АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Воспаление глазной поверхности повреждает ткани глазной поверхности и ставит под угрозу жизненно важные функции глаза. Настоящий протокол описывает способ индуцирования воспаления глаз и сбора скомпрометированных тканей в мышиной модели дисфункции мейбомиевой железы (MGD).

Аннотация

Заболевания глазной поверхности включают в себя ряд нарушений, которые нарушают функции и структуры роговицы, конъюнктивы и связанной с ними сети глазных поверхностных желез. Мейбомиевые железы (МГ) выделяют липиды, которые создают покровный слой, препятствующий испарению водной части слезной пленки. Нейтрофилы и внеклеточные ловушки ДНК заполняют MG и глазную поверхность в мышиной модели аллергического заболевания глаз. Агрегированные внеклеточные ловушки нейтрофилов (aggNETs) образуют сетчатую матрицу, состоящую из внеклеточного хроматина, который закупоривает выходы MG и кондиционирует дисфункцию MG. Здесь представлен метод индуцирования воспаления глазной поверхности и дисфункции МГ. Подробно описаны процедуры сбора органов, связанных с глазной поверхностью, таких как роговица, конъюнктива и веки. Используя устоявшиеся методики обработки каждого органа, также показаны основные морфологические и гистопатологические особенности дисфункции МГ. Глазные экссудаты дают возможность оценить воспалительное состояние глазной поверхности. Эти процедуры позволяют исследовать местные и системные противовоспалительные вмешательства на доклиническом уровне.

Введение

Каждое мгновение глаза восполняет гладкую слезную пленку, рассеянную по роговице. Эпителий глазной поверхности способствует распределению и правильной ориентации слезной пленки на глазной поверхности. Муцины обеспечиваются эпителиальными клетками роговицы и конъюнктивы, чтобы помочь позиционировать водную часть слезной пленки, поступающей из слезных желез на поверхности глаз. Наконец, МГ выделяет липиды, которые создают покровный слой, препятствующий испарению водной части слезной пленки 1,2,3. Таким образом, скоординированные функции всех глазных органов защищают глазную поверхность от вторжения патогенов или травм и поддерживают кристально чистое зрение без какой-либо боли или дискомфорта.

В здоровой глазной поверхности глазные струящиеся выделения или ревматический ревмат глаза сметают пыль, мертвые эпителиальные клетки, бактерии, слизь и иммунные клетки. Агрегированные нейтрофильные внеклеточные ловушки (aggNETs) образуют сетчатую матрицу, состоящую из внеклеточного хроматина, и включают эти компоненты в ревматоз глаза. AggNETs устраняют воспаление путем протеолитической деградации провоспалительных цитокинов и хемокинов4. Однако, когда они становятся дисфункциональными, эти аберрантные аггНЕТы управляют патогенезом таких заболеваний, как окклюзия сосудов при COVID-195, камни в желчном пузыре6 и сиалолитиаз7. Аналогичным образом, aggNETs на поверхности глаза играют защитную роль и способствуют разрешению воспаления сильно открытой поверхности8. Либо преувеличенное образование, либо отсутствие aggNETs на поверхности глаза может ухудшить стабильность слезной пленки и / или вызвать раны роговицы, цикатризирующий конъюнктивит и болезнь сухого глаза. Например, обструкция МГ является основной причиной заболевания сухого глаза9. Также известно, что AggNETs закупоривают поток секреции липидов из протоков MG и вызывают дисфункцию мейбомиевой железы (MGD). Застой mg отверстий aggNET вызывает недостаток жировой жидкости, обволакивающей глазную поверхность, и ретроградную бутилированную жидкость, что приводит к дисфункции функции железы и повреждению ацинара. Эта дисфункция может привести к испарению слезной пленки, фиброзу краев на веках, воспалению глаз и вредному повреждению MG10,11.

На протяжении многих лет было разработано несколько животных моделей, чтобы имитировать патологический процесс MGD у людей. Например, мыши C57BL/6 в возрасте 1 года помогли изучить возрастные эффекты на болезнь сухого глаза (DED) и MGD, отражающие патологию глазного заболевания у пациентов в возрасте 50 лет и старше 12,13,14. Кроме того, кролики являются подходящими моделями для изучения эффектов фармакологических вмешательств. Таким образом, индуцирование МГД у кроликов было зарегистрировано либо путем местного введения адреналина, либо системного введения 13-цис-ретиноевой кислоты (изотретиноина)15,16,17,18,19.

Хотя эти животные модели были адекватны для определения различных факторов, способствующих патофизиологии MGD, они были ограничены в их использовании. Например, мышиная модель возрастного MGD идеально подходила для расшифровки элементов только у пожилых людей, и, следовательно, кролики оказались наиболее подходящей животной моделью для изучения заболеваний глазной поверхности, поскольку они позволяют исследовать множественные патофизиологические механизмы. Однако из-за отсутствия комплексных аналитических инструментов для обнаружения белков на поверхности глаза и из-за того, что многие части генома кролика неаннотированы, они ограничены для исследований20,21.

Кроме того, эти животные модели, используемые для исследования патогенеза заболевания сухого глаза, не предоставили адекватных деталей для анализа иммунологической ветви расстройства, которое вызывает воспаление глазной поверхности. Соответственно, мышиная модель MGD, разработанная Reyes et al., показала связь между аллергическим заболеванием глаз у мышей и MGD у людей и подчеркнула иммунную этиологию, ответственную за обструктивный MGD21. Эта модель связывает аллергическое заболевание глаз с ответом TH17, который набирает нейтрофилы в конъюнктиву и веко, вызывая MGD и хроническое воспаление глаз21. Индукция MGD и глазного воспаления в этой мышиной модели является ценным инструментом для исследования событий вверх по течению во время развития местного воспаления, вызванного продолжающимся иммунным ответом21. Текущий протокол описывает воспаление глазной поверхности, сопровождающееся обструктивным MGD. В этом методе мышей иммунизируют и через 2 недели оспаривают на глазной поверхности иммуногеном в течение 7 дней. Кроме того, описаны этапы выделения глазного экссудата и связанных с ним глазных органов при остром воспалении и рассечении роговицы, конъюнктивы и век.

протокол

Все процедуры с участием животных проводились в соответствии с институциональными руководящими принципами по благополучию животных и утверждались комиссией по благополучию животных Университета Фридриха-Александра Эрлангена-Нюрнберга (FAU) (номер разрешения: 55.2.2-2532-2-1217). Для настоящего исследования использовались самки мышей C57Bl/6 в возрасте 7-9 недель. Мышей получали из коммерческих источников (см. Таблицу материалов) и содержали в специфических условиях, свободных от патогенов, с 12-часовыми циклами день/ночь.

1. Индукция воспаления глазной поверхности мышей

  1. Выполняют иммуногенную подготовку к иммунизации.
    1. Готовят иммуноген заново в день иммунизации, смешивая овальбумин (OVA, 50 мг/мл) и токсин коклюша (100 мкг/мл) в физиологическом растворе и адъювантном гидроксиде алюминия (40 мг/мл) (см. Таблицу материалов) в пропорции 1:1.
      ВНИМАНИЕ: Выполните вскрытие, восстановление и иммуногенную подготовку токсина коклюша в ламинарной палате безопасности. Носите защитную одежду и избегайте любого контакта с кожей.
    2. Инкубировать смесь иммуногена и адъюванта при комнатной температуре в течение 30 мин и загрузить 100 мкл в шприц объемом 1 мл.
    3. Выполняют внутрибрюшинную инъекцию раствора иммуногена неанестезированной мыши.
      1. Держите мышь мягко за хвост, захватывая сетку клетки. Крепко держите кожу спины и области шеи между большим и указательным пальцами и зафиксируйте хвост и нижние конечности между кольцом и мизинцем против ладони.
      2. Держите неподвижную мышь головой вниз.
      3. Вводят 100 мкл приготовленного раствора иммуногена в правый или левый квадрант нижней части брюшной полости.
  2. Выполните исследование поверхности глаза через 2 недели после иммунизации.
    1. Обезболить мышь изофлураном (2,5%).
    2. Нанесите 5 мкл OVA (50 мг / мл) или физиологического раствора (0,9 % NaCl) на глаз на оба глаза и подождите, пока капля не будет поглощена глазом. Это занимает ~5 минут.
    3. Повторяйте процедуру 1 раз в день в течение 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Местное введение лекарств может быть сделано таким же образом.

2. Коллекция глазных экссудатов

  1. Восстановите глазные экссудаты, образовавшиеся во время фазы вызова, применяя 50 мкл стерильного физиологического раствора к глазу сразу после вызова.
  2. Для получения одноклеточной суспензии обрабатывают собранные глазные выделения рекомбинантной МНазой (2 х 106 гелевых Ед/мл, см. Таблицу материалов), содержащей кофактор кальция (5 мМ) при 37 °С в течение 20 мин.
  3. Центрифуга при 400 х г в течение 7 мин при комнатной температуре.
  4. Выделяют супернатант и измеряют цитокины и хемокины с помощью мультиплексированного ИФА в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный супернатант может быть использован для анализа белка, а гранулы для функциональных анализов, таких как иммунофенотипирование, фагоцитоз, дегрануляция и экспрессия генов.

3. Иссечение тканей глазной поверхности

  1. Рассекните веки и глазной шар, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Усыпляют мышь путем удушьяCO2 и вывиха шейки матки.
    2. Поместите мышь на ровную поверхность.
    3. Продезинфицируйте область орбиты вокруг глаза тампоном, пропитанным 70% этанолом.
    4. Сделайте разрез между ухом и ретроорбитальным синусом и вдоль поверхности над плоской костью вертикально, расширяя разрез горизонтально ниже нижнего века вдоль верхнечелюстной кости и над верхним веком вдоль лобной кости. Это образует разрез вокруг глаза (рисунок 1).
    5. Осторожно удерживайте рассеченную ткань вокруг глаза с помощью изогнутых щипцов и вытяните ткань и глазное яблоко.
    6. Поместите иссеченные органы в стерильный PBS.
    7. Обрежьте избыточную мышечную ткань лица вокруг иссеченных верхних век с помощью скальпеля и под стереомикроскопом.
  2. Соберите конъюнктиву, выполнив следующие действия.
    1. Поместите верхнее веко на сухую чашку Петри под стереомикроскоп.
    2. Используя тонкий пинцет и скальпель, очень аккуратно отшелушите беловато-слизистый слой с внутренней поверхности века.
  3. Затем рассекните роговицу, следуя приведенным ниже шагам.
    1. Поместите глазной шар на новую сухую чашку Петри поверх сухого льда на 3 минуты.
    2. Вынесите чашку Петри на поверхность скамейки в устойчивом положении.
    3. Сделайте небольшой разрез на границе роговицы рядом с лимбом с помощью мелких острых ножниц.
    4. Удлините разрез скальпелем вокруг глазного шара, отделив склеру от роговицы.
    5. Удалите остатки радужной оболочки и хрусталика с обратной стороны роговицы, щедро промыв солевым раствором.

4. Документирование обструкции мейбомиевой железы (МГ)

  1. Для оценки МГ и его отверстий поместите иссеченные веки в вертикальное положение под стереомикроскопом (рисунок 2).
  2. Снимайте изображения с помощью эпиосвещенности белым светом в соответствии со временем экспозиции камеры и настройками ISO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Морфометрический анализ этих изображений обеспечивает надежную количественную оценку размера пробки на выходе из желез. Количественная оценка может быть выполнена путем очерчивания с помощью инструмента палочки глазных пробок и выполнения команды «Анализировать частицы» программного обеспечения Image J (см. Таблицу материалов).

5. Трансиллюминация век (морфология мейбомиевой железы)

  1. Чтобы оценить площадь MG, поместите иссеченные веки в горизонтальное положение и включите подсветку стереомикроскопа, оснащенного инфракрасной камерой (рисунок 3).
  2. Делайте снимки, регулируя время экспозиции в соответствии с ISO камеры (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инфракрасная визуализация этих трансиллюминированных век под стереомикроскопом может помочь измерить форму и размер каждого ацинума. Морфометрический анализ этих изображений обеспечивает достоверную количественную оценку размера и количества МГ. Количественная оценка может быть выполнена путем выделения MG с помощью инструмента палочки и выполнения команды «Analyze Particles» программного обеспечения Image J.

Результаты

Настоящий протокол описывает последовательные шаги для установления мышиной модели воспаления глазной поверхности. Протоколы направлены на то, чтобы показать, как применять терапевтические средства локально, получать глазные экссудаты и иссекать связанные с ними вспомогательные ор...

Обсуждение

Маслянистый секрет мейбомиевых желез имеет большое значение для здорового глаза22. Однако обструкция этих сальных желез агрегированными внеклеточными ловушками нейтрофилов (aggNETs), которые выстраиваются в виде параллельных нитей, расположенных на предплюсневых пластинах ...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Немецким исследовательским фондом (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; ГАК 2040/1-1; МУ 4240/2-1; CRC1181(C03); Проект TRR241(B04), H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, а Также Фондом Volkswagen (грант 97744) для MH.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco
Aluminium HydroxideImject alum Adjuvant7716140 mg/ mL
Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeksCharles River Laboratories 
CalciumCarl rothCN93.11 M
Final Concentration: 5 mM
Curved forcepsFST by Dumont SWITZERLAND5/45 11251-35
Fine sharp scissorFST Stainless steel, Germany15001-08
Laminar safety cabinetHerasafe
Macrophotography CameraCanonEOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter)NikonD5300
MnaseNew England biolabsM0247S2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)BiolegendCLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline)B.Braun
Ovalbumin (OVA)Endofit, Invivogen9006-59-110 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin ThermoFisher Scientific PHZ117450 µg/ 500 µL in saline
Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
PetridishGreiner bio-one628160
ScalpelFeather disposable scalpelNo. 21 Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
StereomicroscopeZaissStemi508
Syringe (corneal/iris washing)BD Microlane27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization)BD Microlane24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm

Ссылки

  1. Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Heyda, K. G. Tear film and ocular surface changes after closure of the meibomian gland orifices in the rabbit. Ophthalmology. 96 (8), 1180-1186 (1989).
  2. Mishima, S., Maurice, D. M. The oily layer of the tear film and evaporation from the corneal surface. Experimental Eye Research. 1, 39-45 (1961).
  3. Gipson, I. K. The ocular surface: The challenge to enable and protect vision: The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48 (10), 4391-4398 (2007).
  4. Hahn, J., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps resolve inflammation by proteolysis of cytokines and chemokines and protection from antiproteases. The FASEB Journal. 33 (1), 1401-1414 (2019).
  5. Leppkes, M., et al. Vascular occlusion by neutrophil extracellular traps in COVID-19. EBioMedicine. 58, 102925 (2020).
  6. Munoz, L. E., et al. Neutrophil extracellular traps initiate gallstone formation. Immunity. 51 (3), 443-450 (2019).
  7. Schapher, M., et al. Neutrophil extracellular traps promote the development and growth of human salivary stones. Cells. 9 (9), 2139 (2020).
  8. Mahajan, A., et al. Frontline science: Aggregated neutrophil extracellular traps prevent inflammation on the neutrophil-rich ocular surface. Journal of Leukocyte Biology. 105 (6), 1087-1098 (2019).
  9. DEWS Definition and Classification Subcommittee. The definition and classification of dry eye disease: Report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye Workshop. The Ocular Surface. 5 (2), 75-92 (2007).
  10. Nichols, K. K., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Executive summary. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1922-1929 (2011).
  11. Mahajan, A., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps occlude Meibomian glands during ocular surface inflammation. The Ocular Surface. 20, 1-12 (2021).
  12. Jester, B. E., Nien, C. J., Winkler, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Volumetric reconstruction of the mouse meibomian gland using high-resolution nonlinear optical imaging. The Anatomical Record. 294 (2), 185-192 (2011).
  13. Nien, C. J., et al. Age-related changes in the meibomian gland. Experimental Eye Research. 89 (6), 1021-1027 (2009).
  14. Parfitt, G. J., Xie, Y., Geyfman, M., Brown, D. J., Jester, J. V. Absence of ductal hyper-keratinization in mouse age-related meibomian gland dysfunction (ARMGD). Aging. 5 (11), 825-834 (2013).
  15. Lambert, R. W., Smith, R. E. Pathogenesis of blepharoconjunctivitis complicating 13-cis-retinoic acid (isotretinoin) therapy in a laboratory model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (10), 1559-1564 (1988).
  16. Jester, J. V., Nicolaides, N., Kiss-Palvolgyi, I., Smith, R. E. Meibomian gland dysfunction. II. The role of keratinization in a rabbit model of MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 30 (5), 936-945 (1989).
  17. Jester, J. V., et al. In vivo biomicroscopy and photography of meibomian glands in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 22 (5), 660-667 (1982).
  18. Lambert, R., Smith, R. E. Hyperkeratinization in a rabbit model of meibomian gland dysfunction. American Journal of Ophthalmology. 105 (6), 703-705 (1988).
  19. Knop, E., Knop, N., Millar, T., Obata, H., Sullivan, D. A. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on anatomy, physiology, and pathophysiology of the meibomian gland. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1938-1978 (2011).
  20. Huang, W., Tourmouzis, K., Perry, H., Honkanen, R. A., Rigas, B. Animal models of dry eye disease: Useful, varied and evolving (Review). Experimental and Therapeutic Medicine. 22 (6), 1394 (2021).
  21. Reyes, N. J., et al. Neutrophils cause obstruction of eyelid sebaceous glands in inflammatory eye disease in mice. Science Translational Medicine. 10 (451), (2018).
  22. Knop, E., Korb, D. R., Blackie, C. A., Knop, N. The lid margin is an underestimated structure for preservation of ocular surface health and development of dry eye disease. Developments in Ophthalmology. 45, 108-122 (2010).
  23. Knop, N., Knop, E. Meibomian glands. Part I: anatomy, embryology and histology of the Meibomian glands. Ophthalmologe. 106 (10), 872-883 (2009).
  24. Nien, C. J., et al. Effects of age and dysfunction on human meibomian glands. Archives of Ophthalmology. 129 (4), 462-469 (2011).
  25. Lio, C. T., Dhanda, S. K., Bose, T. Cluster analysis of dry eye disease models based on immune cell parameters - New insight into therapeutic perspective. Frontiers in Immunology. 11, 1930 (2020).
  26. Nguyen, D. D., Luo, L. J., Lai, J. Y. Thermogels containing sulfated hyaluronan as novel topical therapeutics for treatment of ocular surface inflammation. Materials Today Bio. 13, 100183 (2022).
  27. Lin, P. H., et al. Alleviation of dry eye syndrome with one dose of antioxidant, anti-inflammatory, and mucoadhesive lysine-carbonized nanogels. Acta Biomaterialia. 141, 140-150 (2022).
  28. Yu, D., et al. Loss of beta epithelial sodium channel function in meibomian glands produces pseudohypoaldosteronism 1-like ocular disease in mice. American Journal of Pathology. 188 (1), 95-110 (2018).
  29. Mauris, J., et al. Loss of CD147 results in impaired epithelial cell differentiation and malformation of the meibomian gland. Cell Death & Disease. 6 (4), 1726 (2015).
  30. Ibrahim, O. M., et al. Oxidative stress induced age dependent meibomian gland dysfunction in Cu, Zn-superoxide dismutase-1 (Sod1) knockout mice. PloS One. 9 (7), 99328 (2014).
  31. McMahon, A., Lu, H., Butovich, I. A. A role for ELOVL4 in the mouse meibomian gland and sebocyte cell biology. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (5), 2832-2840 (2014).
  32. Miyake, H., Oda, T., Katsuta, O., Seno, M., Nakamura, M. Meibomian gland dysfunction model in hairless mice fed a special diet with limited lipid content. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (7), 3268-3275 (2016).
  33. Schaumberg, D. A., et al. The international workshop on meibomian gland dysfunction: Report of the subcommittee on the epidemiology of, and associated risk factors for, MGD. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (4), 1994-2005 (2011).
  34. Lee, S. Y., et al. Analysis of tear cytokines and clinical correlations in Sjogren syndrome dry eye patients and non-Sjogren syndrome dry eye patients. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 247-253 (2013).
  35. Nakae, S., et al. Antigen-specific T cell sensitization is impaired in IL-17-deficient mice, causing suppression of allergic cellular and humoral responses. Immunity. 17 (3), 375-387 (2002).
  36. von Vietinghoff, S., Ley, K. IL-17A controls IL-17F production and maintains blood neutrophil counts in mice. Journal of Immunology. 183 (2), 865-873 (2009).
  37. Langrish, C. L., et al. IL-23 drives a pathogenic T cell population that induces autoimmune inflammation. Journal of Experimental Medicine. 201 (2), 233-240 (2005).
  38. Chen, Y., et al. Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis. Journal of Clinical Investigation. 116 (5), 1317-1326 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены