Induction d’une inflammation de la surface oculaire et collecte de tissus impliqués

Résumé

L’inflammation de la surface oculaire endommage les tissus de la surface oculaire et compromet les fonctions vitales de l’œil. Le présent protocole décrit une méthode pour induire une inflammation oculaire et recueillir des tissus compromis dans un modèle murin de dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD).

Résumé

Les maladies de la surface oculaire comprennent une gamme de troubles qui perturbent les fonctions et les structures de la cornée, de la conjonctive et du réseau de glandes de surface oculaire associé. Les glandes de Meibomius (MG) sécrètent des lipides qui créent une couche de couverture qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal. Les neutrophiles et les pièges à ADN extracellulaire peuplent la MG et la surface oculaire dans un modèle murin de maladie oculaire allergique. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) forment une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire qui obstrue les sorties de MG et conditionne le dysfonctionnement de MG. Ici, une méthode pour induire une inflammation de la surface oculaire et un dysfonctionnement MG est présentée. Les procédures de collecte des organes liés à la surface oculaire, tels que la cornée, la conjonctive et les paupières, sont décrites en détail. En utilisant des techniques établies pour le traitement de chaque organe, les principales caractéristiques morphologiques et histopathologiques du dysfonctionnement MG sont également montrées. Les exsudats oculaires offrent la possibilité d’évaluer l’état inflammatoire de la surface oculaire. Ces procédures permettent d’étudier des interventions anti-inflammatoires topiques et systémiques au niveau préclinique.

Introduction

Chaque clignement d’œil reconstitue le film lacrymal lisse dispersé sur la cornée. L’épithélium de la surface oculaire facilite la distribution et l’orientation correcte du film lacrymal sur la surface oculaire. Les mucines sont fournies par la cornée et les cellules épithéliales conjonctives pour aider à positionner la partie aqueuse du film lacrymal provenant des glandes lacrymales à la surface des yeux. Enfin, le MG sécrète des lipides qui créent une couche de revêtement qui empêche l’évaporation de la partie aqueuse du film lacrymal ^1,2,3. De cette façon, les fonctions coordonnées de tous les organes oculaires protègent la surface oculaire contre les agents pathogènes envahissants ou les blessures et soutiennent une vision cristalline sans douleur ni inconfort.

Dans une surface oculaire saine, la décharge oculaire ou le rheum oculaire balaye la poussière, les cellules épithéliales mortes, les bactéries, le mucus et les cellules immunitaires. Les pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) formulent une matrice en forme de maille composée de chromatine extracellulaire et incorporent ces composants dans le rhume oculaire. Les TNEG résolvent l’inflammation par la dégradation protéolytique des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines⁴. Cependant, lorsqu’elles deviennent dysfonctionnelles, ces aggNET aberrantes entraînent la pathogenèse de maladies telles que les occlusions vasculaires dans COVID-19⁵, les calculs biliaires⁶ et la sialolithiase⁷. De même, les aggNET sur la surface oculaire jouent un rôle protecteur et contribuent à résoudre l’inflammation de la surface fortement exposée⁸. Une formation exagérée ou l’absence d’aggNET dans la surface oculaire peut altérer la stabilité du film lacrymal et / ou causer des plaies cornéennes, une conjonctivite cicatrisante et une sécheresse oculaire. Par exemple, l’obstruction de la MG est l’une des principales causes de sécheresse oculaire⁹. Les AggNET sont également connus pour boucher le flux de sécrétion lipidique des canaux de MG et provoquer un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD). La congestion des orifices MG par les AGGNET provoque un manque de liquide gras enveloppant la surface oculaire et un liquide embouteillé rétrograde, entraînant un dysfonctionnement de la fonction glandulaire et des lésions acineuses. Ce dysfonctionnement peut entraîner l’évaporation du film lacrymal, la fibrose des marges sur les paupières, l’inflammation des yeux et des dommages néfastes au MG^10,11.

Plusieurs modèles animaux ont été développés au fil des ans pour imiter le processus pathologique de MGD chez l’homme. Par exemple, des souris C57BL/6 âgées de 1 an ont aidé à étudier les effets liés à l’âge sur la sécheresse oculaire (DED) et la MGD, reflétant la pathologie de la maladie oculaire chez les patients âgés de 50 ans et plus^12,13,14. En outre, les lapins sont des modèles appropriés pour étudier les effets des interventions pharmacologiques. Par conséquent, l’induction de MGD chez le lapin a été rapportée soit par l’administration topique d’épinéphrine, soit par l’introduction systémique d’acide 13-cis-rétinoïque (isotrétinoïne)15,16,17,18,19.

Bien que ces modèles animaux aient été adéquats pour déterminer les différents facteurs contribuant à la physiopathologie de la MGD, leur utilisation a été limitée. Par exemple, le modèle murin de MGD liée à l’âge était idéal pour déchiffrer des éléments chez les personnes âgées seulement, et par conséquent, les lapins semblaient être le modèle animal le plus approprié pour étudier les maladies de la surface oculaire, car ils permettent l’étude de multiples mécanismes physiopathologiques. Cependant, en raison du manque d’outils analytiques complets pour détecter les protéines à la surface oculaire et parce que de nombreuses parties du génome du lapin ne sont pas annotées, elles sont limitées pour les recherches^20,21.

