신생아 저산소성 허혈성 뇌병증의 쥐 모델을 사용한 뇌 손상의 조기 병리학적 및 자기 공명 감지

요약

본 프로토콜은 총체적 형태학 및 자기 공명 영상(MRI)을 통해 대뇌 조직의 초기 변화를 확인하기 위한 신생아 저산소성 허혈성 손상의 설치류 모델을 설명합니다. 이는 기존 모델에 비해 이점이 있으며, 후기 부상을 연구하는 데 사용할 수 있지만 재현 가능한 초기 변화를 평가할 수 없습니다.

초록

주산기 저산소성 허혈성 뇌병증(HIE)은 신생아를 괴롭힐 수 있는 급성 질환으로, 다양한 장단기 신경 발달 결과를 초래합니다. 조기 진단은 중재의 혜택을 받을 수 있는 영아를 식별하는 데 중요합니다. 그러나 조기 진단은 임상적 기준에 크게 의존합니다. 분자 또는 방사선 검사는 조기 뇌 손상을 감지하는 데 가능성을 보여주지 않았습니다. 연구에 따르면 자기공명영상(MRI)은 혈류/허혈 및 대사 장애의 변화를 모두 보여줄 수 있습니다. 그러나 그들은 모두 부상 발병 후 질병의 2 차 단계 (>12 시간)를 평가하는 데 사용되었습니다. 조기 진단은 적격 영아에서 치료적 저체온증을 신속하게 시작하는 데 중요하며, 현재 출생 후 6시간 이내에 시작하는 것이 권장됩니다. 저산소성 허혈성 손상의 쥐 모델은 1981년에 개발되었으며 뇌 관류, 뇌 손상 마커 및 형태학의 변화를 연구하기 위해 검증되고 광범위하게 사용되었습니다. 그러나 주로 초기 허혈성 모욕 후 며칠 후 부상을 평가하는 "후기 모델"로 사용되었습니다. 이 모델은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 초기 대뇌 변화를 평가하는 데 민감도가 낮은 것으로 알려져 있습니다. 이 연구의 목적은 병리학적 염색 및 대뇌 자기 공명 영상/자기 공명 분광법을 사용하여 HIE의 초기 총 형태학적 및 방사선학적 마커를 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 모델을 개발하는 것이었습니다.

서문

저산소성 허혈성 뇌병증(HIE)은 신생아의 다양한 요인으로 인해 발생하는 파괴적인 상태이다¹. 주산기 질식 및/또는 뇌 혈류의 중단은 뇌에 국소 또는 전반적 허혈 변화를 초래할 수 있다². 개발도상국에서는 1,000명당 약 1.6명의 발생률이 발생하지만, 개발도상국에서는 1,000명당 12.1명에 달할 수 있다³. 이 질환은 높은 사망률(20%-50%)을 초래하며, 생존자의 25%는 정신 지체, 간질 또는 뇌성마비와 같은 장기적인 신경 장애를 앓을 가능성이 높습니다⁴. 경증에서 중등도의 부상에 효과가 입증된 유일한 치료적 개입은 치료적 저체온증이며, 이는 출생 후 6시간 이내에 시작해야 한다 5,6,7,8,9. 이는 2차 손상으로 이어지는 대사 변화를 예방하는 데 도움이 될 수 있지만, 저혈압, 혈소판 감소증, 응고 시간 연장, 두개내 출혈, 부정맥, 지방 괴사, 혈청 전해질 불균형과 같은 부작용이 발생할 가능성도 있습니다 ^4,5. 아기의 HIE를 조기에 진단하는 것은 기준이 주관적이고 시간이 지남에 따라 발전하는 신체 검사 결과에 크게 의존하기 때문에 어려운 경우가 많습니다. 자기공명영상(MRI)은 부상 후 며칠에서 몇 주 동안 부상에 반영된 변화를 보여줄 수 있습니다. 그러나 T1/T2 MRI의 형태학적 변화는 중등도 뇌병증의 최대 2/3에서 정상일 수 있으며, 이는 치료적 저체온증의 혜택을 받을 가능성이 가장 높은 영아 범주에 속한다¹⁰. 최근 보고서에 따르면 자기공명분광법(MRS)은 신생아 HIE¹¹과 관련된 초기 변화를 보여줄 수 있습니다. 그러나 현재까지 표준화 또는 유효성 검사가 수행되지 않았습니다.

많은 연구자들은 뇌혈관 손상에 대한 잠재적인 진단 또는 치료 개입을 평가하기 위해 동물 모델에 의존합니다. 경색을 일으키기 위해 가장 자주 사용되는 방법은 설치류의 중대뇌동맥^12,13을 결찰하는 것입니다. 성인 허혈성 뇌졸중을 연구하는 데 자주 사용되지만, 인간의 신생아 질환과 동일한 나이의 새끼의 작은 크기와 연약함으로 인해 신생아 설치류에서는 기술적으로 어렵습니다. 또한, HIE에서 볼 수 있는 전반적인 뇌허혈 변화를 나타내지 않습니다. 쥐의 편측 경동맥 결찰에 대한 Rice-Vanucci 모델¹⁴는 1980년대부터 저산소성 허혈성 뇌 손상을 연구하기 위한 비용 효율적인 설치류 모델로 사용되어 왔습니다. 그러나 초기 뇌혈관 변화에는 큰 변동성이 있으며 초기 실험에서는 사망률이 높습니다. 대부분의 연구에서는 뇌 손상이 장기간의 변화(즉, 부상 후 24시간 후)에서 발생한다고 보고하고 있으며, 이는 보다 일관성이 있습니다. 이 연구는 HIE의 쥐 모델에서 조기(6시간 이내) 분자 및 방사선학적 변화를 평가하는 접근 방식을 개발하는 것을 목표로 했습니다. 이 프로토콜은 초기(만삭 신생아에 해당) 나이에 허혈을 보장하고 특히 저산소증에 노출되는 동안 새끼의 생존을 증가시키기 위해 고안되었습니다. MRI/MRS를 사용하여 손상 후 6시간 이내의 흐름 변화, 대뇌 조직 변화 및 대사 변화의 방사선학적 증거를 평가했습니다. 경색 부위에 대한 전체적인 형태학적 평가도 수행했습니다. 재현성에 대한 추가 검증은 여러 깔짚에서 실험을 반복하여 수행되었습니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 오클라호마 의학 연구 재단(OMRF) 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 IACUC #17-17)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 E14의 임신한 암컷 Sprague-Dawley 새끼 쥐가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었습니다 ( 재료 표 참조).

1. 동물 준비

1. 새끼를 분만하기 전에 동물 시설에 동물을 적응시킵니다.
2. 모든 쥐를 a12 h light/darkcycle로 유지하고 표준 ratchow를 먹이십시오.
3. 새끼를 낳은 후에는 새끼를 각각의 댐과 함께 보관하십시오. 실험에는 남녀를 모두 사용합니다.
4. 출생 후 10세(P10)에 새끼를 가짜 또는 HIE 그룹으로 무작위 배정합니다.
   참고: 실험 타임라인은 그림 1에 나와 있습니다. 모든 실험은 같은 날 P10에서 수행되었습니다.

2. 실험적 HIE 그룹을 위한 경동맥 결찰(CAL)

1. 새끼 쥐를 보온 패드에 올려 놓습니다.
2. 핀치 반사가 사라질 때까지 비강 원뿔을 사용하여 산소 중 4% 이소플루란(0.6LPM)으로 마취를 시작합니다. 마취 유지를 위해 가스의 흐름을 0.5%-2%로 떨어뜨립니다. 호흡 욕구를 억제하지 않고 강아지가 의식을 잃었는지 확인하십시오.
3. 식별을 위해 새끼를 꼬리에 표시하고 네 팔다리에 테이프로 부드럽게 제지합니다.
4. 목 부위를 면도하고 70% 요오드-포비돈 용액 면봉으로 소독합니다( 재료 표 참조).
5. #11 블레이드를 사용하여 피부를 통해 1cm 길이의 목 정중선을 절개합니다. 왼쪽 경동맥이 노출될 때까지 왼쪽 이하선과 근막을 조심스럽게 절개합니다. 지혈기를 사용하여 혈관을 부드럽게 움직여 근막에서 분리하십시오.
6. 작은 지혈기를 사용하여 0.5cm 간격으로 두 개의 5-0 봉합사( 재료 표 참조)를 혈관 주위에 조심스럽게 통과시키고 단단히 묶습니다.
7. 작은 가위를 사용하여 두 봉합사 사이의 동맥을 잘라 혈류의 불연속성을 확인합니다. 5-0 실크 봉합사로 피부와 근막을 닫습니다( 재료 표 참조).
8. 탈수를 방지하기 위해 부프레노르핀(800μL의 멸균 생리식염수에 10단위)을 복강내로 주입하고 또 다른 800μL의 생리식염수를 목 뒤쪽에 피하주사합니다.
   참고: 절차는 10-12분 이내에 완료해야 합니다.
9. 새끼를 댐이 있는 우리로 되돌리고 새끼가 1-2시간 동안 깨어나고 회복되도록 합니다.

3. 대조군을 위한 가짜 수술 절차

1. 새끼 쥐를 보온 패드에 올려 놓습니다.
2. 핀치 반사가 사라질 때까지 비강 원뿔을 사용하여 산소 중 4% 이소플루란(0.6LPM)으로 마취를 시작합니다. 마취 유지를 위해 가스의 흐름을 0.5%-2%로 떨어뜨립니다. 호흡 욕구를 억제하지 않고 강아지가 의식을 잃었는지 확인하십시오.
3. 식별을 위해 새끼를 꼬리에 표시하고 네 팔다리에 테이프로 부드럽게 제지합니다.
4. 목 부위를 면도하고 70% 요오드-포비돈 용액 면봉으로 소독합니다.
5. #11 면도날을 사용하여 피부를 통해 1cm 길이의 목 정중선을 절개한 다음 5-0 실크 봉합사로 봉합합니다.
6. HI 그룹과 동일한 수분 공급, 진통 및 수술 후 관리를 따릅니다(2.8-2.9단계).

4. CAL 그룹과 가짜 그룹 모두에 대한 저산소증 노출

1. 챔버 뚜껑에 튜브를 부착하여 투명 플렉시글라스 저산소증 챔버( 재료 표 참조)를 준비하여 저산소증 가스 혼합물 6LPM(8% 산소, 92% 질소)의 지속적인 공기 흐름을 제공합니다.
2. 챔버에 파란색 흡수 패드를 놓고 즉시 두 그룹의 새끼 쥐를 챔버에 놓습니다. 새끼를 저산소증 챔버에 45분 동안 그대로 두십시오.
3. 챔버 내부의 온도를 37°C로 설정하기 위해 지속적으로 흐르는 따뜻한 물이 있는 수조에 챔버를 담그십시오.
4. 저산소증 챔버에 넣기 전에 600μL의 간을 통해 구강 식염수로 강아지를 수화시키고 45분이 끝나면 600μL를 공급합니다.
5. 모든 새끼를 댐(실험용 및 가짜)이 있는 우리로 옮기고 작은 동물 이미징 시설 옆의 방에서 2시간 동안 회복할 수 있도록 합니다.

5. 자기 공명 이미징 및 분광법

1. MRI 및 MRS를 수행하여 경동맥 결찰 종료 4시간 후 방사선 및 대사 마커를 식별하고 평가합니다. 소동물 이미징 시설에서 지속적인 심혈관 모니터링과 함께 마취 하에 절차를 수행합니다.
2. 각 동물(1.5% 이소플루란 및 0.7L/min 산소 포함)을 마취하고 발열 패드를 덮고 있는 파란색 흡수 패드의 누운 자세로 MR 프로브( 재료 표 참조)에 놓습니다. 복부 공압 베개를 사용하여 동물의 호흡 속도를 지속적으로 모니터링합니다( 재료 표 참조).
3. 헤드 표면 코일을 신호 수신기로 사용하고 직교 볼륨 코일(내경 72mm, 재료 표 참조)을 통해 무선 주파수 펄스를 샘플로 전송합니다.
4. MRI를 수행하여 이전에 발표된 방법 ^15,16,17에 따라 뇌혈류(CBF)의 변화와 수분 확산 상수(ADC)의 변화를 모두 평가합니다. MRI 형태학(T1 및 T2), 확산 및 관류를 수행하여 뇌에서 가장 영향을 받는 영역과 가장 적게 관류된 영역을 확인합니다.
   참고: 각 그룹의 관류 및 확산(ADC)에 대한 평균값은 결찰측과 대조측(온전한 경동맥 측) 간에 비교됩니다.
5. 이전에 발표된 방법^15,17에 따라 MRS를 수행하고 Mathematica 소프트웨어를 사용하여 사내 코딩 프로그램을 사용하여 분석합니다(재료 표 참조).
6. 물 피크(4.78ppm)에 대해 보정하여 MR 스펙트럼을 백만분율(ppm) 단위로 확장합니다. 주요 뇌 대사 피크는 2.02ppm의 N-아세틸라스파테이트(NAA), 3.22ppm의 콜린(Cho), 3.02ppm의 크레아틴(Cr), 3.53ppm의 미오이노시톨로 식별합니다.
   참고: 대사 산물의 피크 면적 측정은 NAA 대 Cho(NAA/Cho), Cr 대 Cho(Cr/Cho) 및 Myo-Ins 대 Cho(Myo-Ins/Cho)¹⁵의 비율을 계산하는 데 사용됩니다.

6. 혈청 및 대뇌 조직 분석

1. 이전에 발표된 방법에 따라 경동맥 결찰 또는 가짜 절차에 따라 5.5시간에 혈액 샘플링을 수행합니다¹⁸.
2. 4% 이소플루란으로 새끼를 다시 마취합니다.
3. 날카로운 #11 칼날을 사용하여 복부를 절개한 다음 횡격막을 절개하여 심장을 노출시킵니다.
4. 앞서 설명한 바와 같이 심장 천자를 통한 혈액 샘플링을 수행합니다¹⁸. 짧게, 1mL 주사기에 담긴 32G 바늘을 오른쪽 심장실에 삽입하고 1mL의 혈액을 부드럽게 흡인합니다.
5. 전혈이 응고되도록 한 다음 1,000 x g 에서 4°C에서 15분 동안 원심분리합니다. 혈청은 깨끗한 마이크로 원심분리기 튜브로 분리됩니다.
6. 뇌 병리학의 전반적인 평가를 위해 강아지 머리 전체를 참수한 다음 2분 동안 얼음에 담그십시오.
7. 두개골 기저부부터 코 끝까지 등쪽 두피를 절개하고 뇌 주변의 두개골 뼈를 벗겨냅니다. 온전한 뇌 전체를 깨끗한 페트리 접시에 넣는다.
8. 뇌의 오른쪽을 무독성 마커로 표시하십시오. 두부 표면이 위쪽을 향하도록 뇌를 배치하여 양쪽 반구가 모두 보이도록 합니다. 얼음처럼 차가운 면도날을 사용하여 뇌를 관상동맥면과 평행한 4개의 동일한 부분으로 자릅니다.
9. 광과민화를 방지하기 위해 호일로 덮인 페트리 접시에 2,3,5-트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC, 재료 표 참조) 용액에 뇌 부분을 담그고 37°C에서 15분 동안 배양합니다.
   참고: 경색된 영역은 빨간색 TTC 얼룩이 없는 흰색 영역으로 표시됩니다.
10. 경색이 미묘하거나 감지하기 어려운 경우 복부 절개 및 개흉술 후 인산염 완충 식염수에 0.5-1mL의 TTC(1%)를 직접 주입하고 강아지의 목을 베기 전에 2분 동안 관류시킵니다.
11. 추가 분석이 필요한 경우 뇌 조직과 혈청을 -80°C에서 보관하십시오.

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결과

HIE 후 초기 뇌 변화를 생성하고 평가하기 위한 현재 프로토콜은 구현하기 쉬웠고 P10에서 새끼 쥐에서 모욕 후 6시간 이내에 뇌 손상의 총 병리학적 및 방사선학적 시각화가 가능했습니다. 실험 계획은 그림 1에 나와 있습니다. 남녀 모두를 함께 분석했으며, 각 그룹에서 5마리의 새끼에서 24마리의 동물을 검사했습니다. 동물 폐사율은 매우 낮았으며,...

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토론

갓 태어난 새끼 쥐를 대상으로 한 연구 프로토콜은 HIE에서 뇌 손상의 초기 마커를 시각화하고 분석하기 위해 성공적으로 설계되었습니다. 현재까지 신생아 집단에서 조기 뇌 손상을 감지하기 위한 객관적인 평가 도구가 부족합니다. HI 손상 후, 대뇌 산화 대사의 손상이 비가역적인 미토콘드리아 기능 19의 실패 전에 부분적으로 회복될 가능성이 있는 단계(^1-...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal saline	Fisher Scientific	Z1376
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Millipore Sigma	T8877
Abdominal pneumatic pillow	SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mL	Fisher Scientific	501060566
BD 30 G Needle and syringe	Fisher Scientific	Catalog No.14-826-10
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany
Buprenorphine			Provided by veterenary medicine
Compact Thermometer with Probe	Fisher Scientific	S01549
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygen	Airgas
Head surface coil	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Isoflurane gas			Provided by veterenary medicine
Isotemp Immersion Circulator 2100	Fisher Scientific	Discontinued	Immersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing
Lead Ring Flask Weights	VWR	29700-060	Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath
Mathematica Software	Wolfram Research, Champaign, IL, USA	version 6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, Unflavored	Pedialyte		Obtained from CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formula	Millipore Sigma	J67670.AP
Plastic clear bucket			We used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135
Plexiglass Rodent Restraint Chamber	Pedialyte/CVS		Vetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches
Pregnant Sprague Dawley rats at E14	Charles River	Strain Code 400
Purdue Products Betadine Swabsticks	Fisher Scientific	19-061617
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter)	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk Suture	Fisher Scientific	Catalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 suture	Fisher Scientific	NC1985424