Detecção precoce de lesão cerebral por ressonância magnética e patológica usando um modelo de rato de encefalopatia hipóxico-isquêmica neonatal

Resumo

O presente protocolo descreve um modelo de roedores de lesão hipóxico-isquêmica de recém-nascidos para identificação precoce de alterações no tecido cerebral por morfologia macroscópica e ressonância magnética. Isso tem benefícios em relação aos modelos existentes, que podem ser usados para estudar lesões tardias, mas não permitem a avaliação de alterações precoces reprodutíveis.

Resumo

A encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) perinatal é uma doença aguda que pode acometer recém-nascidos, resultando em desfechos variáveis de neurodesenvolvimento a longo e curto prazo. O diagnóstico precoce é fundamental para identificar bebês que podem se beneficiar da intervenção; no entanto, o diagnóstico precoce depende muito de critérios clínicos. Nenhum teste molecular ou radiológico se mostrou promissor na detecção precoce de lesão cerebral. Estudos mostraram que a ressonância magnética (RM) pode mostrar alterações no fluxo sanguíneo/isquemia e distúrbios metabólicos. No entanto, todos eles têm sido usados para avaliar a fase secundária da doença (>12 h) após o início da lesão. O diagnóstico precoce é fundamental para iniciar rapidamente a hipotermia terapêutica em bebês elegíveis, que atualmente é recomendada para ser iniciada dentro de 6 horas após o nascimento. O modelo de lesão hipóxico-isquêmica em ratos foi desenvolvido em 1981 e foi validado e usado extensivamente para estudar mudanças na perfusão cerebral, marcadores de lesão cerebral e morfologia. No entanto, tem sido usado principalmente como um "modelo tardio", avaliando a lesão vários dias após o insulto isquêmico inicial. Sabe-se que o modelo tem baixa sensibilidade na avaliação de alterações cerebrais precoces confiáveis e reprodutíveis. O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo confiável para estudar marcadores morfológicos e radiológicos macroscópicos precoces de EHI usando coloração patológica e espectroscopia de ressonância magnética cerebral/ressonância magnética.

Introdução

A encefalopatia hipóxico-isquêmica (EHI) é uma condição devastadora resultante de vários fatores em recém-nascidos¹. A asfixia perinatal e/ou a interrupção do fluxo sanguíneo cerebral podem resultar em alterações isquêmicas focais ou globais no cérebro². A taxa de ocorrência é de aproximadamente 1,6 em 1.000 nascidos vivos, mas pode chegar a 12,1 em 1.000 nascidos vivos em países em desenvolvimento³. Essa condição resulta em alta mortalidade (20% -50%), enquanto 25% dos que sobrevivem provavelmente sofrem de uma deficiência neural de longo prazo, como retardo mental, epilepsia ou paralisia cerebral⁴. A única intervenção terapêutica comprovadamente eficaz na lesão leve a moderada é a hipotermia terapêutica, que deve ser iniciada em até 6 h após o nascimento 5,6,7,8,9. Embora isso possa ajudar a prevenir as alterações metabólicas que levam à lesão secundária, também pode haver potencial para efeitos colaterais como hipotensão, trombocitopenia, tempo de coagulação prolongado, hemorragia intracraniana, disritmias, necrose gordurosa e desequilíbrio eletrolítico sérico ^4,5. O diagnóstico precoce de EHI em bebês costuma ser difícil, pois os critérios são subjetivos e dependem muito dos achados do exame físico, que evoluem com o tempo. A ressonância magnética pode mostrar alterações reflexivas da lesão vários dias a semanas após a lesão. No entanto, alterações morfológicas na RM T1/T2 podem ser normais em até dois terços das encefalopatias moderadas, a categoria de bebês com maior probabilidade de se beneficiar da hipotermia terapêutica¹⁰. De acordo com relatos recentes, a espectroscopia de ressonância magnética (ERM) pode mostrar alterações precoces correlacionadas com a EHI neonatal¹¹. No entanto, nenhuma padronização ou validação foi realizada até o momento.

Muitos investigadores confiam em modelos animais para avaliar possíveis intervenções diagnósticas ou terapêuticas para lesão cerebrovascular. O método mais utilizado para criar um infarto é a ligação da artéria cerebral média de roedores ^12,13. Embora frequentemente usado para estudar o AVC isquêmico em adultos, isso é tecnicamente desafiador em roedores neonatais devido ao tamanho pequeno e à fragilidade dos filhotes na idade equivalente à doença do recém-nascido humano. Além disso, não representa as alterações isquêmicas cerebrais globais que provavelmente serão observadas na EHI. O Modelo¹⁴ de Rice-Vanucci de ligadura unilateral da artéria carótida em ratos tem sido usado desde a década de 1980 como um modelo de roedor de baixo custo para estudar lesão cerebral hipóxico-isquêmica. No entanto, há grande variabilidade nas alterações cerebrovasculares precoces e alta mortalidade em experimentos anteriores. A maioria dos estudos relata a lesão cerebral em alterações de longo prazo (ou seja, após 24 h da lesão), que são mais consistentes. Este estudo teve como objetivo desenvolver uma abordagem para avaliar precocemente (dentro de 6 h) alterações moleculares e radiológicas em um modelo de eIH em ratos. O protocolo foi elaborado para garantir a isquemia em idade precoce (equivalente a recém-nascido a termo) e aumentar a sobrevida dos filhotes, especialmente durante a exposição à hipóxia. A ressonância magnética/ressonância magnética foi usada para avaliar evidências radiológicas de fluxo alterado, alterações no tecido cerebral e alterações metabólicas dentro de 6 h após a lesão. Também foi realizada avaliação morfológica macroscópica das áreas de infarto. A validação adicional da reprodutibilidade foi realizada repetindo os experimentos em várias ninhadas.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF) (protocolo IACUC # 17-17). Filhotes de ratos Sprague-Dawley fêmeas prenhes em E14 foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais).

1. Preparação animal

1. Aclimatar os animais no biotério antes da entrega das ninhadas.
2. Mantenha todos os ratos em um ciclo de luz / escuridão de 12 h e alimente o ratchow padrão.
3. Após a entrega das ninhadas, mantenha os filhotes com suas respectivas mães. Use ambos os sexos para os experimentos.
4. Na idade pós-natal de 10 anos (P10), randomize os filhotes para grupos simulados ou HIE.
   NOTA: A linha do tempo experimental é representada na Figura 1. Todos os experimentos foram realizados no mesmo dia no P10.

2. Ligadura da artéria carótida (NIC) para o grupo experimental HIE

1. Coloque os filhotes de rato em uma almofada de aquecimento.
2. Iniciar a anestesia com isoflurano a 4% em oxigênio (0,6 LPM) usando um cone nasal até que o reflexo de pinça desapareça. Reduza o fluxo de gás para 0,5% -2% para a manutenção da anestesia. Certifique-se de que os filhotes estejam inconscientes sem suprimir o impulso respiratório.
3. Marque os filhotes na cauda para identificação e prenda-os suavemente com fita adesiva nos quatro membros.
4. Raspe a área do pescoço e esterilize com cotonetes de solução de iodo-povidona a 70% (consulte a Tabela de Materiais).
5. Usando uma lâmina # 11, faça uma incisão na linha média do pescoço de 1 cm através da pele. Disseque cuidadosamente a glândula parótida esquerda e a fáscia até que a artéria carótida esquerda fique exposta. Mobilize suavemente o vaso usando hemostáticos para liberá-lo da fáscia.
6. Usando um pequeno hemostático, passe cuidadosamente duas suturas 5-0 (ver Tabela de materiais) ao redor do vaso, com 0,5 cm de distância, e amarre-as firmemente.
7. Usando uma tesoura pequena, corte a artéria entre as duas suturas para garantir a descontinuidade do fluxo sanguíneo. Feche a pele e a fáscia com suturas de seda 5-0 (ver Tabela de Materiais).
8. Injete buprenorfina (10 unidades em 800 μL de solução salina normal estéril) por via intraperitoneal e outros 800 μL de solução salina normal por via subcutânea na parte de trás do pescoço para evitar a desidratação.
   NOTA: O procedimento deve ser concluído dentro de 10-12 min.
9. Devolva os filhotes para as gaiolas com suas mães e permita que os filhotes despertem e se recuperem por 1-2 h.

3. Procedimento cirúrgico simulado para o grupo controle

1. Coloque os filhotes de rato em uma almofada de aquecimento.
2. Iniciar a anestesia com isoflurano a 4% em oxigênio (0,6 LPM) usando um cone nasal até que o reflexo de pinça desapareça. Reduza o fluxo de gás para 0,5% -2% para a manutenção da anestesia. Certifique-se de que os filhotes estejam inconscientes sem suprimir o impulso respiratório.
3. Marque os filhotes na cauda para identificação e prenda-os suavemente com fita adesiva nos quatro membros.
4. Raspe a área do pescoço e esterilize com cotonetes de solução de iodo-povidona a 70%.
5. Usando uma lâmina # 11, faça uma incisão no pescoço da linha média de 1 cm através da pele e feche-a com suturas de seda 5-0.
6. Siga a mesma hidratação, analgesia e cuidados pós-operatórios do grupo HI (etapas 2.8-2.9).

4. Exposição à hipóxia para os grupos CAL e simulado

1. Prepare a câmara de hipóxia de plexiglass transparente (consulte a Tabela de Materiais) conectando o tubo à tampa da câmara para fornecer fluxo de ar contínuo de 6 LPM da mistura de gás hipóxia (8% de oxigênio, 92% de nitrogênio).
2. Coloque uma almofada absorvente azul na câmara e coloque imediatamente os filhotes de ratos de ambos os grupos na câmara. Deixe os filhotes permanecerem na câmara de hipóxia por 45 min.
3. Mergulhe a câmara em banho-maria com água morna que flui continuamente para manter a temperatura regulada em 37 °C no interior da câmara.
4. Hidrate os filhotes com uma solução salina oral via gavagem de 600 μL antes de serem colocados na câmara de hipóxia e 600 μL ao final dos 45 min.
5. Remova todos os filhotes para as gaiolas com suas mães (experimentais e simuladas) e deixe-os se recuperar por 2 h em uma sala ao lado da instalação de imagens de pequenos animais.

5. Ressonância magnética e espectroscopia

1. Realizar ressonância magnética e MRS para identificar e avaliar os marcadores radiológicos e metabólicos 4 h após o término da ligadura da artéria carótida. Realize o procedimento sob anestesia com monitoramento cardiovascular contínuo na instalação de imagem de pequenos animais.
2. Anestesiar cada animal (com isoflurano a 1,5% e oxigênio a 0,7 L/min) e colocá-lo na sonda de RM (ver Tabela de Materiais) em decúbito dorsal em uma almofada absorvente azul cobrindo uma almofada de aquecimento. Monitore continuamente a frequência respiratória dos animais usando um travesseiro pneumático abdominal (ver Tabela de Materiais).
3. Use uma bobina de superfície da cabeça como receptor de sinal e transmita pulsos de radiofrequência para a amostra através de uma bobina de volume em quadratura (diâmetro interno de 72 mm, consulte a Tabela de Materiais).
4. Realizar ressonância magnética para avaliar as alterações no fluxo sanguíneo cerebral (FSC) e as alterações nas constantes de difusão de água (ADC) seguindo métodos publicados anteriormente 15,16,17. Realize a morfologia da ressonância magnética (T1 e T2), difusão e perfusão para determinar as áreas mais afetadas e menos perfundidas do cérebro.
   NOTA: Os valores médios de perfusão e difusão (ADC) em cada grupo são comparados entre o lado ligado e o lado controle (lado íntegro da artéria carótida).
5. Realize a MRS seguindo os métodos publicados anteriormente^15,17 e analise usando um programa codificado interno usando o software Mathematica (consulte a Tabela de Materiais).
6. Dimensione os espectros de RM em partes por milhão (ppm) calibrando em relação ao pico da água (4,78 ppm). Identifique os principais picos metabólicos cerebrais como N-acetilaspartato (NAA) a 2,02 ppm, colina (Cho) a 3,22 ppm, creatina (Cr) a 3,02 ppm e mio-inositol a 3,53 ppm.
   NOTA: As medidas da área de pico dos metabólitos são usadas para calcular as seguintes proporções: NAA para Cho (NAA/Cho), Cr para Cho (Cr/Cho) e Myo-Ins para Cho (Myo-Ins/Cho)¹⁵.

6. Análise do soro e do tecido cerebral

1. Realizar coleta de sangue em 5,5 h após a ligadura da artéria carótida ou procedimento simulado de acordo com métodos previamente publicados¹⁸.
2. Anestesie os filhotes novamente com isoflurano a 4%.
3. Usando uma lâmina afiada # 11, faça uma incisão abdominal, seguida de uma incisão diafragmática para expor o coração.
4. Realizar coleta de sangue por punção cardíaca conforme descrito anteriormente¹⁸. Resumidamente, insira uma agulha de 32 G em uma seringa de 1 mL na câmara cardíaca direita e aspire suavemente 1 mL de sangue.
5. Deixe o sangue total coagular, seguido de centrifugação a 1.000 x g por 15 min a 4 ° C. O soro é separado em tubos de microcentrífuga limpos.
6. Decapite toda a cabeça do filhote para a avaliação macroscópica da patologia cerebral e depois mergulhe-a no gelo por 2 min.
7. Faça uma incisão no couro cabeludo dorsal da base do crânio até a ponta do nariz e retire os ossos do crânio ao redor do cérebro. Remova todo o cérebro intacto em uma placa de Petri limpa.
8. Marque o lado direito do cérebro com um marcador não tóxico. Posicione o cérebro com a superfície cefálica para cima, de modo que ambos os hemisférios fiquem visíveis. Usando uma lâmina de barbear gelada, corte o cérebro em quatro seções iguais paralelas ao plano coronal.
9. Mergulhe as seções cerebrais em solução de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC, consulte a Tabela de Materiais) em uma placa de Petri coberta com papel alumínio para evitar fotossensibilização e incube por 15 min a 37 ° C.
   NOTA: As áreas infartadas são delineadas como áreas brancas desprovidas de coloração vermelha TTC.
10. Se os infartos forem sutis ou difíceis de detectar, injete 0,5-1 mL de TTC (1%) em solução salina tamponada com fosfato diretamente no coração direito após a incisão abdominal e toracotomia, e deixe perfundir por 2 minutos antes da decapitação do filhote.
11. Armazene o tecido cerebral e o soro a -80 ° C se for necessária uma análise adicional.

Resultados

O presente protocolo para produzir e avaliar alterações cerebrais precoces após EHI foi de fácil implementação e permitiu a visualização patológica e radiológica macroscópica da lesão cerebral dentro de 6 h de insulto em filhotes de ratos em P10. O plano experimental é representado na Figura 1. Ambos os sexos foram analisados em conjunto, e 24 animais de cinco leitegadas foram examinados em cada grupo. A mortalidade animal foi muito baixa, com 9...

Discussão

Um protocolo de pesquisa em filhotes de ratos recém-nascidos foi projetado com sucesso para visualizar e analisar marcadores precoces de lesão cerebral em EHI. Até o momento, faltam ferramentas de avaliação objetivas para detectar lesões cerebrais precoces na população de recém-nascidos. Após a lesão da HI, há uma fase (1-6 h) em que o comprometimento do metabolismo oxidativo cerebral tem o potencial de se recuperar parcialmente antes da falha da função mitocondrial

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal saline	Fisher Scientific	Z1376
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Millipore Sigma	T8877
Abdominal pneumatic pillow	SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mL	Fisher Scientific	501060566
BD 30 G Needle and syringe	Fisher Scientific	Catalog No.14-826-10
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany
Buprenorphine			Provided by veterenary medicine
Compact Thermometer with Probe	Fisher Scientific	S01549
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygen	Airgas
Head surface coil	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Isoflurane gas			Provided by veterenary medicine
Isotemp Immersion Circulator 2100	Fisher Scientific	Discontinued	Immersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing
Lead Ring Flask Weights	VWR	29700-060	Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath
Mathematica Software	Wolfram Research, Champaign, IL, USA	version 6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, Unflavored	Pedialyte		Obtained from CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formula	Millipore Sigma	J67670.AP
Plastic clear bucket			We used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135
Plexiglass Rodent Restraint Chamber	Pedialyte/CVS		Vetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches
Pregnant Sprague Dawley rats at E14	Charles River	Strain Code 400
Purdue Products Betadine Swabsticks	Fisher Scientific	19-061617
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter)	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk Suture	Fisher Scientific	Catalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 suture	Fisher Scientific	NC1985424