JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описана модель гипоксически-ишемического повреждения новорожденных у грызунов для выявления ранних изменений в ткани головного мозга с помощью грубой морфологии и магнитно-резонансной томографии. Это имеет преимущества по сравнению с существующими моделями, которые могут быть использованы для изучения поздней травмы, но не позволяют оценить воспроизводимые ранние изменения.

Аннотация

Перинатальная гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) является острым заболеванием, которое может поражать новорожденных, приводя к различным долгосрочным и краткосрочным исходам развития нервной системы. Ранняя диагностика имеет решающее значение для выявления младенцев, которым может быть полезно вмешательство; Тем не менее, ранняя диагностика в значительной степени зависит от клинических критериев. Молекулярные или радиологические тесты не показали многообещающих результатов в выявлении ранних церебральных повреждений. Исследования показали, что магнитно-резонансная томография (МРТ) может показать изменения как в кровотоке/ишемии, так и в метаболических нарушениях. Тем не менее, все они были использованы для оценки вторичной фазы заболевания (>12 ч) после начала травмы. Ранняя диагностика имеет решающее значение для быстрого начала терапевтической гипотермии у младенцев, соответствующих критериям, которую в настоящее время рекомендуется начинать в течение 6 ч после рождения. Модель гипоксически-ишемического повреждения на крысах была разработана в 1981 году и была валидирована и широко использовалась для изучения изменений в перфузии мозга, маркерах церебрального повреждения и морфологии. Тем не менее, он в основном использовался в качестве «поздней модели» для оценки травмы через несколько дней после первоначального ишемического повреждения. Известно, что модель имеет низкую чувствительность при оценке надежных и воспроизводимых ранних изменений головного мозга. Целью данного исследования была разработка надежной модели для изучения ранних валовых морфологических и радиологических маркеров ГИЭ с использованием патологического окрашивания и магнитно-резонансной томографии головного мозга/магнитно-резонансной спектроскопии.

Введение

Гипоксически-ишемическая энцефалопатия (ГИЭ) является разрушительным состоянием, возникающим в результате воздействия различных факторов у новорожденныхдетей 1. Перинатальная асфиксия и/или нарушение мозгового кровотока могут привести к очаговым или глобальным ишемическим изменениям в головном мозге2. Этот показатель составляет приблизительно 1,6 на 1 000 живорождений, но может достигать 12,1 на 1 000 живорождений в развивающихся странах3. Это состояние приводит к высокой смертности (20%-50%), в то время как 25% выживших, вероятно, будут страдать от долгосрочных нарушений нервной системы, таких как умственная отсталость, эпилепсия или церебральный паралич4. Единственным терапевтическим вмешательством, эффективность которого доказана при травме легкой и средней степени тяжести, является терапевтическая гипотермия, которая должна быть начата в течение 6 ч после рождения 5,6,7,8,9. Хотя это может помочь предотвратить метаболические изменения, которые приводят к вторичному повреждению, также могут существовать побочные эффекты, такие как гипотензия, тромбоцитопения, длительное время свертывания, внутричерепное кровоизлияние, аритмии, жировой некроз и дисбаланс электролитов в сыворотке крови 4,5. Ранняя диагностика ГИЭ у младенцев часто затруднена, поскольку критерии субъективны и в значительной степени зависят от результатов физикального обследования, которые развиваются с течением времени. Магнитно-резонансная томография может показать изменения, отражающие травму, через несколько дней или недель после травмы. Тем не менее, морфологические изменения при МРТ Т1/Т2 могут быть нормальными в двух третях случаев умеренной энцефалопатии, категории младенцев, которые с наибольшей вероятностью получат пользу от терапевтическойгипотермии. Согласно последним данным, магнитно-резонансная спектроскопия (МРС) может показать ранние изменения, коррелирующие с неонатальной ГИЭ11. Тем не менее, до настоящего времени стандартизация или валидация не проводились.

Многие исследователи полагаются на животные модели для оценки потенциальных диагностических или терапевтических вмешательств при цереброваскулярном повреждении. Наиболее часто используемым методом создания инфаркта является перевязка средней мозговой артерии12,13 грызунов. Несмотря на то, что он часто используется для изучения ишемического инсульта у взрослых, технически он сложен у неонатальных грызунов из-за небольшого размера и хрупкости детенышей в возрасте, эквивалентном болезни новорожденного человека. Кроме того, он не отражает глобальные ишемические изменения головного мозга, которые могут наблюдаться при ГИЭ. Модель Райса-Вануччи14 одностороннего перевязки сонной артерии у крыс используется с 1980-х годов в качестве экономически эффективной модели грызунов для изучения гипоксически-ишемического повреждения головного мозга. Тем не менее, существует большая вариабельность ранних цереброваскулярных изменений и высокая смертность в более ранних экспериментах. В большинстве исследований сообщается о черепно-мозговой травме при долгосрочных изменениях (т.е. после 24 ч после травмы), которые являются более последовательными. Целью данного исследования была разработка подхода к оценке ранних (в течение 6 ч) молекулярных и радиологических изменений в модели ГИЭ у крыс. Протокол был разработан для обеспечения ишемии в раннем возрасте (в эквиваленте доношенного новорожденного) и для повышения выживаемости щенков, особенно при воздействии гипоксии. МРТ/МРС использовали для оценки рентгенологических признаков изменения кровотока, изменений мозговой ткани и метаболических изменений в течение 6 ч после травмы. Также была проведена общая морфологическая оценка участков инфаркта. Дальнейшая проверка воспроизводимости была проведена путем повторения экспериментов на нескольких пометах.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждениях Фонда медицинских исследований штата Оклахома (OMRF) (протокол IACUC #17-17). Для настоящего исследования были использованы беременные самки крыс Sprague-Dawley в E14. Животные были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).

1. Подготовка животных

  1. Акклиматизируйте животных в помещении для животных перед доставкой пометов.
  2. Содержать всех крыс на 12 ч светлый/темновой цикл и кормить стандартным ратчатом.
  3. После доставки пометов держите щенков с соответствующими матерями. Используйте для экспериментов представителей обоих полов.
  4. В постнатальном возрасте 10 лет (P10) рандомизируйте щенков в фиктивные группы или группы HIE.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временная шкала эксперимента показана на рисунке 1. Все эксперименты были проведены в один и тот же день на Р10.

2. Лигирование сонной артерии (CAL) в экспериментальной группе HIE

  1. Положите детенышей крыс на грелку.
  2. Инициируйте анестезию 4% изофлураном в кислороде (0,6 л/мин) с помощью носового конуса до тех пор, пока не исчезнет щипковый рефлекс. Снизьте поток газа до 0,5%-2% для поддержания анестезии. Убедитесь, что щенки находятся без сознания, не подавляя дыхательный инстинкт.
  3. Отметьте щенков на хвосте для идентификации и аккуратно зафиксируйте их скотчем на всех четырех конечностях.
  4. Побрейте область шеи и простерилизуйте тампонами с 70% раствором йода и повидона (см. Таблицу материалов).
  5. С помощью лезвия #11 сделайте разрез шеи по средней линии на 1 см через кожу. Тщательно рассеките левую околоушную железу и фасцию до тех пор, пока не обнажится левая сонная артерия. Аккуратно мобилизуйте сосуд с помощью гемостатиков, чтобы освободить его от фасции.
  6. С помощью небольшого гемостата осторожно проденьте два шва 5-0 (см. Таблицу материалов) вокруг сосуда, на расстоянии 0,5 см друг от друга, и плотно завяжите их.
  7. С помощью маленьких ножниц разрежьте артерию между двумя швами, чтобы обеспечить прерывистость кровотока. Закройте кожу и фасцию шелковыми швами 5-0 (см. Таблицу материалов).
  8. Введите бупренорфин (10 единиц в 800 мкл стерильного физиологического раствора) внутрибрюшинно и еще 800 мкл нормального физиологического раствора подкожно в заднюю часть шеи для предотвращения обезвоживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура должна быть завершена в течение 10-12 минут.
  9. Верните щенков в клетки с их самками и дайте им проснуться и восстановиться в течение 1-2 часов.

3. Фиктивная хирургическая процедура для контрольной группы

  1. Положите детенышей крыс на грелку.
  2. Инициируйте анестезию 4% изофлураном в кислороде (0,6 л/мин) с помощью носового конуса до тех пор, пока не исчезнет щипковый рефлекс. Снизьте поток газа до 0,5%-2% для поддержания анестезии. Убедитесь, что щенки находятся без сознания, не подавляя дыхательный инстинкт.
  3. Отметьте щенков на хвосте для идентификации и аккуратно зафиксируйте их скотчем на всех четырех конечностях.
  4. Побрейте область шеи и простерилизуйте тампонами из 70% раствора йода-повидона.
  5. Используя лезвие #11, сделайте разрез по средней линии шеи на 1 см через кожу, а затем закройте его шелковыми швами 5-0.
  6. Соблюдайте ту же гидратацию, обезболивание и послеоперационный уход, что и для группы HI (шаги 2.8-2.9).