De plus, ces modèles animaux utilisés pour étudier la pathogenèse de la sécheresse oculaire n’ont pas fourni suffisamment de détails pour analyser le bras immunologique de la maladie qui provoque l’inflammation de la surface oculaire. En conséquence, le modèle murin de MGD développé par Reyes et al. a montré une association entre la maladie oculaire allergique chez la souris et la MGD chez l’homme et a mis en évidence l’étiologie immunitaire responsable de MGD²¹ obstructif. Ce modèle associe la maladie oculaire allergique à une réponse TH17 qui recrute des neutrophiles à la conjonctive et à la paupière, provoquant MGD et inflammation oculaire chronique²¹. L’induction de MGD et d’inflammation oculaire dans ce modèle murin est un outil précieux pour étudier les événements en amont lors du développement d’une inflammation locale entraînée par une réponse immunitaire continue²¹. Le protocole actuel décrit l’inflammation de la surface oculaire accompagnée d’une MGD obstructive. Dans cette méthode, les souris sont immunisées et, après 2 semaines, défiées sur la surface oculaire avec l’immunogène pendant 7 jours. En outre, les étapes pour isoler l’exsudat oculaire et les organes oculaires associés lors de l’inflammation aiguë et de la dissection de la cornée, de la conjonctive et des paupières sont décrites.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été menées conformément aux directives institutionnelles sur le bien-être animal et approuvées par la commission du bien-être animal de l’Université Friedrich-Alexander d’Erlangen-Nuremberg (FAU) (numéro de permis: 55.2.2-2532-2-1217). Des souris C57Bl/6 femelles, âgées de 7 à 9 semaines, ont été utilisées pour la présente étude. Les souris ont été obtenues de sources commerciales (voir le tableau des matériaux) et maintenues dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques avec des cycles jour/nuit de 12 h.

1. Induction de l’inflammation de la surface oculaire murine

1. Effectuer la préparation immunogène pour l’immunisation.
   1. Préparer l’immunogène fraîchement le jour de l’immunisation, en mélangeant l’ovalbumine (OVU, 50 mg/mL) et la toxine de la coqueluche (100 μg/mL) dans une solution saline et l’adjuvant hydroxyde d’aluminium (40 mg/mL) (voir le tableau des matières) dans une proportion de 1:1.
      ATTENTION : Effectuer l’ouverture, la reconstitution et la préparation immunogénique de la toxine coqueluche dans une enceinte de sécurité laminaire. Portez des vêtements de protection et évitez tout contact avec la peau.
   2. Incuber l’immunogène et le mélange adjuvant à température ambiante pendant 30 minutes et charger 100 μL dans une seringue de 1 mL.
   3. Effectuer une injection intrapéritonéale de la solution immunogène chez une souris non anesthésiée.
      1. Tenez doucement la souris par la queue tout en saisissant la grille de la cage. Tenez fermement la peau du dos et de la région du cou entre le pouce et l’index et fixez la queue et les membres inférieurs entre l’anneau et le petit doigt contre la paume de la main.
      2. Gardez la souris fixe avec sa tête vers le bas.
      3. Injecter 100 μL de la solution d’immunogène préparée dans le quadrant droit ou gauche de la cavité abdominale inférieure.
2. Effectuer une provocation de la surface oculaire 2 semaines après la vaccination.
   1. Anesthésier la souris avec de l’isoflurane (2,5%).
   2. Appliquer 5 μL d’OVA (50 mg/mL) ou de solution saline (0,9 % NaCl) par œil sur les deux yeux et attendre que la goutte soit absorbée par l’œil. Cela prend ~5 min.
   3. Répétez la procédure 1x par jour pendant 7 jours.
      NOTE: L’administration topique de médicaments peut se faire de la même manière.

2. Collecte d’exsudats oculaires

1. Récupérer les exsudats oculaires formés pendant la phase de provocation en appliquant 50 μL de solution saline stérile sur l’œil immédiatement après la provocation.
2. Pour obtenir une suspension unicellulaire, traiter la décharge oculaire recueillie avec de la MNase recombinante (2 x 10⁶ gel U/mL, voir tableau des matières) contenant le cofacteur calcium (5 mM) à 37 °C pendant 20 min.
3. Centrifuger à 400 x g pendant 7 min à température ambiante.
4. Isoler le surnageant et mesurer les cytokines et les chimiokines à l’aide d’ELISA multiplexé conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Le surnageant obtenu peut être utilisé pour l’analyse des protéines et la pastille pour des tests fonctionnels tels que l’immunophénotypage, la phagocytose, la dégranulation et l’expression génique.

3. Excision des tissus de surface oculaire

1. Disséquez les paupières et le globe oculaire en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO₂ et luxation cervicale.
   2. Placez la souris sur une surface plane.
   3. Désinfectez la zone orbitaire autour de l’œil avec un écouvillon imprégné d’éthanol à 70%.
   4. Faites une incision entre l’oreille et le sinus rétro-orbitaire et le long de la surface au-dessus de l’os pavimenteux verticalement, en étendant l’incision horizontalement sous la paupière inférieure le long de l’os maxillaire et au-dessus de la paupière supérieure le long de l’os frontal. Cela forme une incision autour de l’œil (Figure 1).
   5. Tenez soigneusement le tissu disséqué autour de l’œil à l’aide d’une pince incurvée et retirez le tissu et le globe oculaire.
   6. Placer les organes excisés dans du PBS stérile.
   7. Couper l’excès de tissu musculaire facial autour des paupières supérieures excisées à l’aide d’un scalpel et sous le stéréomicroscope.
2. Collectez la conjonctive en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Placez la paupière supérieure sur une boîte de Petri sèche sous le stéréomicroscope.
   2. À l’aide d’une fine pince à épiler et d’un scalpel, décollez très doucement la couche blanchâtre-muqueuse de la surface interne de la paupière.
3. Ensuite, disséquez la cornée en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Placez le globe oculaire sur une nouvelle boîte de Petri sèche sur de la glace sèche pendant 3 min.
   2. Prenez la boîte de Petri sur la surface du banc dans une position stable.
   3. Faites une petite incision au bord de la cornée à côté du limbe à l’aide de fins ciseaux tranchants.
   4. Prolongez l’incision avec le scalpel autour du globe oculaire, en séparant la sclérotique de la cornée.
   5. Enlevez les restes de l’iris et du cristallin de l’arrière de la cornée en rinçant généreusement avec une solution saline.

4. Documentation de l’obstruction de la glande de Meibomius (MG)

1. Pour évaluer le MG et ses orifices, placer les paupières excisées en position verticale sous le stéréomicroscope (Figure 2).
2. Capturez des images avec un éclairage épi à lumière blanche en fonction du temps d’exposition de l’appareil photo et des paramètres ISO.
   NOTE: L’analyse morphométrique de ces images fournit une quantification fiable de la taille du bouchon à la sortie des glandes. La quantification peut être effectuée en décrivant avec l’outil de baguette les bouchons oculaires et en exécutant la commande « Analyser les particules » du logiciel Image J (voir Tableau des matériaux).

5. Transillumination des paupières (morphologie de la glande de Meibomius)

1. Pour évaluer la zone MG, placez les paupières excisées en position horizontale et allumez le rétroéclairage du stéréomicroscope équipé d’une caméra infrarouge (Figure 3).
2. Capturez des images en ajustant le temps d’exposition en fonction de l’ISO de l’appareil photo (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: L’imagerie infrarouge de ces paupières transilluminatées au stéréomicroscope peut aider à mesurer la forme et la taille de chaque acini. L’analyse morphométrique de ces images fournit une quantification fiable de la taille et du nombre de MG. La quantification peut être effectuée en décrivant le MG avec l’outil baguette et en exécutant la commande « Analyser les particules » du logiciel Image J.

Résultats

Le présent protocole décrit les étapes séquentielles pour établir un modèle murin d’inflammation de la surface oculaire. Les protocoles visent à montrer comment appliquer localement des traitements, obtenir des exsudats oculaires et exciser les organes accessoires associés tels que les paupières saines et enflammées (Figure 2), la cornée et la conjonctive. Une attention particulière doit être accordée lorsque les paupières supérieures sont disséquées pour l’isolement de...

Discussion

La sécrétion huileuse des glandes de Meibomius est d’une grande importance pour un œil sain²². Cependant, l’obstruction de ces glandes sébacées par des pièges extracellulaires agrégés de neutrophiles (aggNETs) qui s’alignent sous forme de brins parallèles situés sur les plaques tarsiennes des deux paupières peut perturber le film^{lacrymal 23}. Cette perturbation entraîne un dysfonctionnement de la glande de Meibomius (MGD)¹ et une év...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco
Aluminium Hydroxide	Imject alum Adjuvant	77161	40 mg/ mL Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeks	Charles River Laboratories
Calcium	Carl roth	CN93.1	1 M Final Concentration: 5 mM
Curved forceps	FST by Dumont SWITZERLAND	5/45 11251-35
Fine sharp scissor	FST Stainless steel, Germany	15001-08
Laminar safety cabinet	Herasafe
Macrophotography Camera	Canon	EOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter)	Nikon	D5300
Mnase	New England biolabs	M0247S	2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)	Biolegend	CLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline)	B.Braun
Ovalbumin (OVA)	Endofit, Invivogen	9006-59-1	10 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin	ThermoFisher Scientific	PHZ1174	50 µg/ 500 µL in saline Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
Petridish	Greiner bio-one	628160
Scalpel	Feather disposable scalpel	No. 21	Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
Stereomicroscope	Zaiss	Stemi508
Syringe (corneal/iris washing)	BD Microlane	27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization)	BD Microlane	24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm