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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le présent protocole décrit un modèle de rongeur de lésions hypoxiques-ischémiques chez le nouveau-né afin d’identifier les changements précoces dans le tissu cérébral par morphologie macroscopique et imagerie par résonance magnétique. Cela présente des avantages par rapport aux modèles existants, qui peuvent être utilisés pour étudier les lésions tardives, mais ne permettent pas d’évaluer les changements précoces reproductibles.

Résumé

L’encéphalopathie hypoxique-ischémique périnatale (EHI) est une maladie aiguë qui peut affecter les nouveau-nés, entraînant des résultats neurodéveloppementaux variables à long et à court terme. Un diagnostic précoce est essentiel pour identifier les nourrissons qui pourraient bénéficier d’une intervention ; Cependant, le diagnostic précoce repose en grande partie sur des critères cliniques. Aucun test moléculaire ou radiologique n’a montré de potentiel pour détecter les lésions cérébrales précoces. Des études ont montré que l’imagerie par résonance magnétique (IRM) peut montrer des changements à la fois dans le flux sanguin/l’ischémie et la perturbation métabolique. Cependant, ils ont tous été utilisés pour évaluer la phase secondaire de la maladie (>12 h) après le début de la blessure. Un diagnostic précoce est essentiel pour commencer rapidement l’hypothermie thérapeutique chez les nourrissons éligibles, qu’il est actuellement recommandé d’initier dans les 6 heures suivant la naissance. Le modèle de lésion hypoxique-ischémique chez le rat a été développé en 1981 et a été validé et largement utilisé pour étudier les changements dans la perfusion cérébrale, les marqueurs de lésion cérébrale et la morphologie. Cependant, il a principalement été utilisé comme « modèle tardif », évaluant la blessure plusieurs jours après l’agression ischémique initiale. Le modèle est connu pour avoir une faible sensibilité dans l’évaluation de changements cérébraux précoces fiables et reproductibles. L’objectif de cette étude était de développer un modèle fiable pour étudier les marqueurs morphologiques et radiologiques macroscopiques précoces de l’EHI à l’aide de la coloration pathologique et de l’imagerie par résonance magnétique cérébrale/spectroscopie par résonance magnétique.

Introduction

L’encéphalopathie hypoxique ischémique (EHI) est une maladie dévastatrice résultant de divers facteurs chez les nouveau-nés1. L’asphyxie périnatale et/ou la perturbation du flux sanguin cérébral peuvent entraîner des modifications ischémiques focales ou globales dans le cerveau2. Le taux d’occurrence est d’environ 1,6 pour 1 000 naissances vivantes, mais peut atteindre 12,1 pour 1 000 naissances vivantes dans les pays en développement3. Cette condition entraîne une mortalité élevée (20 % à 50 %), tandis que 25 % des survivants sont susceptibles de souffrir d’un handicap neuronal à long terme tel qu’un retard mental, une épilepsie ou une paralysie cérébrale4. La seule intervention thérapeutique dont l’efficacité a été prouvée dans les lésions légères à modérées est l’hypothermie thérapeutique, qui doit être initiée dans les 6 heures suivant la naissance 5,6,7,8,9. Bien que cela puisse aider à prévenir les changements métaboliques qui entraînent des lésions secondaires, il peut également y avoir un risque d’effets secondaires tels que l’hypotension, la thrombocytopénie, le temps de coagulation prolongé, l’hémorragie intracrânienne, les dysrythmies, la nécrose graisseuse et le déséquilibre électrolytique sérique 4,5. Le diagnostic précoce de l’EHI chez les bébés est souvent difficile car les critères sont subjectifs et reposent fortement sur les résultats de l’examen physique, qui évoluent au fil du temps. L’imagerie par résonance magnétique peut montrer des changements reflétant une blessure plusieurs jours à quelques semaines après la blessure. Cependant, les changements morphologiques de l’IRM T1/T2 peuvent être normaux dans jusqu’à deux tiers des cas d’encéphalopathie modérée, la catégorie de nourrissons la plus susceptible de bénéficier d’une hypothermie thérapeutique10. Selon des rapports récents, la spectroscopie par résonance magnétique (SRM) peut montrer des changements précoces corrélés avec l’HIE11 néonatal. Cependant, aucune normalisation ou validation n’a été effectuée à ce jour.

De nombreux chercheurs s’appuient sur des modèles animaux pour évaluer les interventions diagnostiques ou thérapeutiques potentielles pour les lésions cérébrovasculaires. La méthode la plus fréquemment utilisée pour créer un infarctus est la ligature de l’artère cérébrale moyenne des rongeurs12,13. Bien qu’il soit souvent utilisé pour étudier l’AVC ischémique chez l’adulte, celui-ci est techniquement difficile chez les rongeurs néonatals en raison de la petite taille et de la fragilité des petits à l’âge équivalent à la maladie du nouveau-né humain. De plus, il ne représente pas les changements ischémiques cérébraux globaux susceptibles d’être observés dans l’EHI. Le modèle14 de Rice-Vanucci de ligature unilatérale de l’artère carotide chez le rat est utilisé depuis les années 1980 comme modèle rentable chez les rongeurs pour étudier les lésions cérébrales hypoxiques-ischémiques. Cependant, il existe une grande variabilité dans les changements cérébrovasculaires précoces et une mortalité élevée dans les expériences antérieures. La plupart des études rapportent que la lésion cérébrale présente des changements à long terme (c’est-à-dire après 24 heures de blessure), qui sont plus constants. Cette étude visait à développer une approche pour évaluer précocement (dans les 6 heures) les changements moléculaires et radiologiques dans un modèle de rat de HIE. Le protocole a été conçu pour assurer l’ischémie à un âge précoce (équivalent nouveau-né à terme) et pour augmenter la survie des petits, en particulier lors d’une exposition à l’hypoxie. L’IRM/MRS a été utilisée pour évaluer les signes radiologiques d’une altération du débit, de modifications des tissus cérébraux et de modifications métaboliques dans les 6 heures suivant la blessure. Une évaluation morphologique macroscopique des zones d’infarctus a également été effectuée. Une validation supplémentaire de la reproductibilité a été effectuée en répétant les expériences dans plusieurs portées.

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Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de la Fondation de recherche médicale de l’Oklahoma (OMRF) (protocole IACUC #17-17). Des petits rats Sprague-Dawley femelles enceintes à E14 ont été utilisés pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Préparation des animaux

  1. Acclimater les animaux dans l’animalerie avant la livraison des portées.
  2. Maintenez tous les rats sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures et nourrissez-les avec un ratchow standard.
  3. Après la livraison des portées, gardez les petits avec leurs mères respectives. Utilisez les deux sexes pour les expériences.
  4. À l’âge postnatal de 10 ans (P10), répartissez les petits au hasard dans des groupes simulés ou HIE.
    REMARQUE : La chronologie expérimentale est illustrée à la figure 1. Toutes les expériences ont été réalisées le même jour à P10.

2. Ligature de l’artère carotide (CAL) pour le groupe expérimental HIE

  1. Placez les petits rats sur un coussin chauffant.
  2. Initier l’anesthésie avec 4 % d’isoflurane dans de l’oxygène (0,6 LPM) à l’aide d’un cône nasal jusqu’à ce que le réflexe de pincement disparaisse. Réduire le débit de gaz à 0,5 % à 2 % pour le maintien de l’anesthésie. Assurez-vous que les chiots sont inconscients sans supprimer la pulsion respiratoire.
  3. Marquez les petits sur la queue pour les identifier et retenez-les doucement avec du ruban adhésif sur les quatre membres.
  4. Rasez la zone du cou et stérilisez avec des écouvillons de solution iode-povidone à 70 % (voir le tableau des matériaux).
  5. À l’aide d’une lame #11, faites une incision médiane de 1 cm à travers la peau. Disséquez soigneusement la glande parotide gauche et le fascia jusqu’à ce que l’artère carotide gauche soit exposée. Mobilisez doucement le vaisseau à l’aide d’hémostats pour le libérer du fascia.
  6. À l’aide d’un petit hémostat, passez soigneusement deux sutures 5-0 (voir Tableau des matériaux) autour du vaisseau, à 0,5 cm l’une de l’autre, et attachez-les fermement.
  7. À l’aide de petits ciseaux, coupez l’artère entre les deux sutures pour assurer la discontinuité de la circulation sanguine. Fermez la peau et le fascia avec des sutures en soie 5-0 (voir le tableau des matériaux).
  8. Injecter de la buprénorphine (10 unités dans 800 μL de solution saline normale stérile) par voie intrapéritonéale et 800 μL supplémentaires de solution saline normale par voie sous-cutanée à l’arrière du cou pour prévenir la déshydratation.
    REMARQUE : La procédure doit être terminée dans les 10 à 12 minutes.
  9. Remettez les petits dans les cages avec leurs mères et laissez-les se réveiller et récupérer pendant 1 à 2 heures.

3. Procédure chirurgicale simulée pour le groupe témoin

  1. Placez les petits rats sur un coussin chauffant.
  2. Initier l’anesthésie avec 4 % d’isoflurane dans de l’oxygène (0,6 LPM) à l’aide d’un cône nasal jusqu’à ce que le réflexe de pincement disparaisse. Réduire le débit de gaz à 0,5 % à 2 % pour le maintien de l’anesthésie. Assurez-vous que les chiots sont inconscients sans supprimer la pulsion respiratoire.
  3. Marquez les petits sur la queue pour les identifier et retenez-les doucement avec du ruban adhésif sur les quatre membres.
  4. Rasez la région du cou et stérilisez avec des tampons de solution iode-povidone à 70 %.
  5. À l’aide d’une lame #11, faites une incision médiane du cou de 1 cm à travers la peau, puis fermez-la avec des sutures en soie 5-0.
  6. Suivez les mêmes soins d’hydratation, d’analgésie et postopératoires que pour le groupe HI (étapes 2.8-2.9).

4. Exposition à l’hypoxie pour les groupes CAL et placebo

  1. Préparez la chambre d’hypoxie en plexiglas transparent (voir le tableau des matériaux) en fixant le tube au couvercle de la chambre pour fournir un flux d’air continu de 6 LPM du mélange gazeux d’hypoxie (8 % d’oxygène, 92 % d’azote).
  2. Placez un tampon absorbant bleu dans la chambre et placez immédiatement les petits rats des deux groupes dans la chambre. Laissez les petits rester dans la chambre d’hypoxie pendant 45 min.
  3. Plongez la chambre dans un bain-marie avec de l’eau chaude qui coule en continu pour maintenir la température réglée à 37 °C à l’intérieur de la chambre.
  4. Hydratez les petits avec une solution saline orale par gavage de 600 μL avant d’être placés dans la chambre d’hypoxie et de 600 μL à la fin des 45 min.
  5. Sortez tous les petits dans les cages avec leurs mères (expérimentales et simulées) et laissez-les récupérer pendant 2 heures dans une pièce à côté de l’installation d’imagerie des petits animaux.

5. Imagerie par résonance magnétique et spectroscopie

  1. Réaliser l’IRM et la SRM pour identifier et évaluer les marqueurs radiologiques et métaboliques 4 h après la fin de la ligature de l’artère carotide. Effectuer la procédure sous anesthésie avec surveillance cardiovasculaire continue dans l’installation d’imagerie pour petits animaux.
  2. Anesthésier chaque animal (avec 1,5 % d’isoflurane et 0,7 L/min d’oxygène) et le placer dans la sonde IRM (voir tableau des matériaux) en position couchée sur un coussin absorbant bleu recouvrant un coussin chauffant. Surveiller en permanence le rythme respiratoire des animaux à l’aide d’un oreiller pneumatique abdominal (voir tableau des matériaux).
  3. Utilisez une bobine de surface de tête comme récepteur de signal et transmettez des impulsions radiofréquences à l’échantillon à travers une bobine de volume en quadrature (diamètre intérieur de 72 mm, voir tableau des matériaux).
  4. Effectuer une IRM pour évaluer à la fois les changements dans le débit sanguin cérébral (CBF) et les changements dans les constantes de diffusion de l’eau (ADC) selon les méthodes précédemment publiées 15,16,17. Effectuer l’IRM morphologie (T1 et T2), la diffusion et la perfusion pour déterminer les zones les plus affectées et les moins perfusées du cerveau.
    REMARQUE : Les valeurs moyennes de perfusion et de diffusion (ADC) dans chaque groupe sont comparées entre le côté ligaturé et le côté témoin (côté de l’artère carotide intacte).
  5. Effectuez des SRM selon les méthodes précédemment publiées15,17 et analysez à l’aide d’un programme codé interne à l’aide du logiciel Mathematica (voir Tableau des matériaux).
  6. Mettez à l’échelle les spectres RM en parties par million (ppm) en les calibrant par rapport au pic d’eau (4,78 ppm). Identifiez les principaux pics métaboliques cérébraux comme étant le N-acétylaspartate (NAA) à 2,02 ppm, la choline (Cho) à 3,22 ppm, la créatine (Cr) à 3,02 ppm et le myo-inositol à 3,53 ppm.
    REMARQUE : Les mesures de l’aire de crête des métabolites sont utilisées pour calculer les rapports suivants : NAA à Cho (NAA/Cho), Cr à Cho (Cr/Cho) et Myo-Ins à Cho (Myo-Ins/Cho)15.

6. Analyse du sérum et des tissus cérébraux

  1. Effectuer un prélèvement sanguin à 5,5 h après la ligature de l’artère carotide ou la procédure simulée selon les méthodes publiées précédemment18.
  2. Anesthésie à nouveau les chiots avec 4 % d’isoflurane.
  3. À l’aide d’une lame tranchante #11, faites une incision abdominale, suivie d’une incision diaphragmatique pour exposer le cœur.
  4. Effectuer un prélèvement sanguin par ponction cardiaque comme décrit précédemment18. Brièvement, insérez une aiguille de 32 G dans la cavité cardiaque droite à l’aide d’une seringue de 1 ml et aspirez doucement 1 ml de sang.
  5. Laisser coaguler l’ensemble du sang, puis procéder à une centrifugation à 1 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Le sérum est séparé en tubes de microcentrifugation propres.
  6. Décapitez toute la tête du chiot pour l’évaluation macroscopique de la pathologie cérébrale, puis plongez-la dans la glace pendant 2 min.
  7. Faites une incision sur le cuir chevelu dorsal de la base du crâne jusqu’au bout du nez et décollez les os du crâne autour du cerveau. Retirez le cerveau entier intact dans une boîte de Pétri propre.
  8. Marquez le côté droit du cerveau avec un marqueur non toxique. Positionnez le cerveau avec la surface des céphaliades vers le haut de manière à ce que les deux hémisphères soient visibles. À l’aide d’une lame de rasoir glacée, coupez le cerveau en quatre sections égales parallèles au plan coronal.
  9. Immerger les sections cérébrales dans une solution de chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC, voir tableau des matériaux) dans une boîte de Pétri recouverte d’une feuille pour prévenir la photosensibilisation et incuber pendant 15 min à 37 °C.
    REMARQUE : Les zones infarctus sont délimitées par des zones blanches dépourvues de coloration rouge TTC.
  10. Si les infarctus sont subtils ou difficiles à détecter, injecter 0,5 à 1 mL de TTC (1 %) dans une solution saline tamponnée au phosphate directement dans le cœur droit après l’incision abdominale et la thoracotomie, et laisser perfuser pendant 2 minutes avant la décapitation du petit.
  11. Conservez le tissu cérébral et le sérum à −80 °C si une analyse plus approfondie est nécessaire.

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Résultats

Le protocole actuel visant à produire et à évaluer les changements cérébraux précoces après l’EHI a été facile à mettre en œuvre et a permis de visualiser les lésions cérébrales macroscopiques dans les 6 heures suivant l’agression chez les petits rats à P10. Le plan expérimental est illustré à la figure 1. Les deux sexes ont été analysés ensemble, et 24 animaux de cinq portées ont été examinés dans chaque groupe. La mortalité an...

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Discussion

Un protocole de recherche chez des ratons nouveau-nés a été conçu avec succès pour visualiser et analyser les marqueurs précoces de lésions cérébrales dans l’EHI. À ce jour, il n’existe pas d’outils d’évaluation objectifs permettant de détecter les lésions cérébrales précoces chez les nouveau-nés. Après une lésion HI, il y a une phase (1 à 6 h) au cours de laquelle l’altération du métabolisme oxydatif cérébral a le potentiel de se rétablir partiellement...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a aucun conflit d’intérêts pour l’un ou l’autre des auteurs.

Remerciements

Nous remercions le personnel vétérinaire de la Fondation de recherche médicale de l’Oklahoma pour son expertise et son aide dans la modification des protocoles de soins aux animaux.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Normal salineFisher ScientificZ1376
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)Millipore SigmaT8877
Abdominal pneumatic pillowSA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mLFisher Scientific501060566
BD 30 G Needle and syringeFisher ScientificCatalog No.14-826-10
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging systemBruker Biospin, Ettlingen, Germany
BuprenorphineProvided by veterenary medicine
Compact Thermometer with ProbeFisher ScientificS01549
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygenAirgas
Head surface coilBruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Isoflurane gasProvided by veterenary medicine
Isotemp Immersion Circulator 2100Fisher ScientificDiscontinuedImmersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing
Lead Ring Flask WeightsVWR29700-060Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath
Mathematica SoftwareWolfram Research, Champaign, IL, USAversion 6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, UnflavoredPedialyteObtained from CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formulaMillipore SigmaJ67670.AP
Plastic clear bucketWe used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135
Plexiglass Rodent Restraint ChamberPedialyte/CVSVetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches
Pregnant Sprague Dawley rats at E14Charles RiverStrain Code 400
Purdue Products Betadine SwabsticksFisher Scientific19-061617
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter)Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk SutureFisher ScientificCatalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 sutureFisher Scientific NC1985424

Références

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