alter von 50 Jahren und älter widerspiegelt^12,13,14. Darüber hinaus sind Kaninchen geeignete Modelle, um die Wirkung pharmakologischer Interventionen zu untersuchen. Daher wurde die Induktion von MGD bei Kaninchen entweder durch die topische Verabreichung von Adrenalin oder die systemische Einführung von 13-cis-Retinsäure (Isotretinoin)15,16,17,18,19 berichtet.

Obwohl diese Tiermodelle ausreichend waren, um die verschiedenen Faktoren zu bestimmen, die zur Pathophysiologie von MGD beitragen, waren sie in ihrer Verwendung eingeschränkt. Zum Beispiel war das murine Modell der altersbedingten MGD ideal für die Entschlüsselung von Elementen nur bei älteren Erwachsenen, und daher schienen Kaninchen das am besten geeignete Tiermodell zu sein, um Augenoberflächenerkrankungen zu untersuchen, da sie die Untersuchung mehrerer pathophysiologischer Mechanismen ermöglichen. Aufgrund des Fehlens umfassender analytischer Werkzeuge zum Nachweis von Proteinen an der Augenoberfläche und weil viele Teile des Kaninchengenoms unkommentiert sind, sind sie jedoch für Untersuchungen eingeschränkt^20,21.

Darüber hinaus lieferten diese Tiermodelle, die zur Untersuchung der Pathogenese der Erkrankung des trockenen Auges verwendet wurden, keine ausreichenden Details, um den immunologischen Arm der Erkrankung zu analysieren, die die Entzündung der Augenoberfläche auslöst. Dementsprechend zeigte das von Reyes et al. entwickelte Mausmodell von MGD einen Zusammenhang zwischen allergischen Augenerkrankungen bei Mäusen und MGD beim Menschen und hob die Immunätiologie hervor, die für obstruktive MGD²¹ verantwortlich ist. Dieses Modell assoziiert allergische Augenerkrankungen mit einer TH17-Reaktion, die Neutrophile in die Bindehaut und das Augenlid rekrutiert, was MGD und chronische Augenentzündungen verursacht²¹. Die Induktion von MGD und Augenentzündung in diesem murinen Modell ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung vorgelagerter Ereignisse während der Entwicklung lokaler Entzündungen, die durch eine anhaltende Immunantwort angetrieben werden²¹. Das aktuelle Protokoll beschreibt die Entzündung der Augenoberfläche, begleitet von obstruktiver MGD. Bei dieser Methode werden Mäuse immunisiert und nach 2 Wochen 7 Tage lang auf der Augenoberfläche mit dem Immunogen herausgefordert. Weiterhin werden die Schritte zur Isolierung des Augenexsudats und der zugehörigen Augenorgane bei akuten Entzündungen und der Dissektion von Hornhaut, Bindehaut und Augenlidern beschrieben.

Protokoll

Alle Verfahren mit Tieren wurden nach den institutionellen Richtlinien zum Tierschutz durchgeführt und von der Tierschutzkommission der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU) genehmigt (Genehmigungsnummer: 55.2.2-2532-2-1217). Für die vorliegende Studie wurden weibliche C57Bl/6-Mäuse im Alter von 7-9 Wochen verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle) und unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit 12 h Tag/Nacht-Zyklen gehalten.

1. Induktion einer Entzündung der Augenoberfläche der Maus

1. Führen Sie eine Immunogenvorbereitung für die Immunisierung durch.
   1. Bereiten Sie das Immunogen frisch am Tag der Immunisierung vor, indem Sie Ovalbumin (OVA, 50 mg/ml) und Keuchhustentoxin (100 μg/ml) in Kochsalzlösung und dem Adjuvans Aluminiumhydroxid (40 mg/ml) (siehe Materialtabelle) im Verhältnis 1:1 mischen.
      VORSICHT: Führen Sie die Öffnung, Rekonstitution und Immunogenpräparation von Pertussistoxin in einer laminaren Sicherheitswerkbank durch. Tragen Sie Schutzkleidung und vermeiden Sie jeglichen Kontakt mit der Haut.
   2. Das Immunogen- und Adjuvansgemisch bei Raumtemperatur für 30 min inkubieren und 100 μL in eine 1-ml-Spritze laden.
   3. Führen Sie eine intraperitoneale Injektion der Immunogenlösung in einer nicht betäubten Maus durch.
      1. Halten Sie die Maus sanft am Schwanz, während Sie das Käfiggitter greifen. Halten Sie die Haut des Rückens und die Nackenregion fest zwischen Daumen und Zeigefinger und fixieren Sie den Schwanz und die unteren Gliedmaßen zwischen dem Ring und dem kleinen Finger gegen die Handfläche.
      2. Halten Sie die feste Maus mit dem Kopf nach unten.
      3. Injizieren Sie 100 μL der vorbereiteten Immunogenlösung in den rechten oder linken Quadranten der unteren Bauchhöhle.
2. Führen Sie 2 Wochen nach der Immunisierung eine Augenoberflächenprovokation durch.
   1. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran (2,5%).
   2. Tragen Sie 5 μL OVA (50 mg/ml) oder Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) pro Auge auf beide Augen auf und warten Sie, bis der Tropfen vom Auge absorbiert wird. Dies dauert ~5 Min.
   3. Wiederholen Sie den Vorgang 1x täglich für 7 Tage.
      HINWEIS: Die topische Verabreichung von Medikamenten kann auf die gleiche Weise erfolgen.

2. Entnahme von Augenexsudaten

1. Gewinnen Sie die während der Provokationsphase gebildeten Augenexsudate zurück, indem Sie unmittelbar nach der Challenge 50 μL sterile Kochsalzlösung auf das Auge auftragen.
2. Um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, behandeln Sie den gesammelten Augenausfluss mit rekombinanter MNase (2 x 10⁶ Gel U/ml, siehe Materialtabelle), die den Cofaktor Calcium (5 mM) bei 37 °C für 20 min enthält.
3. Bei 400 x g 7 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
4. Isolieren Sie den Überstand und messen Sie die Zytokine und Chemokine mit einem gemultiplexten ELISA gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Der erhaltene Überstand kann für die Proteinanalyse und das Pellet für funktionelle Assays wie Immunphänotypisierung, Phagozytose, Degranulation und Genexpression verwendet werden.

3. Exzision von Augenoberflächengewebe

1. Sezieren Sie die Augenlider und die Augenkugel mit den folgenden Schritten.
   1. Euthanasieren Sie die Maus durch CO₂ -Erstickung und zervikale Dislokation.
   2. Platzieren Sie die Maus auf einer ebenen Fläche.
   3. Desinfizieren Sie den Augenorbitalbereich mit einem Tupfer, der mit 70% Ethanol imprägniert ist.
   4. Machen Sie einen Schnitt zwischen dem Ohr und dem retroorbitalen Sinus und entlang der Oberfläche über dem Plattenepithelknochen vertikal, wobei der Schnitt horizontal unter dem unteren Augenlid entlang des Oberkieferknochens und oberhalb des oberen Augenlids entlang des Stirnbeins verlängert wird. Dies bildet einen Schnitt um das Auge herum (Abbildung 1).
   5. Halten Sie das sezierte Gewebe vorsichtig mit einer gebogenen Pinzette um das Auge herum und ziehen Sie das Gewebe und den Augapfel heraus.
   6. Legen Sie die herausgeschnittenen Organe in steriles PBS.
   7. Schneiden Sie überschüssiges Gesichtsmuskelgewebe um die herausgeschnittenen oberen Augenlider mit einem Skalpell und unter dem Stereomikroskop.
2. Sammeln Sie die Bindehaut, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
   1. Legen Sie das obere Augenlid auf eine trockene Petrischale unter dem Stereomikroskop.
   2. Mit einer feinen Pinzette und einem Skalpell die weißlich-schleimige Schicht ganz vorsichtig aus der Innenseite des Augenlids abziehen.
3. Als nächstes sezieren Sie die Hornhaut mit den folgenden Schritten.
   1. Legen Sie die Augenkugel für 3 min auf eine neue trockene Petrischale auf Trockeneis.
   2. Nehmen Sie die Petrischale in stabiler Position auf die Bankfläche.
   3. Machen Sie einen kleinen Schnitt am Rand der Hornhaut neben dem Limbus mit einer feinen scharfen Schere.
   4. Verlängern Sie den Schnitt mit dem Skalpell um den Augenglobus und trennen Sie die Sklera von der Hornhaut.
   5. Entfernen Sie Reste der Iris und der Linse von der Rückseite der Hornhaut, indem Sie großzügig mit Kochsalzlösung spülen.

4. Dokumentation der Obstruktion der Meibom-Drüse (MG)

1. Um das MG und seine Öffnungen zu beurteilen, platzieren Sie die herausgeschnittenen Augenlider in aufrechter Position unter dem Stereomikroskop (Abbildung 2).
2. Nehmen Sie Bilder mit Weißlicht-Epi-Beleuchtung gemäß der Belichtungszeit der Kamera und den ISO-Einstellungen auf.
   HINWEIS: Die morphometrische Analyse dieser Bilder liefert eine zuverlässige Quantifizierung der Pfropfengröße am Ausgang der Drüsen. Die Quantifizierung kann durchgeführt werden, indem mit dem Zauberstabwerkzeug die Augenstöpsel skizziert und der Befehl "Partikel analysieren" der Image J-Software ausgeführt wird (siehe Materialtabelle).

5. Durchleuchtung von Augenlidern (Meibom-Drüsenmorphologie)

1. Um den MG-Bereich zu beurteilen, platzieren Sie die ausgeschnittenen Augenlider in einer horizontalen Position und schalten Sie die Hintergrundbeleuchtung des Stereomikroskops ein, das mit einer Infrarotkamera ausgestattet ist (Abbildung 3).
2. Nehmen Sie Bilder auf, indem Sie die Belichtungszeit entsprechend der ISO-Norm der Kamera (siehe Materialtabelle) anpassen.
   HINWEIS: Infrarotaufnahmen dieser transbeleuchteten Augenlider unter dem Stereomikroskop können helfen, die Form und Größe jedes Acini zu messen. Die morphometrische Analyse dieser Bilder liefert eine zuverlässige Quantifizierung der Größe und Anzahl von MG. Die Quantifizierung kann durchgeführt werden, indem das MG mit dem Zauberstabwerkzeug skizziert und der Befehl "Partikel analysieren" der Image J-Software ausgeführt wird.

Ergebnisse

Das vorliegende Protokoll beschreibt die sequentiellen Schritte zur Erstellung eines murinen Modells der Augenoberflächenentzündung. Die Protokolle sollen zeigen, wie Therapeutika lokal angewendet, Augenexsudate gewonnen und assoziierte akzessorische Organe wie gesunde und entzündete Augenlider (Abbildung 2), Hornhaut und Bindehaut herausgeschnitten werden können. Es muss darauf geachtet werden, dass die oberen Augenlider zur Isolierung der Bindehaut seziert werden, und sie muss während...

Diskussion

Das ölige Sekret der Meibom-Drüsen ist für ein gesundes Auge von großer Bedeutung²². Die Obstruktion dieser Talgdrüsen durch aggregierte neutrophile extrazelluläre Fallen (aggNETs), die sich als parallele Stränge auf den Tarsalplatten beider Augenlider aneinanderreihen, kann jedoch den Tränenfilm^{stören 23}. Diese Störung führt zu einer Meibom-Drüsendysfunktion (MGD)¹ und beschleunigter Tränenverdunstung und konditioniert die Schädigung d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco
Aluminium Hydroxide	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks	Charles River Laboratories
Calcium	Carl roth	CN93.1	1 M Final Concentration: 5 mM
Curved forceps	FST by Dumont SWITZERLAND	5/45 11251-35
Fine sharp scissor	FST Stainless steel, Germany	15001-08
Laminar safety cabinet	Herasafe
Macrophotography Camera	Canon	EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter)	Nikon	D5300
Mnase	New England biolabs	M0247S	2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)	Biolegend	CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline)	B.Braun
Ovalbumin (OVA)	Endofit, Invivogen	9006-59-1	10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin	ThermoFisher Scientific	PHZ1174	50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish	Greiner bio-one	628160
Scalpel	Feather disposable scalpel	No. 21	Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope	Zaiss	Stemi508
Syringe (corneal/iris washing)	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization)	BD Microlane	24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm