אינדוקציה של דלקת פני השטח של העין ואיסוף של רקמות מעורבות

Summary

דלקת במשטח העין פוגעת ברקמות פני השטח של העין ופוגעת בתפקודים חיוניים של העין. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה להשראת דלקת עיניים ולאיסוף רקמות פגועות במודל עכברי של תפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD).

Abstract

מחלות פני השטח של העין כוללות מגוון של הפרעות המפריעות לתפקודים ולמבנים של הקרנית, הלחמית ורשת בלוטת פני השטח של העין הקשורה. בלוטות Meibomian (MG) מפרישות שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק המימי של סרט הדמעות. נויטרופילים ומלכודות דנ"א חוץ-תאיות מאכלסים את MG ואת משטח העין במודל עכברי של מחלת עיניים אלרגית. מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים מצטברים (aggNETs) מנסחות מטריצה דמוית רשת המורכבת מכרומטין חוץ-תאי החופה את שקעי MG וממתנת תפקוד לקוי של MG. כאן, שיטה לגרימת דלקת פני השטח של העין ותפקוד לקוי של MG מוצגת. ההליכים לאיסוף איברים הקשורים למשטח העין, כגון הקרנית, הלחמית והעפעפיים, מתוארים בפירוט. באמצעות טכניקות מבוססות לעיבוד כל איבר, מוצגות גם התכונות המורפולוגיות וההיסטופתולוגיות העיקריות של תפקוד לקוי של MG. הפרשות עיניים מציעות את ההזדמנות להעריך את המצב הדלקתי של משטח העין. נהלים אלה מאפשרים לחקור התערבויות אנטי דלקתיות אקטואליות ומערכתיות ברמה הפרה-קלינית.

Introduction

כל הרף עין מחדש את שכבת הדמעות החלקה המפוזרת על הקרנית. אפיתליה של פני השטח של העין מקלה על ההתפלגות והכיוון הנכון של סרט הדמעות על משטח העין. מוצינים מסופקים על ידי תאי אפיתל הקרנית והלחמית כדי לסייע במיקום החלק המימי של סרט הדמעות המגיע מבלוטות הדמעות על פני העיניים. לבסוף, MG מפרישה שומנים היוצרים שכבת כיסוי המונעת אידוי של החלק מימי של סרט הדמעות ^1,2,3. באופן זה, הפונקציות המתואמות של כל איברי העין מגינות על משטח העין מפני פלישה לפתוגנים או פציעה ותומכות בראייה צלולה ללא כל כאב או אי נוחות.

במשטח עיניים בריא, הפרשות העיניים הזורמות או ריאה העין מסלקות אבק, תאי אפיתל מתים, חיידקים, ריר ותאי מערכת החיסון. מלכודות חוץ-תאיות של נויטרופילים מצטברים (aggNETs) מנסחות מטריצה דמוית רשת המורכבת מכרומטין חוץ-תאי ומשלבות רכיבים אלה בראום העין. AggNETs פותרים דלקת על ידי פירוק פרוטאוליטי של ציטוקינים מעודדי דלקת וכימוקינים⁴. עם זאת, כאשר הם הופכים לא מתפקדים, aggNETs אלה aggNETs מניעים את הפתוגנזה של מחלות כגון חסימות כלי דם ב- COVID-19⁵, אבני מרה⁶, ו sialolithiasis⁷. באופן דומה, aggNETs על משטח העין ממלאים תפקיד מגן ותורמים לפתרון דלקת של משטח⁸ החשוף מאוד. היווצרות מוגזמת או היעדר aggNETs במשטח העין עלולים לפגוע ביציבות סרט הדמעות ו/או לגרום לפצעים בקרנית, דלקת הלחמית ומחלת העין היבשה. לדוגמה, חסימת MG היא גורם מוביל למחלת העין היבשה⁹. AggNETs ידועים גם לחבר את זרימת הפרשת השומנים מן הצינורות של MG ולגרום לתפקוד לקוי של בלוטת Meibomian (MGD). הגודש של MG orifices על ידי aggNETs גורם למחסור בנוזל שומני העוטף את משטח העין ונוזל מבוקבק מדרדר, וכתוצאה מכך תפקוד לקוי של בלוטת הבלוטה ונזק אקסינארי. תפקוד לקוי זה עלול לגרום לאידוי סרט מדמיע, פיברוזיס של שולי העפעפיים, דלקת עיניים ונזק מזיק ל- MG^10,11.

מספר מודלים של בעלי חיים פותחו במהלך השנים כדי לחקות את התהליך הפתולוגי של MGD בבני אדם. לדוגמה, C57BL/6 עכברים בני שנה סייעו לחקור השפעות הקשורות לגיל על מחלות עיניים יבשות (DED) ו- MGD, המשקפות את הפתולוגיה של מחלות עיניים בחולים בני 50 ומעלה^12,13,14. יתר על כן, ארנבות הן מודלים מתאימים לחקר ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות. לכן, גרימת MGD בארנבות דווחה על ידי מתן מקומי של אפינפרין או הכנסה מערכתית של 13-cis-retinoic חומצה (isotretinoin)15,16,17,18,19.

אף על פי שמודלים אלה של בעלי חיים היו מספיקים לקביעת הגורמים השונים שתרמו לפתופיזיולוגיה של MGD, הם היו מוגבלים בשימוש בהם. לדוגמה, מודל מורין של MGD תלוי גיל היה אידיאלי לפענוח אלמנטים במבוגרים בלבד, ולכן, ארנבות נראו כמודל החי המתאים ביותר לחקר מחלות פני השטח של העין, מכיוון שהן מאפשרות לחקור מנגנונים פתופיזיולוגיים מרובים. עם זאת, בשל היעדר כלים אנליטיים מקיפים לאיתור חלבונים על פני העין ומכיוון שחלקים רבים בגנום הארנב אינם מוזכרים, הם מוגבלים לחקירות^20,21.

בנוסף, מודלים אלה של בעלי חיים המשמשים לחקור את הפתוגנזה של מחלת העין היבשה לא סיפקו פרטים נאותים כדי לנתח את הזרוע החיסונית של ההפרעה הגורמת דלקת של פני העין. בהתאם לכך, מודל המורין של MGD שפותח על ידי Reyes et al. הראה קשר בין מחלת עיניים אלרגית בעכברים לבין MGD בבני אדם והדגיש את האטיולוגיה החיסונית האחראית ל-MGD²¹ חסימתי. מודל זה מקשר בין מחלת עיניים אלרגית לתגובת TH17 המגייסת נויטרופילים ללחמית ולעפעף, וגורמת ל-MGD ולדלקת עיניים כרונית²¹. האינדוקציה של MGD ודלקת עיניים במודל מורין זה היא כלי רב ערך לחקר אירועים במעלה הזרם במהלך התפתחות של דלקת מקומית המונעת על ידי תגובה חיסונית מתמשכת²¹. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את דלקת פני השטח של העין המלווה ב- MGD חסימתי. בשיטה זו, עכברים מחוסנים, ולאחר שבועיים, מאותגרים על פני השטח של העין עם האימונוגן במשך 7 ימים. יתר על כן, מתוארים הצעדים לבידוד הפרשת העיניים ואיברי העין הקשורים אליהם במהלך דלקת חריפה וכריתת הקרנית, הלחמית והעפעפיים.

Protocol

כל ההליכים המערבים בעלי חיים נערכו על פי ההנחיות המוסדיות לרווחת בעלי חיים ואושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת פרידריך-אלכסנדר-ארלנגן-נירנברג (FAU) (מספר היתר: 55.2.2-2532-2-1217). נקבות C57Bl/6 עכברים, בגילאי 7-9 שבועות שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים) והוחזקו בתנאים ספציפיים נטולי פתוגנים עם מחזורים של 12 שעות ביום/לילה.

1. אינדוקציה של דלקת משטח העין murine

1. בצע הכנה אימונוגן לחיסון.
   1. הכינו את האימונוגן טרי ביום החיסון, ערבבו אובאלבומין (OVA, 50 מ"ג/מ"ל) ורעלן שעלת (100 מיקרוגרם/מ"ל) במי מלח ואת האלומיניום האדג'ובנטי הידרוקסיד (40 מ"ג/מ"ל) (ראו טבלת חומרים) ביחס של 1:1.
      אזהרה: בצע את הפתיחה, שחזור והכנת האימונוגן של רעלן שעלת בארון בטיחות למינרי. יש ללבוש ביגוד מגן ולהימנע מכל מגע עם העור.
   2. לדגום את תערובת האימונוגן והאדג'ובנט בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ולהעמיס 100 μL לתוך מזרק 1 מ"ל.
   3. בצע הזרקה תוך צפקית של פתרון האימונוגן בעכבר לא מורדם.
      1. החזיקו את העכבר ברכות ליד הזנב תוך כדי אחיזה ברשת הכלובים. החזיקו בחוזקה את עור הגב ואת אזור הצוואר בין האגודל לאצבע המורה וקיבעו את הזנב והגפיים התחתונות בין הטבעת לאצבע הקטנה כנגד כף היד.
      2. השאר את העכבר הקבוע עם ראשו כלפי מטה.
      3. הזרקת 100 μL של תמיסת האימונוגן המוכנה ברביע הימני או השמאלי של חלל הבטן התחתונה.
2. יש לבצע את אתגר פני השטח של העיניים שבועיים לאחר החיסון.
   1. הרדמת העכבר עם איזופלורן (2.5%).
   2. יש למרוח 5 μL של OVA (50 מ"ג/מ"ל) או מי מלח (0.9% NaCl) על שתי העיניים ולהמתין עד שהטיפה תיספג בעין. זה לוקח ~ 5 דקות.
   3. חזור על ההליך 1 פעמים ביום במשך 7 ימים.
      הערה: ניהול מקומי של תרופות יכול להיעשות באותו אופן.

2. אוסף של הפרשת עיניים

1. שחזר את ההפרשות העיניות שנוצרו במהלך שלב האתגר על ידי מריחת 50 μL של מלח סטרילי על העין מיד לאחר האתגר.
2. כדי לקבל תרחיף חד-תאי, טפל בהפרשות העיניים שנאספו באמצעות MNase רקומביננטי (2 x 10⁶ ג'ל U/mL, ראה טבלת חומרים) המכיל את סידן קופקטור (5 mM) ב 37 °C למשך 20 דקות.
3. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 7 דקות בטמפרטורת החדר.
4. לבודד את הסופר-נטנט ולמדוד את הציטוקינים והכימוקינים באמצעות ELISA מרובב על פי הוראות היצרן (ראו טבלת חומרים).
   הערה: הסופרנטנט המתקבל יכול לשמש לניתוח חלבונים ולגלולה לבדיקות פונקציונליות כגון אימונופנוטיפינג, פאגוציטוזה, דה-גרנולציה וביטוי גנים.

3. כריתה של רקמות פני השטח של העין

1. נתחו את העפעפיים ואת כדור העין בהתאם לשלבים הבאים.
   1. המתת העכבר על ידי חנק CO₂ ונקע צוואר הרחם.
   2. הנח את העכבר על משטח אחיד.
   3. לחטא את האזור האורביטלי סביב העין עם ספוגית ספוגה עם 70% אתנול.
   4. בצע חתך בין האוזן לסינוס הרטרו-אורביטלי ולאורך המשטח מעל עצם הקשקש אנכית, תוך הרחבת החתך אופקית מתחת לעפעף התחתון לאורך העצם המקסילרית ומעל העפעף העליון לאורך העצם הקדמית. זה יוצר חתך סביב העין (איור 1).
   5. החזיקו בזהירות את הרקמה המנותקת סביב העין באמצעות מלקחיים מעוקלים ומשכו את הרקמה ואת גלגל העין החוצה.
   6. מניחים את האיברים שנכרתו ב- PBS סטרילי.
   7. יש לחתוך את רקמת שריר הפנים העודפת סביב העפעפיים העליונים שנכרתו באמצעות אזמל ומתחת לסטריאומיקרוסקופ.
2. אסוף את הלחמית לפי השלבים הבאים.
   1. הניחו את העפעף העליון על צלחת פטרי יבשה מתחת לסטריאומיקרוסקופ.
   2. בעזרת פינצטה עדינה ואזמל, מקלפים בעדינות רבה את השכבה הרירית-לבנה מתוך המשטח הפנימי של העפעף.
3. לאחר מכן, לנתח את הקרנית בעקבות השלבים הבאים.
   1. הניחו את גלובוס העיניים על צלחת פטרי יבשה חדשה על גבי קרח יבש למשך 3 דקות.
   2. קח את צלחת פטרי על משטח הספסל במצב יציב.
   3. בצע חתך קטן בגבול הקרנית ליד הלימבוס באמצעות מספריים חדים עדינים.
   4. מאריכים את החתך עם האזמל סביב כדור הארץ, ומפרידים בין הסקלרה לקרנית.
   5. הסירו את שאריות הקשתית והעדשה מהחלק האחורי של הקרנית על ידי שטיפה נדיבה בתמיסת מלח.

4. תיעוד של חסימת בלוטת Meibomian (MG)

1. כדי להעריך את ה-MG ואת הפתחים שלו, הניחו את העפעפיים הכרותים במצב זקוף מתחת לסטריאומיקרוסקופ (איור 2).
2. צלם תמונות עם תאורה אפי-תאורה של אור לבן בהתאם לזמן החשיפה של המצלמה ולהגדרות ה-ISO.
   הערה: ניתוח מורפומטרי של תמונות אלה מספק כימות אמין של גודל התקע בשקע הבלוטות. ניתן לבצע את הכימות על ידי התוויית כלי השרביט של תקעי העין וביצוע הפקודה "נתח חלקיקים" של תוכנת Image J (ראו טבלת חומרים).

5. טרנסילומינציה של עפעפיים (מורפולוגיה של בלוטת Meibomian)

1. כדי להעריך את אזור ה-MG, מקמו את העפעפיים הכרותים במצב אופקי והפעילו את התאורה האחורית של הסטריאומיקרוסקופ המצויד במצלמת אינפרה-אדום (איור 3).
2. צלם תמונות על-ידי התאמת זמן החשיפה בהתאם ל-ISO של המצלמה (ראו טבלת חומרים).
   הערה: הדמיית אינפרא-אדום של עפעפיים טרנס-מוארים אלה מתחת לסטריאומיקרוסקופ יכולה לסייע במדידת הצורה והגודל של כל אצ'יני. ניתוח מורפומטרי של תמונות אלה מספק כימות אמין של גודל ומספר MG. ניתן לבצע את הכימות על ידי התוויית ה- MG עם כלי השרביט וביצוע הפקודה "נתח חלקיקים" של תוכנת Image J.

תוצאות

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השלבים הרציפים לביסוס מודל מורין של דלקת פני השטח של העין. מטרת הפרוטוקולים היא להראות כיצד ליישם טיפולים באופן מקומי, להשיג הפרשת עיניים ולהוציא איברים נלווים כגון עפעפיים בריאים ודלקתיים (איור 2), הקרנית והלחמית. יש לשים לב כאשר העפעפיים העליונים...

Discussion

ההפרשה השומנית של בלוטות Meibomian היא בעלת חשיבות רבה לעין בריאה²². עם זאת, החסימה של בלוטות החלב הללו על ידי מלכודות נויטרופיליות חוץ-תאיות מצטברות (aggNETs) המיישרות קו כגדילים מקבילים הממוקמים על הלוחות הטרסליים של שני העפעפיים יכולה לשבש את סרט הדמעות²³. הפרעה זו גורמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco
Aluminium Hydroxide	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks	Charles River Laboratories
Calcium	Carl roth	CN93.1	1 M Final Concentration: 5 mM
Curved forceps	FST by Dumont SWITZERLAND	5/45 11251-35
Fine sharp scissor	FST Stainless steel, Germany	15001-08
Laminar safety cabinet	Herasafe
Macrophotography Camera	Canon	EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter)	Nikon	D5300
Mnase	New England biolabs	M0247S	2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)	Biolegend	CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline)	B.Braun
Ovalbumin (OVA)	Endofit, Invivogen	9006-59-1	10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin	ThermoFisher Scientific	PHZ1174	50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish	Greiner bio-one	628160
Scalpel	Feather disposable scalpel	No. 21	Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope	Zeiss	Stemi508
Syringe (corneal/iris washing)	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization)	BD Microlane	24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm