Detección precoz de la lesión cerebral patológica y por resonancia magnética mediante un modelo de rata de encefalopatía hipóxica isquémica neonatal

Resumen

El presente protocolo describe un modelo de lesión hipóxico-isquémica en roedores recién nacidos para identificar cambios tempranos en el tejido cerebral mediante morfología macroscópica y resonancia magnética. Esto tiene beneficios sobre los modelos existentes, que se pueden utilizar para estudiar lesiones tardías, pero no permiten la evaluación de cambios tempranos reproducibles.

Resumen

La encefalopatía hipóxico-isquémica perinatal (EHI) es una enfermedad aguda que puede afectar a los recién nacidos, lo que da lugar a resultados variables del desarrollo neurológico a largo y corto plazo. El diagnóstico precoz es fundamental para identificar a los lactantes que pueden beneficiarse de la intervención; Sin embargo, el diagnóstico precoz depende en gran medida de criterios clínicos. Ninguna prueba molecular o radiológica ha demostrado ser prometedora para la detección temprana de lesiones cerebrales. Los estudios han demostrado que las imágenes por resonancia magnética (IRM) pueden mostrar cambios tanto en el flujo sanguíneo/isquemia como en la alteración metabólica. Sin embargo, todos ellos se han utilizado para evaluar la fase secundaria de la enfermedad (>12 h) tras el inicio de la lesión. El diagnóstico precoz es fundamental para iniciar rápidamente la hipotermia terapéutica en los lactantes elegibles, que actualmente se recomienda iniciar dentro de las 6 horas posteriores al nacimiento. El modelo de lesión hipóxico-isquémica en ratas se desarrolló en 1981 y se ha validado y utilizado ampliamente para estudiar los cambios en la perfusión cerebral, los marcadores de lesión cerebral y la morfología. Sin embargo, se ha utilizado principalmente como un "modelo tardío", evaluando la lesión varios días después de la lesión isquémica inicial. Se sabe que el modelo tiene poca sensibilidad para evaluar cambios cerebrales tempranos confiables y reproducibles. El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo fiable para el estudio de los marcadores morfológicos y radiológicos macroscópicos tempranos de la EHI mediante tinción patológica y espectroscopia de resonancia magnética cerebral/resonancia magnética.

Introducción

La encefalopatía hipóxica isquémica (EHI) es una afección devastadora que resulta de diversos factores en los recién nacidos¹. La asfixia perinatal y/o la interrupción del flujo sanguíneo cerebral pueden dar lugar a cambios isquémicos focales o globales en el cerebro². La tasa de incidencia es de aproximadamente 1,6 por cada 1.000 nacidos vivos, pero puede llegar a 12,1 por cada 1.000 nacidos vivos en los países en desarrollo³. Esta condición resulta en una alta mortalidad (20%-50%), mientras que el 25% de los que sobreviven tienen probabilidades de sufrir una discapacidad neuronal a largo plazo, como retraso mental, epilepsia o parálisis cerebral⁴. La única intervención terapéutica que ha demostrado ser eficaz en lesiones leves a moderadas es la hipotermia terapéutica, que debe iniciarse dentro de las 6 h posteriores al nacimiento 5,6,7,8,9. Si bien esto puede ayudar a prevenir los cambios metabólicos que conducen a una lesión secundaria, también puede haber posibles efectos secundarios como hipotensión, trombocitopenia, tiempo de coagulación prolongado, hemorragia intracraneal, arritmias, necrosis grasa y desequilibrio electrolítico sérico ^4,5. El diagnóstico precoz de la EHI en los bebés suele ser difícil, ya que los criterios son subjetivos y dependen en gran medida de los hallazgos del examen físico, que evolucionan con el tiempo. Las imágenes por resonancia magnética pueden mostrar cambios que reflejan la lesión varios días o semanas después de la lesión. Sin embargo, los cambios morfológicos en la RM T1/T2 pueden ser normales hasta en dos tercios de la encefalopatía moderada, la categoría de lactantes con mayor probabilidad de beneficiarse de la hipotermia terapéutica¹⁰. Según informes recientes, la espectroscopia de resonancia magnética (MRS) puede mostrar cambios tempranos que se correlacionan con la EHI¹¹ neonatal. Sin embargo, hasta la fecha no se ha realizado ninguna estandarización o validación.

Muchos investigadores se basan en modelos animales para evaluar posibles intervenciones diagnósticas o terapéuticas para las lesiones cerebrovasculares. El método más utilizado para crear un infarto es el ligado de la arteria cerebral media de los roedores^12,13. Si bien a menudo se usa para estudiar el accidente cerebrovascular isquémico en adultos, esto es técnicamente desafiante en roedores neonatos debido al pequeño tamaño y la fragilidad de las crías a la edad equivalente a la enfermedad del recién nacido humano. Además, no representa los cambios isquémicos cerebrales globales que probablemente se observen en la EHI. El modelo¹⁴ de Rice-Vanucci de ligadura unilateral de la arteria carótida en ratas se ha utilizado desde la década de 1980 como un modelo rentable de roedores para estudiar la lesión cerebral hipóxico-isquémica. Sin embargo, existe una gran variabilidad en los cambios cerebrovasculares tempranos y una alta mortalidad en experimentos anteriores. La mayoría de los estudios informan de la lesión cerebral en cambios a largo plazo (es decir, después de 24 horas de la lesión), que son más consistentes. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un enfoque para evaluar los cambios moleculares y radiológicos tempranos (dentro de las 6 h) en un modelo de rata de EHI. El protocolo fue diseñado para asegurar la isquemia a una edad temprana (equivalente a término neonatal) y para aumentar la supervivencia de las crías, especialmente durante la exposición a la hipoxia. Se utilizaron resonancias magnéticas y resonancias magnéticas para evaluar la evidencia radiológica de flujo alterado, cambios en el tejido cerebral y cambios metabólicos dentro de las 6 horas posteriores a la lesión. También se realizó una evaluación morfológica macroscópica de las áreas de infarto. Se llevó a cabo una validación adicional de la reproducibilidad mediante la repetición de los experimentos en múltiples camadas.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Fundación de Investigación Médica de Oklahoma (OMRF) (protocolo IACUC #17-17). Para el presente estudio se utilizaron crías de rata Sprague-Dawley hembras preñadas en E14. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación animal

1. Aclimatar a los animales en el animalario antes del parto de las camadas.
2. Mantenga a todas las ratas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y alimente a las ratas estándar.
3. Después de la entrega de las camadas, mantenga a los cachorros con sus respectivas madres. Usa ambos sexos para los experimentos.
4. A la edad postnatal de 10 años (P10), aleatorice a los cachorros a grupos simulados o HIE.
   NOTA: La línea de tiempo experimental se muestra en la Figura 1. Todos los experimentos se realizaron el mismo día en P10.

2. Ligadura de la arteria carótida (CAL) para el grupo experimental de EHI

1. Coloca las crías de rata en una almohadilla térmica.
2. Iniciar la anestesia con isoflurano al 4% en oxígeno (0,6 LPM) utilizando un cono nasal hasta que desaparezca el reflejo de pinzamiento. Reduzca el flujo de gas a 0.5%-2% para el mantenimiento de la anestesia. Asegúrese de que los cachorros estén inconscientes sin suprimir el impulso respiratorio.
3. Marque a los cachorros en la cola para identificarlos y sujételos suavemente con cinta adhesiva en las cuatro extremidades.
4. Afeitar el área del cuello y esterilizar con hisopos de solución de yodo-povidona al 70% (ver Tabla de Materiales).
5. Con una cuchilla # 11, haga una incisión de 1 cm en la línea media del cuello a través de la piel. Diseccionar cuidadosamente la glándula parótida izquierda y la fascia hasta exponer la arteria carótida izquierda. Movilice suavemente el vaso usando hemostáticos para liberarlo de la fascia.
6. Con un hemostático pequeño, pase con cuidado dos suturas 5-0 (ver Tabla de materiales) alrededor del vaso, a 0,5 cm de distancia, y átelas firmemente.
7. Con unas tijeras pequeñas, corte la arteria entre las dos suturas para asegurar la discontinuidad del flujo sanguíneo. Cierre la piel y la fascia con suturas de seda 5-0 (ver Tabla de Materiales).
8. Inyectar buprenorfina (10 unidades en 800 μL de solución salina normal estéril) por vía intraperitoneal y otros 800 μL de solución salina normal por vía subcutánea en la parte posterior del cuello para prevenir la deshidratación.
   NOTA: El procedimiento debe completarse dentro de los 10-12 minutos.
9. Regrese los cachorros a las jaulas con sus madres y permita que los cachorros se despierten y se recuperen durante 1-2 h.

3. Procedimiento quirúrgico simulado para el grupo de control

1. Coloca las crías de rata en una almohadilla térmica.
2. Iniciar la anestesia con isoflurano al 4% en oxígeno (0,6 LPM) utilizando un cono nasal hasta que desaparezca el reflejo de pinzamiento. Reduzca el flujo de gas a 0.5%-2% para el mantenimiento de la anestesia. Asegúrese de que los cachorros estén inconscientes sin suprimir el impulso respiratorio.
3. Marque a los cachorros en la cola para identificarlos y sujételos suavemente con cinta adhesiva en las cuatro extremidades.
4. Afeitar el área del cuello y esterilizar con hisopos de solución de yodo-povidona al 70%.
5. Con una cuchilla # 11, haga una incisión de 1 cm en la línea media del cuello a través de la piel y luego ciérrela con suturas de seda 5-0.
6. Siga la misma hidratación, analgesia y cuidados postoperatorios que para el grupo HI (pasos 2.8-2.9).

4. Exposición a hipoxia tanto en el grupo CAL como en el simulado

1. Prepare la cámara de hipoxia de plexiglás transparente (consulte la Tabla de materiales) conectando un tubo a la tapa de la cámara para proporcionar un flujo de aire continuo de 6 LPM de la mezcla de gases de hipoxia (8% de oxígeno, 92% de nitrógeno).
2. Coloque una almohadilla absorbente azul en la cámara e inmediatamente coloque las crías de rata de ambos grupos en la cámara. Permita que las crías permanezcan en la cámara de hipoxia durante 45 minutos.
3. Sumerja la cámara en un baño de agua con agua tibia que fluye continuamente para mantener la temperatura establecida en 37 °C dentro de la cámara.
4. Hidratar a las crías con una solución salina oral vía sonda nasogástrica de 600 μL antes de colocarlas en la cámara de hipoxia y 600 μL al final de los 45 min.
5. Retire a todos los cachorros a las jaulas con sus madres (experimentales y falsas) y permita que se recuperen durante 2 h en una habitación junto a la instalación de imágenes de animales pequeños.

5. Resonancia magnética y espectroscopía

1. Realizar resonancia magnética y resonancia magnética para identificar y evaluar los marcadores radiológicos y metabólicos 4 h después del final de la ligadura de la arteria carótida. Realice el procedimiento bajo anestesia con monitoreo cardiovascular continuo en el centro de imágenes de animales pequeños.
2. Anestesiar a cada animal (con 1,5% de isoflurano y 0,7 L/min de oxígeno) y colocarlo en la sonda de resonancia magnética (ver Tabla de Materiales) en posición supina sobre una almohadilla absorbente azul que cubre una almohadilla térmica. Controlar la frecuencia respiratoria de los animales de forma continua utilizando una almohada neumática abdominal (ver Tabla de Materiales).
3. Utilice una bobina de superficie de cabeza como receptor de señal y transmita pulsos de radiofrecuencia a la muestra a través de una bobina de volumen en cuadratura (diámetro interior de 72 mm, consulte la tabla de materiales).
4. Realizar resonancia magnética para evaluar tanto los cambios en el flujo sanguíneo cerebral (CBF) como los cambios en las constantes de difusión del agua (ADC) siguiendo los métodos publicados previamente 15,16,17. Realizar resonancia magnética morfología (T1 y T2), difusión y perfusión para determinar las áreas más afectadas y menos perfundidas del cerebro.
   NOTA: Los valores medios de perfusión y difusión (ADC) en cada grupo se comparan entre el lado ligado y el lado control (lado de la arteria carótida intacta).
5. Realice MRS siguiendo los métodos previamente publicados ^15,17 y analice utilizando un programa codificado interno utilizando el software Mathematica (ver Tabla de Materiales).
6. Escale los espectros de RM en partes por millón (ppm) calibrándolos en función del pico de agua (4,78 ppm). Identifique los principales picos metabólicos cerebrales como N-acetilaspartato (NAA) a 2,02 ppm, colina (Cho) a 3,22 ppm, creatina (Cr) a 3,02 ppm y mioinositol a 3,53 ppm.
   NOTA: Las mediciones del área de pico de los metabolitos se utilizan para calcular las siguientes proporciones: NAA a Cho (NAA/Cho), Cr a Cho (Cr/Cho) y Myo-Ins a Cho (Myo-Ins/Cho)¹⁵.

6. Análisis de suero y tejido cerebral

1. Realizar la toma de muestras de sangre a las 5,5 h después de la ligadura de la arteria carótida o procedimiento simulado de acuerdo con los métodos previamente publicados¹⁸.
2. Anestesiar a los cachorros de nuevo con isoflurano al 4%.
3. Con una cuchilla afilada #11, haga una incisión abdominal, seguida de una incisión diafragmática para exponer el corazón.
4. Realizar la toma de muestras de sangre mediante punción cardíaca como se ha descrito anteriormente¹⁸. Brevemente, inserte una aguja de 32 g en una jeringa de 1 ml en la cavidad cardíaca derecha y aspire suavemente 1 ml de sangre.
5. Deje que la sangre entera se coagule, seguida de una centrifugación a 1.000 x g durante 15 min a 4 °C. El suero se separa en tubos de microcentrífuga limpios.
6. Decapitar toda la cabeza del cachorro para la evaluación macroscópica de la patología cerebral y luego sumergirla en hielo durante 2 minutos.
7. Haz una incisión en el cuero cabelludo dorsal desde la base del cráneo hasta la punta de la nariz y pela los huesos del cráneo alrededor del cerebro. Retira todo el cerebro intacto y colócalo en una placa de Petri limpia.
8. Marque el lado derecho del cerebro con un marcador no tóxico. Coloque el cerebro con la superficie cefálica hacia arriba para que ambos hemisferios sean visibles. Con una cuchilla de afeitar helada, corte el cerebro en cuatro secciones iguales paralelas al plano coronal.
9. Sumerja las secciones del cerebro en una solución de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC, consulte la tabla de materiales) en una placa de Petri cubierta con papel de aluminio para evitar la fotosensibilización e incube durante 15 minutos a 37 °C.
   NOTA: Las áreas infartadas se delinean como áreas blancas desprovistas de tinción roja de TTC.
10. Si los infartos son sutiles o difíciles de detectar, inyecte 0,5-1 mL de TTC (1%) en solución salina tamponada con fosfato directamente en el corazón derecho después de la incisión abdominal y la toracotomía, y deje perfundir durante 2 minutos antes de la decapitación del cachorro.
11. Almacene el tejido cerebral y el suero a -80 °C si se requieren análisis adicionales.

Resultados

El presente protocolo para producir y evaluar los cambios cerebrales tempranos después de la EHI fue fácil de implementar y permitió la visualización patológica y radiológica macroscópica de la lesión cerebral dentro de las 6 h posteriores a la agresión en crías de rata en P10. El plan experimental se muestra en la Figura 1. Ambos sexos se analizaron conjuntamente, y se examinaron 24 animales de cinco camadas en cada grupo. La mortalidad animal fue...

Discusión

Se diseñó con éxito un protocolo de investigación en crías de rata recién nacidas para visualizar y analizar los marcadores tempranos de lesión cerebral en la EHI. Hasta la fecha, existe una falta de herramientas de evaluación objetiva para detectar precozmente la lesión cerebral en la población neonatal. Después de la lesión por IH, hay una fase (1-6 h) en la que el deterioro del metabolismo oxidativo cerebral tiene el potencial de recuperarse parcialmente antes del fracaso ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal saline	Fisher Scientific	Z1376
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Millipore Sigma	T8877
Abdominal pneumatic pillow	SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mL	Fisher Scientific	501060566
BD 30 G Needle and syringe	Fisher Scientific	Catalog No.14-826-10
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany
Buprenorphine			Provided by veterenary medicine
Compact Thermometer with Probe	Fisher Scientific	S01549
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygen	Airgas
Head surface coil	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Isoflurane gas			Provided by veterenary medicine
Isotemp Immersion Circulator 2100	Fisher Scientific	Discontinued	Immersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing
Lead Ring Flask Weights	VWR	29700-060	Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath
Mathematica Software	Wolfram Research, Champaign, IL, USA	version 6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, Unflavored	Pedialyte		Obtained from CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formula	Millipore Sigma	J67670.AP
Plastic clear bucket			We used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135
Plexiglass Rodent Restraint Chamber	Pedialyte/CVS		Vetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches
Pregnant Sprague Dawley rats at E14	Charles River	Strain Code 400
Purdue Products Betadine Swabsticks	Fisher Scientific	19-061617
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter)	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk Suture	Fisher Scientific	Catalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 suture	Fisher Scientific	NC1985424