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Resumo

A inflamação da superfície ocular prejudica os tecidos da superfície ocular e compromete as funções vitais do olho. O presente protocolo descreve um método para induzir inflamação ocular e coletar tecidos comprometidos em um modelo de camundongo de disfunção da glândula de Meibomian (MGD).

Resumo

As doenças da superfície ocular incluem uma série de distúrbios que perturbam as funções e estruturas da córnea, da conjuntiva e da rede de glândulas da superfície ocular associada. As glândulas meibomianas (MG) secretam lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal. Neutrófilos e armadilhas de DNA extracelular povoam MG e a superfície ocular em um modelo de rato de doença ocular alérgica. As armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular que oclui as saídas de MG e condiciona a disfunção de MG. Aqui, um método para induzir inflamação da superfície ocular e disfunção da MG é apresentado. Os procedimentos para a coleta de órgãos relacionados à superfície ocular, como córnea, conjuntiva e pálpebras, são descritos em detalhes. Usando técnicas estabelecidas para o processamento de cada órgão, as principais características morfológicas e histopatológicas da disfunção da MG também são mostradas. Os exsudatos oculares oferecem a oportunidade de avaliar o estado inflamatório da superfície ocular. Esses procedimentos possibilitam a investigação de intervenções anti-inflamatórias tópicas e sistêmicas em nível pré-clínico.

Introdução

Cada piscar de olhos reabastece o filme lacrimal liso disperso sobre a córnea. Os epitélios da superfície ocular facilitam a distribuição e a orientação correta do filme lacrimal na superfície ocular. As mucinas são fornecidas pelas células epiteliais da córnea e da conjuntiva para ajudar a posicionar a parte aquosa do filme lacrimal proveniente das glândulas lacrimais na superfície dos olhos. Finalmente, a MG secreta lipídios que criam uma camada de cobertura que impede a evaporação da parte aquosa do filme lacrimal 1,2,3. Desta forma, as funções coordenadas de todos os órgãos oculares protegem a superfície ocular de patógenos invasores ou lesões e suportam a visão cristalina sem qualquer dor ou desconforto.

Em uma superfície ocular saudável, a descarga ocular que flui ou o reum ocular varre a poeira, as células epiteliais mortas, as bactérias, o muco e as células imunes. Armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) formulam uma matriz em forma de malha composta de cromatina extracelular e incorporam esses componentes no reum ocular. Os AggNETs resolvem a inflamação pela degradação proteolítica de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas4. No entanto, quando se tornam disfuncionais, esses aggNETs aberrantes impulsionam a patogênese de doenças como oclusões vasculares na COVID-195, cálculos biliares6 e sialolitíase7. Da mesma forma, os aggNETs na superfície ocular desempenham um papel protetor e contribuem para a resolução da inflamação da superfície altamente exposta8. Uma formação exagerada ou a falta de aggNETs na superfície ocular pode prejudicar a estabilidade do filme lacrimal e/ou causar feridas na córnea, conjuntivite cicatrizante e doença do olho seco. Por exemplo, a obstrução da MG é uma das principais causas de doença do olho seco9. AggNETs também são conhecidos por obstruir o fluxo de secreção lipídica dos ductos de MG e causar disfunção da glândula meibomiana (MGD). A congestão dos orifícios de MG por aggNETs causa falta de fluido gorduroso envolvendo a superfície ocular e fluido engarrafado retrógrado, resultando em disfunção da função da glândula e danos acinares. Essa disfunção pode resultar em evaporação do filme lacrimal, fibrose das margens das pálpebras, inflamação ocular e dano prejudicial à MG10,11.

Vários modelos animais foram desenvolvidos ao longo dos anos para imitar o processo patológico da MGD em humanos. Por exemplo, camundongos C57BL/6 com 1 ano de idade ajudaram a estudar os efeitos relacionados à idade na doença do olho seco (DED) e MGD, refletindo a patologia da doença ocular em pacientes com 50 anos ou mais12,13,14. Além disso, os coelhos são modelos apropriados para investigar os efeitos das intervenções farmacológicas. Portanto, a indução de MGD em coelhos tem sido relatada pela administração tópica de epinefrina ou pela introdução sistêmica de ácido 13-cis-retinóico (isotretinoína)15,16,17,18,19.

Embora esses modelos animais fossem adequados para determinar os diferentes fatores que contribuem para a fisiopatologia da MGD, eles foram restritos em sua utilização. Por exemplo, o modelo murino de MGD relacionada à idade foi ideal para decifrar elementos apenas em adultos mais velhos e, portanto, os coelhos pareceram ser o modelo animal mais adequado para estudar doenças da superfície ocular, pois permitem a investigação de múltiplos mecanismos fisiopatológicos. No entanto, devido à falta de ferramentas analíticas abrangentes para detectar proteínas na superfície ocular e porque muitas partes do genoma do coelho não são anotadas, elas são limitadas para investigações20,21.

Além disso, esses modelos animais utilizados para investigar a patogênese da doença do olho seco não forneceram detalhes adequados para analisar o braço imunológico do distúrbio que instiga a inflamação da superfície ocular. Nesse sentido, o modelo murino de MGD desenvolvido por Reyes et al. mostrou associação entre doença ocular alérgica em camundongos e MGD em humanos e destacou a etiologia imunológica responsável pela MGD obstrutiva21. Esse modelo associa a doença alérgica ocular a uma resposta TH17 que recruta neutrófilos para a conjuntiva e pálpebra, causando MGD e inflamação ocular crônica21. A indução de MGD e inflamação ocular neste modelo murino é uma ferramenta valiosa para investigar eventos a montante durante o desenvolvimento de inflamação local impulsionada por uma resposta imune contínua21. O protocolo atual descreve a inflamação da superfície ocular acompanhada de MGD obstrutiva. Neste método, os ratos são imunizados e, após 2 semanas, desafiados na superfície ocular com o imunógeno por 7 dias. Além disso, os passos para isolar o exsudato ocular e os órgãos oculares associados durante a inflamação aguda e a dissecção da córnea, conjuntiva e pálpebras são descritos.

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Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais sobre bem-estar animal e aprovados pela comissão de bem-estar animal da Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nuremberg (FAU) (número de permissão: 55.2.2-2532-2-1217). Camundongos fêmeas C57Bl/6, com idades entre 7-9 semanas, foram utilizados para o presente estudo. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais) e mantidos em condições específicas livres de patógenos com ciclos de 12 h dia/noite.

1. Indução da inflamação da superfície ocular murina

  1. Realizar preparação de imunógenos para imunização.
    1. Preparar o imunógeno recentemente no dia da imunização, misturando ovalbumina (OVA, 50 mg/mL) e toxina pertussis (100 μg/mL) em solução salina e o hidróxido de alumínio adjuvante (40 mg/mL) (ver Tabela de Materiais) na proporção de 1:1.
      CUIDADO: Realizar a abertura, reconstituição e preparação de imunógenos da toxina pertussis em um gabinete de segurança laminar. Use roupas de proteção e evite qualquer contato com a pele.
    2. Incubar a mistura de imunógenos e adjuvantes à temperatura ambiente durante 30 min e carregar 100 μL numa seringa de 1 ml.
    3. Realizar injeção intraperitoneal da solução de imunógeno em um camundongo não anestesiado.
      1. Segure o mouse suavemente pela cauda enquanto agarra a grade da gaiola. Segure firmemente a pele das costas e a região do pescoço entre o polegar e o dedo indicador e fixe a cauda e os membros inferiores entre o anel e o dedo mínimo contra a palma da mão.
      2. Mantenha o mouse fixo com a cabeça para baixo.
      3. Injete 100 μL da solução de imunógeno preparada no quadrante direito ou esquerdo da cavidade abdominal inferior.
  2. Realizar desafio da superfície ocular 2 semanas após a imunização.
    1. Anestesiar o rato com isoflurano (2,5%).
    2. Aplique 5 μL de OVA (50 mg/mL) ou solução salina (0,9% de NaCl) por olho em ambos os olhos e aguarde até que a gota seja absorvida pelo olho. Isso leva ~ 5 min.
    3. Repita o procedimento 1x ao dia por 7 dias.
      NOTA: A administração tópica de medicamentos pode ser feita da mesma maneira.

2. Coleta de exsudados oculares

  1. Recupere os exsudatos oculares formados durante a fase de desafio, aplicando 50 μL de solução salina estéril ao olho imediatamente após o desafio.
  2. Para obter uma suspensão unicelular, trate a descarga ocular coletada com MNase recombinante (2 x 106 gel U/mL, ver Tabela de Materiais) contendo o cofator cálcio (5 mM) a 37 °C por 20 min.
  3. Centrífuga a 400 x g durante 7 min à temperatura ambiente.
  4. Isole o sobrenadante e meça as citocinas e quimiocinas usando ELISA multiplexado de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
    NOTA: O sobrenadante obtido pode ser usado para análise de proteínas e o pellet para ensaios funcionais, como imunofenotipagem, fagocitose, degranulação e expressão gênica.

3. Excisão dos tecidos da superfície ocular

  1. Disseque as pálpebras e o globo ocular seguindo os passos abaixo.
    1. Eutanasiar o rato por asfixia por CO2 e luxação cervical.
    2. Coloque o mouse em uma superfície uniforme.
    3. Desinfete a área orbital ao redor do olho com um cotonete impregnado com etanol a 70%.
    4. Faça uma incisão entre a orelha e o seio retroorbital e ao longo da superfície acima do osso escamoso verticalmente, estendendo a incisão horizontalmente abaixo da pálpebra inferior ao longo do osso maxilar e acima da pálpebra superior ao longo do osso frontal. Isso forma uma incisão ao redor do olho (Figura 1).
    5. Segure cuidadosamente o tecido dissecado ao redor do olho usando pinça curva e puxe o tecido e o globo ocular para fora.
    6. Coloque os órgãos excisados em PBS estéril.
    7. Apare o excesso de tecido muscular facial ao redor das pálpebras superiores excisadas usando um bisturi e sob o estereomicroscópio.
  2. Recolha a conjuntiva seguindo os passos abaixo.
    1. Coloque a pálpebra superior em uma placa de Petri seca sob o estereomicroscópio.
    2. Usando pinças finas e um bisturi, descasque a camada mucosa esbranquiçada muito suavemente para fora da superfície interna da pálpebra.
  3. Em seguida, disseque a córnea seguindo os passos abaixo.
    1. Coloque o globo ocular em uma nova placa de Petri seca em cima do gelo seco por 3 minutos.
    2. Leve a placa de Petri para a superfície do banco em uma posição estável.
    3. Faça uma pequena incisão na borda da córnea ao lado do limbo usando uma tesoura fina e afiada.
    4. Prolongue a incisão com o bisturi ao redor do globo ocular, separando a esclera da córnea.
    5. Remova os restos da íris e da lente da parte de trás da córnea lavando generosamente com solução salina.

4. Documentação da obstrução da glândula de Meibomian (MG)

  1. Para avaliar o MG e seus orifícios, colocar as pálpebras excisadas em posição vertical sob o estereomicroscópio (Figura 2).
  2. Capture imagens com epiiluminação de luz branca de acordo com o tempo de exposição da câmera e as configurações ISO.
    NOTA: A análise morfométrica dessas imagens fornece quantificação confiável do tamanho do plugue na saída das glândulas. A quantificação pode ser realizada delineando com a ferramenta varinha os plugues oculares e executando o comando "Analisar partículas" do software Image J (ver Tabela de Materiais).

5. Transiluminação das pálpebras (morfologia da glândula de Meibom)

  1. Para avaliar a área de MG, coloque as pálpebras excisadas na posição horizontal e acenda a luz de fundo do estereomicroscópio equipado com uma câmera infravermelha (Figura 3).
  2. Capture imagens ajustando o tempo de exposição de acordo com a ISO da câmera (consulte Tabela de Materiais).
    NOTA: A imagem infravermelha dessas pálpebras transiluminadas sob o estereomicroscópio pode ajudar a medir a forma e o tamanho de cada ácino. A análise morfométrica dessas imagens fornece quantificação confiável do tamanho e do número de MG. A quantificação pode ser realizada delineando o MG com a ferramenta varinha e executando o comando "Analisar Partículas" do software Image J.

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Resultados

O presente protocolo descreve as etapas sequenciais para o estabelecimento de um modelo murino de inflamação da superfície ocular. Os protocolos visam mostrar como aplicar terapêutica localmente, obter exsudatos oculares e órgãos acessórios associados ao consumo como pálpebras saudáveis e inflamadas (Figura 2), córnea e conjuntiva. Deve-se ter atenção quando as pálpebras superiores são dissecadas para o isolamento da conjuntiva, e deve ser armazenada em 1x PBS durante a dissec?...

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Discussão

A secreção oleosa das glândulas meibomianas é de grande importância para um olho saudável22. No entanto, a obstrução dessas glândulas sebáceas por armadilhas extracelulares de neutrófilos agregados (aggNETs) que se alinham como filamentos paralelos localizados nas placas tarsais de ambas as pálpebras pode interromper o filme lacrimal23. Essa ruptura resulta em disfunção da glândula de Meibomian (MGD)1 e evaporação acelerada da lágri...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Fundação Alemã de Pesquisa (DFG) 2886 PANDORA Project-No.B3; SCHA 2040/1-1; MU 4240/2-1; CRC1181(C03); TRR241(B04), Projeto H2020-FETOPEN-2018-2020 861878, e pela Volkswagen-Stiftung (Grant 97744) à MH.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco
Aluminium HydroxideImject alum Adjuvant7716140 mg/ mL
Final Concentration: in vivo: 1 mg/ 100 µL
C57Bl/6 mice, aged 7–9 weeksCharles River Laboratories 
CalciumCarl rothCN93.11 M
Final Concentration: 5 mM
Curved forcepsFST by Dumont SWITZERLAND5/45 11251-35
Fine sharp scissorFST Stainless steel, Germany15001-08
Laminar safety cabinetHerasafe
Macrophotography CameraCanonEOS6D
Macrophotography Camera (without IR filter)NikonD5300
MnaseNew England biolabsM0247S2 x 106 gel U/mL
Multi-analyte flow assay kit (Custom mouse 13-plex panel)BiolegendCLPX-200421AM-UERLAN
NaCl 0,9% (Saline)B.Braun
Ovalbumin (OVA)Endofit, Invivogen9006-59-110 mg/200 µL in saline
Pertussis toxin ThermoFisher Scientific PHZ117450 µg/ 500 µL in saline
Final Concentration: in vivo: 100 µg/ 100 µL
PetridishGreiner bio-one628160
ScalpelFeather disposable scalpelNo. 21 Final Concentration: in vivo:  300 ng/ 100 µL
StereomicroscopeZeissStemi508
Syringe (corneal/iris washing)BD Microlane27 G x 3/4 - Nr.20 0,4 x 19 mm
Syringe (i.p immunization)BD Microlane24 G1"-Nr 17, 055* 25 mm

Referências

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