A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל מכרסמים של פגיעה היפוקסית-איסכמית ביילוד לזיהוי שינויים מוקדמים ברקמת המוח על ידי מורפולוגיה גסה והדמיית תהודה מגנטית. יש לכך יתרונות על פני מודלים קיימים, שניתן להשתמש בהם כדי לחקור פציעה מאוחרת אך אינם מאפשרים הערכה של שינויים מוקדמים הניתנים לשחזור.
אנצפלופתיה היפוקסית-איסכמית סביב הלידה (HIE) היא מחלה חריפה שעלולה לפגוע בילודים, וכתוצאה מכך תוצאות נוירו-התפתחותיות משתנות לטווח ארוך וקצר. אבחון מוקדם הוא קריטי לזיהוי תינוקות שעשויים להפיק תועלת מהתערבות; עם זאת, אבחון מוקדם מסתמך במידה רבה על קריטריונים קליניים. אף בדיקה מולקולרית או רדיולוגית לא הראתה הבטחה באיתור פגיעה מוחית מוקדמת. מחקרים הראו כי הדמיית תהודה מגנטית (MRI) יכולה להראות שינויים הן בזרימת הדם/איסכמיה והן בהפרעה מטבולית. עם זאת, כולם שימשו להערכת השלב המשני של המחלה (>12 שעות) לאחר הופעת הפציעה. אבחון מוקדם הוא קריטי להתחלה מהירה של היפותרמיה טיפולית בתינוקות מתאימים, שכרגע מומלץ להתחיל תוך 6 שעות מהלידה. מודל החולדות של פגיעה היפוקסית-איסכמית פותח בשנת 1981 ותוקף ונעשה בו שימוש נרחב לחקר שינויים בזלוף המוח, סמני פגיעה מוחית ומורפולוגיה. עם זאת, הוא שימש בעיקר כ"מודל מאוחר", להערכת פציעה מספר ימים לאחר העלבון האיסכמי הראשוני. המודל ידוע כבעל רגישות ירודה בהערכת שינויים מוחיים מוקדמים אמינים וניתנים לשחזור. מטרת מחקר זה הייתה לפתח מודל אמין לחקר סמנים מורפולוגיים ורדיולוגיים מוקדמים של HIE באמצעות צביעה פתולוגית והדמיית תהודה מגנטית מוחית/ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית.
אנצפלופתיה איסכמית היפוקסית (HIE) היא מצב הרסני הנובע מגורמים שונים בתינוקות שזה עתה נולדו1. חנק סביב הלידה ו/או הפרעה בזרימת הדם במוח עלולים לגרום לשינויים איסכמיים מוקדיים או גלובליים במוח2. שיעור ההיארעות הוא כ-1.6 ל-1,000 לידות חי, אך עשוי להגיע ל-12.1 ל-1,000 לידות חי במדינות מתפתחות3. מצב זה מביא לתמותה גבוהה (20%-50%), בעוד ש-25% מהשורדים צפויים לסבול ממוגבלות עצבית ארוכת טווח כגון פיגור שכלי, אפילפסיה או שיתוק מוחין4. ההתערבות הטיפולית היחידה שהוכחה כיעילה בפציעה קלה עד בינונית היא היפותרמיה טיפולית, אותה יש להתחיל תוך 6 שעות מהלידה 5,6,7,8,9. אמנם זה עשוי לסייע במניעת השינויים המטבוליים המובילים לפציעה משנית, אך ייתכנו גם פוטנציאל לתופעות לוואי כגון יתר לחץ דם, טרומבוציטופניה, זמן קרישה ממושך, דימום תוך גולגולתי, הפרעות קצב, נמק שומן וחוסר איזון אלקטרוליטיםבסרום 4,5. אבחון מוקדם של HIE בתינוקות הוא לעתים קרובות קשה מכיוון שהקריטריונים הם סובייקטיביים ומסתמכים במידה רבה על ממצאי הבדיקה הגופנית, המתפתחים עם הזמן. הדמיית תהודה מגנטית עשויה להראות שינויים המשקפים את הפציעה מספר ימים עד שבועות לאחר הפציעה. עם זאת, שינויים מורפולוגיים ב-T1/T2 MRI יכולים להיות נורמליים בעד שני שליש מאנצפלופתיה בינונית, קטגוריית התינוקות שסביר ביותר להפיק תועלת מהיפותרמיה טיפולית10. על פי דיווחים אחרונים, ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית (MRS) עשויה להראות שינויים מוקדמים בקורלציה עם HIE11 בילודים. עם זאת, עד כה לא בוצעו סטנדרטיזציה או אימות.
חוקרים רבים מסתמכים על מודלים של בעלי חיים כדי להעריך התערבויות אבחנתיות או טיפוליות פוטנציאליות לפגיעה בכלי הדם במוח. השיטה הנפוצה ביותר ליצירת אוטם היא קשירת עורק המוח האמצעי של מכרסמים 12,13. בעוד שלעתים קרובות משתמשים בו לחקר שבץ איסכמי במבוגרים, זה מאתגר מבחינה טכנית במכרסמים יילודים בשל גודלם הקטן ושבריריותם של הגורים בגיל המקביל למחלת יילוד אנושית. יתר על כן, הוא אינו מייצג את השינויים האיסכמיים המוחיים הגלובליים שסביר להניח שייראו ב-HIE. מודל רייס-ואנוצ'י14 של קשירת עורק הצוואר חד צדדית בחולדות שימש מאז שנות ה-80 כמודל מכרסמים חסכוני לחקר פגיעה מוחית היפוקסית-איסכמית. עם זאת, יש שונות גדולה בשינויים מוקדמים בכלי הדם במוח ותמותה גבוהה בניסויים קודמים. רוב המחקרים מדווחים על הפגיעה המוחית בשינויים ארוכי טווח (כלומר, לאחר 24 שעות של פציעה), שהם עקביים יותר. מחקר זה נועד לפתח גישה להערכת שינויים מולקולריים ורדיולוגיים מוקדמים (תוך 6 שעות) במודל חולדה של HIE. הפרוטוקול תוכנן להבטיח איסכמיה בגיל מוקדם (שווה ערך ליילוד) ולהגביר את הישרדות הגורים, במיוחד במהלך חשיפה להיפוקסיה. MRI / MRS שימשו להערכת עדויות רדיולוגיות לזרימה משתנה, שינויים ברקמת המוח ושינויים מטבוליים תוך 6 שעות מהפציעה. כמו כן בוצעה הערכה מורפולוגית גסה של אזורי האוטם. אימות נוסף של יכולת השחזור נערך על ידי חזרה על הניסויים בהמלטות מרובות.
כל הליכי הניסוי אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה (OMRF) (פרוטוקול IACUC #17-17). נקבות ההריון של גורי חולדות Sprague-Dawley ב-E14 שימשו למחקר הנוכחי. בעלי החיים הושגו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים).
1. הכנת בעלי חיים
2. קשירת עורק הצוואר (CAL) לקבוצת הניסוי HIE
3. הליך כירורגי מזויף לקבוצת הביקורת
4. חשיפה להיפוקסיה הן לקבוצות CAL והן לקבוצות דמה
5. הדמיית תהודה מגנטית וספקטרוסקופיה
6. ניתוח סרום ורקמות מוח
הפרוטוקול הנוכחי לייצור והערכה של שינויים מוחיים מוקדמים לאחר HIE היה קל ליישום ואיפשר הדמיה פתולוגית ורדיולוגית גסה של פגיעה מוחית תוך 6 שעות מהעלבון בגורי חולדות ב-P10. תוכנית הניסוי מתוארת באיור 1. שני המינים נותחו יחד, ובכל קבוצה נבדקו 24 בעלי חיים מחמישה ...
פרוטוקול מחקר בגורי חולדות שזה עתה נולדו תוכנן בהצלחה כדי לדמיין ולנתח סמנים מוקדמים של פגיעה מוחית ב-HIE. נכון להיום, חסרים כלי הערכה אובייקטיביים לאיתור פגיעה מוחית מוקדמת באוכלוסיית היילודים. לאחר פגיעה ב- HI, קיים שלב (1-6 שעות) בו לפגיעה בחילוף החומרים החמצוני במוח יש פו?...
אין ניגודי אינטרסים לאף אחד מהכותבים.
אנו מודים לצוות הווטרינרי של קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה על המומחיות והסיוע בשינוי פרוטוקולי הטיפול בבעלי חיים.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% Normal saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Millipore Sigma | T8877 | |
Abdominal pneumatic pillow | SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY | ||
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mL | Fisher Scientific | 501060566 | |
BD 30 G Needle and syringe | Fisher Scientific | Catalog No.14-826-10 | |
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging system | Bruker Biospin, Ettlingen, Germany | ||
Buprenorphine | Provided by veterenary medicine | ||
Compact Thermometer with Probe | Fisher Scientific | S01549 | |
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygen | Airgas | ||
Head surface coil | Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany | ||
Isoflurane gas | Provided by veterenary medicine | ||
Isotemp Immersion Circulator 2100 | Fisher Scientific | Discontinued | Immersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing |
Lead Ring Flask Weights | VWR | 29700-060 | Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath |
Mathematica Software | Wolfram Research, Champaign, IL, USA | version 6.0 | |
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, Unflavored | Pedialyte | Obtained from CVS | |
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formula | Millipore Sigma | J67670.AP | |
Plastic clear bucket | We used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135 | ||
Plexiglass Rodent Restraint Chamber | Pedialyte/CVS | Vetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches | |
Pregnant Sprague Dawley rats at E14 | Charles River | Strain Code 400 | |
Purdue Products Betadine Swabsticks | Fisher Scientific | 19-061617 | |
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter) | Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany | ||
Stoelting Silk Suture | Fisher Scientific | Catalog No.10-000-656 | |
Vicryl 5-0 suture | Fisher Scientific | NC1985424 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved