使用新生儿缺氧缺血性脑病大鼠模型进行脑损伤的早期病理和磁共振检测

摘要

本方案描述了新生儿缺氧缺血性损伤的啮齿动物模型，用于通过大体形态学和磁共振成像识别脑组织的早期变化。这与现有模型相比有好处，现有模型可用于研究晚期损伤，但不允许评估可重复的早期变化。

摘要

围产期缺氧缺血性脑病 （HIE） 是一种可能折磨新生儿的急性疾病，导致不同的长期和短期神经发育结果。早期诊断对于识别可能从干预中受益的婴儿至关重要;然而，早期诊断在很大程度上依赖于临床标准。没有分子或放射学测试显示检测早期脑损伤的前景。研究表明，磁共振成像 （MRI） 可以显示血流/缺血和代谢破坏的变化。然而，它们都被用于评估损伤发作后疾病的第二阶段 （>12 h）。早期诊断对于符合条件的婴儿快速开始治疗性低温至关重要，目前建议在出生后 6 小时内开始治疗。缺氧缺血性损伤大鼠模型于 1981 年开发，并已得到验证并广泛用于研究脑灌注、脑损伤标志物和形态的变化。然而，它主要用作“晚期模型”，在初始缺血性损伤后数天评估损伤。众所周知，该模型在评估可靠和可重复的早期脑变化方面的敏感性较差。本研究的目的是开发一个可靠的模型，使用病理染色和脑磁共振成像/磁共振波谱研究 HIE 的早期大体形态学和放射学标志物。

引言

缺氧缺血性脑病 （HIE） 是一种由新生儿各种因素引起的破坏性疾病¹。围产期窒息和/或脑血流中断可能导致大脑局灶性或整体缺血性改变²。发病率约为 1.6/1000 活产婴儿，但在发展中国家可能高达每 1000 名活产婴儿 12.1^{例 3}。这种情况导致高死亡率 （20%-50%），而 25% 的幸存者可能患有长期神经残疾，例如智力低下、癫痫或脑瘫⁴。唯一被证明对轻度至中度损伤有效的治疗干预措施是治疗性低温，必须在出生后 6 小时内开始 ^5,6,7,8,9。虽然这可能有助于防止导致继发性损伤的代谢变化，但也可能存在副作用，例如低血压、血小板减少症、凝血时间延长、颅内出血、心律失常、脂肪坏死和血清电解质失衡 ^4,5。婴儿 HIE 的早期诊断通常很困难，因为标准是主观的，并且在很大程度上依赖于随着时间的推移而变化的体格检查结果。磁共振成像可能在受伤后数天至数周显示反映损伤的变化。然而，在多达三分之二的中度脑病中，T1/T2 MRI 的形态学变化可能是正常的，这是最有可能从治疗性低温中受益的婴儿^{类别 10}。根据最近的报道，磁共振波谱 （MRS） 可能显示与新生儿 HIE¹¹ 相关的早期变化。但是，迄今为止尚未进行标准化或验证。

许多研究人员依靠动物模型来评估脑血管损伤的潜在诊断或治疗干预措施。造成梗塞最常用的方法是结扎啮齿动物的大脑中动脉^12,13。虽然通常用于研究成人缺血性中风，但这在新生啮齿动物中具有技术挑战性，因为幼崽的体型小且在与人类新生儿疾病相当的年龄时很脆弱。此外，它并不代表 HIE 中可能出现的整体脑缺血变化。自¹⁹⁸⁰ 年代以来，大鼠单侧颈动脉结扎术的 Rice-Vanucci 模型 14 一直被用作研究缺氧缺血性脑损伤的具有成本效益的啮齿动物模型。然而，早期脑血管变化存在很大变异性，早期实验的死亡率很高。大多数研究报告了长期变化（即受伤 24 小时后）的脑损伤，这些变化更加一致。本研究旨在开发一种评估大鼠 HIE 模型早期 （6 小时内） 分子和放射学变化的方法。该方案旨在确保在早期（足月新生儿等效）年龄缺血并提高幼崽的存活率，尤其是在暴露于缺氧期间。MRI/MRS 用于评估损伤后 6 小时内血流改变、脑组织变化和代谢变化的放射学证据。还对梗死区域进行了粗略的形态学评估。通过在多窝中重复实验来进一步验证可重复性。

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研究方案

所有实验程序均已获得俄克拉荷马医学研究基金会 （OMRF） 机构动物护理和使用委员会（协议 IACUC #17-17）的批准。本研究使用 E14 的怀孕雌性 Sprague-Dawley 大鼠幼崽。这些动物是从商业来源获得的（见 材料表）。

1. 动物准备

1. 在交付窝产前，让动物在动物设施中适应环境。
2. 将所有大鼠维持 a12 小时的光照/暗循环并喂食标准 ratchow。
3. 交付幼崽后，将幼崽与各自的母犬一起饲养。使用两性进行实验。
4. 在出生后 10 岁 （P10），将幼崽随机分配到假组或 HIE 组。
   注意：实验时间表如图 1 所示。所有实验均在同一天在 P10 进行。

2. 实验 HIE 组的颈动脉结扎术 （CAL）

1. 将大鼠幼崽放在加热垫上。
2. 使用鼻锥用 4% 异氟醚的氧气 （0.6 LPM） 开始麻醉，直到捏反射消失。将气体流量降至 0.5%-2% 以维持麻醉。确保幼崽在不抑制呼吸驱动的情况下失去知觉。
3. 在尾巴上标记幼崽以供识别，并用胶带轻轻地束缚它们的四个肢体。
4. 剃掉颈部区域并用 70% 碘 - 聚维酮溶液拭子消毒（参见 材料表）。
5. 使用 #11 刀片，在皮肤上做一个 1 厘米的中线颈部切口。仔细解剖左侧腮腺和筋膜，直到露出左侧颈动脉。使用止血钳轻轻移动血管，将其从筋膜中释放出来。
6. 使用小型止血钳，小心地将两根 5-0 缝合线（见 材料表）绕着血管穿过，相距 0.5 厘米，并将它们系紧。
7. 使用小剪刀剪断两条缝合线之间的动脉，以确保血流不连续。用 5-0 丝缝合线闭合皮肤和筋膜（见 材料表）。
8. 腹膜内注射丁丙诺啡（10 单位在 800 μL 无菌生理盐水中），再皮下注射 800 μL 生理盐水在颈部后部，以防止脱水。
   注意：该过程必须在 10-12 分钟内完成。
9. 将幼崽连同它们的母鼠一起放回笼子里，让幼崽醒来并恢复 1-2 小时。

3. 对照组的假手术

1. 将大鼠幼崽放在加热垫上。
2. 使用鼻锥用 4% 异氟醚的氧气 （0.6 LPM） 开始麻醉，直到捏反射消失。将气体流量降至 0.5%-2% 以维持麻醉。确保幼崽在不抑制呼吸驱动的情况下失去知觉。
3. 在尾巴上标记幼崽以供识别，并用胶带轻轻地束缚它们的四个肢体。
4. 剃掉颈部区域并用 70% 碘聚维酮溶液拭子消毒。
5. 使用 #11 刀片，在皮肤上做一个 1 厘米的中线颈部切口，然后用 5-0 丝缝合线闭合。
6. 遵循与 HI 组相同的补液、镇痛和术后护理（步骤 2.8-2.9）。

4. CAL 组和假手术组的缺氧暴露

1. 通过将管道连接到腔室盖上来准备透明有机玻璃缺氧室（参见 材料表），以提供 6 LPM 的缺氧气体混合物（8% 氧气、92% 氮气）的连续气流。
2. 在腔室中放置一个蓝色的吸水垫，并立即将两组大鼠幼崽放入腔室中。让幼崽在缺氧室中停留 45 分钟。
3. 将腔室浸入水浴中，用持续流动的温水浸泡，以保持腔室内的温度设置为 37 °C。
4. 在放入缺氧室之前， 通过 600 μL 的管饲法用口服盐水溶液对幼仔进行水合，并在 45 分钟结束时加入 600 μL。
5. 将所有幼崽移到带有母马（实验和假）的笼子中，并让它们在小动物成像设施旁边的房间里恢复 2 小时。

5. 磁共振成像和光谱学

1. 在颈动脉结扎结束后 4 小时进行 MRI 和 MRS 以识别和评估放射学和代谢标志物。在麻醉下进行手术，并在小动物成像设施进行持续的心血管监测。
2. 麻醉每只动物（用 1.5% 异氟醚和 0.7 L/min 氧气）并将其仰卧在覆盖加热垫的蓝色吸收垫上的 MR 探针中（参见 材料表）。使用腹部气动枕头连续监测动物的呼吸速率（见 材料表）。
3. 使用头部表面线圈作为信号接收器，并通过正交体积线圈（72 mm 内径，参见 材料表）将射频脉冲传输到样品。
4. 按照先前发表的方法进行 MRI 以评估脑血流量 （CBF） 的变化和水扩散常数 （ADC） 的变化^15、16、17。进行 MRI 形态学（T1 和 T2）、弥散和灌注，以确定大脑受影响最严重和灌注最少的区域。
   注：比较结扎侧和对照侧（完整颈动脉侧）每组中灌注和弥散 （ADC） 的平均值。
5. 按照先前发布的方法^15,17 执行 MRS，并使用 Mathematica 软件使用内部编码程序进行分析（参见材料表）。
6. 通过对照水峰 （4.78 ppm） 进行校准，以百万分率 （ppm） 为单位缩放 MR 谱图。确定主要的脑代谢峰为 2.02 ppm 的 N-乙酰天冬氨酸 （NAA）、3.22 ppm 的胆碱 （Cho）、3.02 ppm 的肌酸 （Cr） 和 3.53 ppm 的肌醇。
   注：代谢物的峰面积测量值用于计算以下比率：NAA 与 Cho （NAA/Cho）、Cr 与 Cho （Cr/Cho） 以及 Myo-Ins 与 Cho （Myo-Ins/Cho）¹⁵。

6. 血清和脑组织分析

1. 根据先前发表的方法，在颈动脉结扎或假手术后 5.5 小时进行血液采样¹⁸。
2. 再次用 4% 异氟醚麻醉幼崽。
3. 使用锋利的 #11 刀片，在腹部切开一个切口，然后做一个横膈膜切口，露出心脏。
4. 如前所述，通过心脏穿刺进行血液采样¹⁸.简而言之，将 1 mL 注射器上的 32 G 针头插入右心腔，轻轻吸出 1 mL 血液。
5. 让全血凝固，然后在 4 °C 下以 1,000 x g 离心 15 分钟。 血清被分离到干净的微量离心管中。
6. 将整个幼犬头部斩首以进行脑病理学的大体评估，然后将其浸入冰中 2 分钟。
7. 在头皮背侧从颅底到鼻尖切开一个切口，然后从大脑周围剥下颅骨。将完整的全脑取出到干净的培养皿中。
8. 用无毒记号笔标记大脑的右侧。将大脑的头侧表面向上放置，以便两个半球都可见。使用冰冷的剃须刀片，将大脑切成平行于冠状平面的四个相等的部分。
9. 将脑切片浸入 2,3,5-三苯基四唑氯化物（TTC，参见 材料表）溶液中，置于覆盖有箔纸的培养皿中，以防止光敏化，并在 37 °C 下孵育 15 分钟。
   注意：梗塞区域被划定为没有红色 TTC 染色的白色区域。
10. 如果梗塞很轻微或难以检测，请在腹部切开和开胸后将 0.5-1 mL TTC （1%） 在磷酸盐缓冲盐水中直接注射到右心中，并在幼犬斩首前灌注 2 分钟。
11. 如果需要进一步分析，请将脑组织和血清储存在 -80 °C。

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结果

目前产生和评估 HIE 后早期脑变化的方案易于实施，并且允许在 P10 大鼠幼崽受损伤后 6 小时内对脑损伤进行粗略的病理和放射学可视化。实验计划如图 1 所示。将两性一起分析，每组检查来自 5 窝的 24 只动物。动物死亡率非常低，在进行终末实验之前，动物存活率为 99%。

CAL 后 6 小时可清晰显示缺血区域，并且在用 TCC 染色的?...

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讨论

成功设计了新生大鼠幼崽的研究方案，以可视化和分析 HIE 中脑损伤的早期标志物。迄今为止，缺乏客观的评估工具来检测新生儿人群的早期脑损伤。HI 损伤后，有一个阶段 （1-6 h），其中脑氧化代谢的损害有可能在线粒体功能衰竭之前部分恢复¹⁹，这是不可逆的。这个潜伏期是神经保护干预的治疗窗口，例如治疗性低温⁶。大多数已发?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal saline	Fisher Scientific	Z1376
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Millipore Sigma	T8877
Abdominal pneumatic pillow	SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mL	Fisher Scientific	501060566
BD 30 G Needle and syringe	Fisher Scientific	Catalog No.14-826-10
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany
Buprenorphine			Provided by veterenary medicine
Compact Thermometer with Probe	Fisher Scientific	S01549
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygen	Airgas
Head surface coil	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Isoflurane gas			Provided by veterenary medicine
Isotemp Immersion Circulator 2100	Fisher Scientific	Discontinued	Immersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing
Lead Ring Flask Weights	VWR	29700-060	Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath
Mathematica Software	Wolfram Research, Champaign, IL, USA	version 6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, Unflavored	Pedialyte		Obtained from CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formula	Millipore Sigma	J67670.AP
Plastic clear bucket			We used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135
Plexiglass Rodent Restraint Chamber	Pedialyte/CVS		Vetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches
Pregnant Sprague Dawley rats at E14	Charles River	Strain Code 400
Purdue Products Betadine Swabsticks	Fisher Scientific	19-061617
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter)	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk Suture	Fisher Scientific	Catalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 suture	Fisher Scientific	NC1985424