4. Подверженность гипоксии как для CAL, так и для фиктивной группы

  1. Подготовьте камеру гипоксии из прозрачного плексигласа (см. Таблицу материалов), прикрепив трубку к крышке камеры для обеспечения непрерывного потока воздуха в объеме 6 литров в минуту газовой смеси гипоксии (8% кислорода, 92% азота).
  2. Поместите в камеру синюю абсорбирующую прокладку и сразу же поместите в нее крысят из обеих групп. Дайте щенкам оставаться в камере гипоксии в течение 45 минут.
  3. Погрузите камеру в водяную баню с непрерывно текущей теплой водой, чтобы поддерживать температуру внутри камеры на уровне 37 °C.
  4. Гидратируйте детенышей пероральным физиологическим раствором через зонд объемом 600 мкл перед помещением в камеру гипоксии и 600 мкл в конце 45 минут.
  5. Переместите всех щенков в клетки с их самками (экспериментальными и фиктивными) и дайте им восстановиться в течение 2 часов в комнате рядом с центром визуализации мелких животных.

5. Магнитно-резонансная томография и спектроскопия

  1. Выполните МРТ и МРС для выявления и оценки радиологических и метаболических маркеров через 4 ч после окончания перевязки сонной артерии. Выполните процедуру под наркозом с непрерывным мониторингом сердечно-сосудистой системы в центре визуализации мелких животных.
  2. Обезболите каждое животное (1,5% изофлурана и 0,7 л/мин кислорода) и поместите его в зонд для МРТ (см. Таблицу материалов) в положении лежа на спине на синей абсорбирующей прокладке, накрывающей грелку. Постоянно контролируйте частоту дыхания животных с помощью брюшной пневматической подушки (см. Таблицу материалов).
  3. В качестве приемника сигнала используйте катушку на поверхности головки и передавайте радиочастотные импульсы на образец через квадратурную объемную катушку (внутренний диаметр 72 мм, см. Таблицу материалов).
  4. Выполните МРТ для оценки как изменений мозгового кровотока (КБТ), так и изменений констант диффузии воды (ADC) в соответствии с ранее опубликованными методами 15,16,17. Выполните морфологию МРТ (Т1 и Т2), диффузию и перфузию, чтобы определить наиболее пораженные и наименее перфузированные участки мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средние значения перфузии и диффузии (АЦП) в каждой группе сравниваются между перевязанной и контрольной сторонами (интактной стороной сонной артерии).
  5. Выполнение MRS в соответствии с ранее опубликованными методами15,17 и анализ с использованием собственной закодированной программы с использованием программного обеспечения системы Mathematica (см. Таблицу материалов).
  6. Масштабируйте МР-спектры в частях на миллион (ppm) путем калибровки относительно водяного пика (4,78 ppm). Определите основные метаболические пики мозга: N-ацетиласпартат (NAA) в дозе 2,02 ppm, холин (Cho) в дозе 3,22 ppm, креатин (Cr) в дозе 3,02 ppm и мио-инозитол в концентрации 3,53 ppm.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения площади пика метаболитов используются для расчета следующих соотношений: NAA к Cho (NAA/Cho), Cr к Cho (Cr/Cho) и Myo-Ins к Cho (Myo-Ins/Cho)15.

6. Анализ сыворотки крови и мозговой ткани

  1. Забор крови проводят через 5,5 ч после перевязки сонной артерии или фиктивной процедуры в соответствии с ранее опубликованными методами18.
  2. Снова обезболите щенков 4% изофлураном.
  3. С помощью острого лезвия #11 сделайте разрез брюшной полости, а затем диафрагмальный разрез, чтобы обнажить сердце.
  4. Выполнение забора крови с помощью пункции сердца, как описано ранее18. Кратко введите иглу 32 г на шприце объемом 1 мл в правую камеру сердца и осторожно отасуньте 1 мл крови.
  5. Дайте цельной крови свернуться, после чего центрифугируйте при 1000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Сыворотка разделяется на чистые микроцентрифужные пробирки.
  6. Обезглавить всю голову щенка для общей оценки церебральной патологии, а затем погрузить ее в лед на 2 мин.
  7. Сделайте разрез на спинной части головы от основания черепа до кончика носа и снимите кости черепа вокруг мозга. Удалите неповрежденный весь мозг в чистую чашку Петри.
  8. Отметьте правое полушарие мозга нетоксичным маркером. Расположите мозг поверхностью головного мозга вверх так, чтобы были видны оба полушария. С помощью ледяного лезвия бритвы разрежьте мозг на четыре равных участка, параллельных корональной плоскости.
  9. Погрузите отделы мозга в раствор 2,3,5-трифенилтетразолия хлорида (ТТС, см. Таблицу материалов) в чашку Петри, накрытую фольгой, для предотвращения фотосенсибилизации и инкубируйте в течение 15 мин при 37 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Участки инфаркта обозначаются белыми участками, лишенными красного пятна TTC.
  10. Если инфаркт слабо выражен или его трудно обнаружить, введите 0,5-1 мл TTC (1%) в фосфатно-солевом буфере непосредственно в правые отделы сердца после разреза брюшной полости и торакотомии и дайте перфузию в течение 2 минут до обезглавливания щенка.
  11. Храните мозговую ткань и сыворотку при температуре −80 °C, если требуется дальнейший анализ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Настоящий протокол для получения и оценки ранних церебральных изменений после ГИЭ был прост в реализации и позволил грубо патологически и рентгенологически визуализировать церебральную травму в течение 6 ч после инсульта у крысят на уровне P10. План эксперимента пред...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Протокол исследования новорожденных крыс был успешно разработан для визуализации и анализа ранних маркеров церебральной травмы при ГИЭ. На сегодняшний день отсутствует объективный инструментарий оценки для выявления ранней черепно-мозговой травмы у новорожденной...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Ни у кого из авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы благодарим ветеринарный персонал Фонда медицинских исследований штата Оклахома за их опыт и помощь в изменении протоколов ухода за животными.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% Normal salineFisher ScientificZ1376
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)Millipore SigmaT8877
Abdominal pneumatic pillowSA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mLFisher Scientific501060566
BD 30 G Needle and syringeFisher ScientificCatalog No.14-826-10
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging systemBruker Biospin, Ettlingen, Germany
BuprenorphineProvided by veterenary medicine
Compact Thermometer with ProbeFisher ScientificS01549
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygenAirgas
Head surface coilBruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Isoflurane gasProvided by veterenary medicine
Isotemp Immersion Circulator 2100Fisher ScientificDiscontinuedImmersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing
Lead Ring Flask WeightsVWR29700-060Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath
Mathematica SoftwareWolfram Research, Champaign, IL, USAversion 6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, UnflavoredPedialyteObtained from CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formulaMillipore SigmaJ67670.AP
Plastic clear bucketWe used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135
Plexiglass Rodent Restraint ChamberPedialyte/CVSVetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches
Pregnant Sprague Dawley rats at E14Charles RiverStrain Code 400
Purdue Products Betadine SwabsticksFisher Scientific19-061617
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter)Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk SutureFisher ScientificCatalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 sutureFisher Scientific NC1985424

Ссылки

  1. Douglas-Escobar, M., Weiss, M. D. Hypoxic-ischemic encephalopathy: A review for the clinician. JAMA Pediatrics. 169 (4), 397-403 (2015).
  2. Bano, S., Chaudhary, V., Garga, U. C. Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy: A radiological review. Journal of Pediatric Neurosciences. 12 (1), 1-6 (2017).
  3. Lee, A. C., et al. Intrapartum-related neonatal encephalopathy incidence and impairment at regional and global levels for 2010 with trends from. Pediatric Research. 74, 50-72 (2013).
  4. American College of Obstetricians and Gynecologists Task Force on Neonatal Encephalopathy. Executive summary: Neonatal encephalopathy and neurologic outcome, second edition. Report of the American College of Obstetricians and Gynecologists Task Force on Neonatal Encephalopathy. Obstetrics & Gynecology. 123 (4), 896-901 (2014).
  5. Jacobs, S. E., et al. Whole-body hypothermia for term and near-term newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy: A randomized controlled trial. Archives of Pediatrics and Adolescent. 165 (8), 692-700 (2011).
  6. Drury, P. P., Gunn, E. R., Bennet, L., Gunn, A. J. Mechanisms of hypothermic neuroprotection. Clinics in Perinatology. 41 (1), 161-175 (2014).
  7. Higgins, R. D., et al. Hypothermia and other treatment options for neonatal encephalopathy: An executive summary of the Eunice Kennedy Shriver NICHD workshop. The Journal of Pediatrics. 159 (5), 851-858 (2011).
  8. Patel, S. D., et al. Therapeutic hypothermia and hypoxia-ischemia in the term-equivalent neonatal rat: characterization of a translational preclinical model. Pediatric Research. 78 (3), 264-271 (2015).
  9. Park, W. S., et al. Hypothermia augments neuroprotective activity of mesenchymal stem cells for neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. PLoS One. 10 (3), 0120893(2015).
  10. Agut, T., et al. Early identification of brain injury in infants with hypoxic ischemic encephalopathy at high risk for severe impairments: Accuracy of MRI performed in the first days of life. BMC Pediatrics. 14, 177(2014).
  11. Guo, L., et al. Early identification of hypoxic-ischemic encephalopathy by combination of magnetic resonance (MR) imaging and proton MR spectroscopy. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 2835-2842 (2016).
  12. Ashwal, S., Cole, D. J., Osborne, S., Osborne, T. N., Pearce, W. J. A new model of neonatal stroke: reversible middle cerebral artery occlusion in the rat pup. Pediatric neurology. 12 (3), 191-196 (1995).
  13. Larpthaveesarp, A., Gonzalez, F. F. Transient middle cerebral artery occlusion model of neonatal stroke in P10 rats. Journal of Visualized Experiments. (122), e54830(2017).
  14. Rice, J. E., Vannucci, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Annals of Neurology. 9 (2), 131-141 (1981).
  15. Bozza, F. A., et al. Sepsis-associated encephalopathy: A magnetic resonance imaging and spectroscopy study. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 30 (2), 440-448 (2010).
  16. Garteiser, P., et al. Multiparametric assessment of the anti-glioma properties of OKN007 by magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 31 (4), 796-806 (2010).
  17. Towner, R. A., et al. Anti-inflammatory agent, OKN-007, reverses long-term neuroinflammatory responses in a rat encephalopathy model as assessed by multi-parametric MRI: implications for aging-associated neuroinflammation. Geroscience. 41 (4), 483-494 (2019).
  18. Adeghe, A. J., Cohen, J. A better method for terminal bleeding of mice. Lab Animal. 20 (1), 70-72 (1986).
  19. Rodriguez, M., Valez, V., Cimarra, C., Blasina, F., Radi, R. Hypoxic-ischemic encephalopathy and mitochondrial dysfunction: Facts, unknowns, and challenges. Antioxiddants & Redox Signaling. 33 (4), 247-262 (2020).
  20. Vannucci, R. C., Towfighi, J. Experimental models of hypothermic circulatory arrest. Seminars in Pediatric Neurology. 6 (1), 48-54 (1999).
  21. Sarkar, S., Barks, J. D. Systemic complications and hypothermia. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 15 (5), 270-275 (2010).
  22. Chiamulera, C., Terron, A., Reggiani, A., Cristofori, P. Qualitative and quantitative analysis of the progressive cerebral damage after middle cerebral artery occlusion in mice. Brain Research. 606 (2), 251-258 (1993).
  23. Hatfield, R. H., Mendelow, A. D., Perry, R. H., Alvarez, L. M., Modha, P. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) as a marker for ischaemic changes in rat brain following permanent middle cerebral artery occlusion. Neuropathology and Applied Neurobiology. 17 (1), 61-67 (1991).
  24. Goldlust, E. J., Paczynski, R. P., He, Y. Y., Hsu, C. Y., Goldberg, M. P. Automated measurement of infarct size with scanned images of triphenyltetrazolium chloride-stained rat brains. Stroke. 27 (9), 1657-1662 (1996).
  25. Robertson, N. J., Thayyil, S., Cady, E. B., Raivich, G. Magnetic resonance spectroscopy biomarkers in term perinatal asphyxial encephalopathy: From neuropathological correlates to future clinical applications. Current Pediatric Reviews. 10 (1), 37-47 (2014).
  26. Gano, D., et al. Evolution of pattern of injury and quantitative MRI on days 1 and 3 in term newborns with hypoxic-ischemic encephalopathy. Pediatric Research. 74 (1), 82-87 (2013).
  27. da Silva, L. F., Hoefel Filho, J. R., Anes, M., Nunes, M. L. Prognostic value of 1H-MRS in neonatal encephalopathy. Pediatric Neurology. 34 (5), 360-366 (2006).
  28. van de Looij, Y., Chatagner, A., Huppi, P. S., Gruetter, R., Sizonenko, S. V. Longitudinal MR assessment of hypoxic ischemic injury in the immature rat brain. Magnetic Resonance in Medicine. 65 (2), 305-312 (2011).
  29. Shibasaki, J., et al. Changes in brain metabolite concentrations after neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy. Radiology. 288 (3), 840-848 (2018).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены