Rilevamento precoce della lesione cerebrale patologica e della risonanza magnetica utilizzando un modello di ratto di encefalopatia ischemica ipossica neonatale

Riepilogo

Il presente protocollo descrive un modello di roditore di danno ipossico-ischemico neonatale per identificare i cambiamenti precoci nel tessuto cerebrale mediante morfologia macroscopica e risonanza magnetica. Ciò ha vantaggi rispetto ai modelli esistenti, che possono essere utilizzati per studiare le lesioni tardive ma non consentono la valutazione di cambiamenti precoci riproducibili.

Abstract

L'encefalopatia ipossico-ischemica perinatale (HIE) è una malattia acuta che può affliggere i neonati, determinando esiti variabili dello sviluppo neurologico a lungo e breve termine. La diagnosi precoce è fondamentale per identificare i neonati che possono beneficiare dell'intervento; Tuttavia, la diagnosi precoce si basa molto su criteri clinici. Nessun test molecolare o radiologico si è dimostrato promettente nel rilevare precocemente il danno cerebrale. Gli studi hanno dimostrato che la risonanza magnetica (MRI) può mostrare cambiamenti sia nel flusso sanguigno/ischemia che nell'interruzione metabolica. Tuttavia, sono stati tutti utilizzati per valutare la fase secondaria della malattia (>12 h) dopo l'insorgenza della lesione. La diagnosi precoce è fondamentale per iniziare rapidamente l'ipotermia terapeutica nei neonati idonei, che attualmente si raccomanda di iniziare entro 6 ore dalla nascita. Il modello di ratto di danno ipossico-ischemico è stato sviluppato nel 1981 ed è stato convalidato e ampiamente utilizzato per studiare i cambiamenti nella perfusione cerebrale, i marcatori di danno cerebrale e la morfologia. Tuttavia, è stato utilizzato principalmente come "modello tardivo", valutando le lesioni diversi giorni dopo l'insulto ischemico iniziale. È noto che il modello ha una scarsa sensibilità nella valutazione di cambiamenti cerebrali precoci affidabili e riproducibili. L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un modello affidabile per studiare i marcatori morfologici e radiologici precoci dell'HIE utilizzando la colorazione patologica e la risonanza magnetica cerebrale/spettroscopia di risonanza magnetica.

Introduzione

L'encefalopatia ipossico-ischemica (HIE) è una condizione devastante derivante da vari fattori nei neonati¹. L'asfissia perinatale e/o l'interruzione del flusso sanguigno cerebrale possono provocare cambiamenti ischemici focali o globali nel cervello². Il tasso di occorrenza è di circa 1,6 su 1.000 nati vivi, ma può arrivare fino a 12,1 su 1.000 nati vivi nei paesi in via di sviluppo³. Questa condizione si traduce in un'elevata mortalità (20%-50%), mentre il 25% di coloro che sopravvivono ha probabilità di soffrire di una disabilità neurale a lungo termine come ritardo mentale, epilessia o paralisi cerebrale⁴. L'unico intervento terapeutico che si è dimostrato efficace nel danno da lieve a moderato è l'ipotermia terapeutica, che deve essere iniziata entro 6 ore dalla nascita 5,6,7,8,9. Sebbene ciò possa aiutare a prevenire i cambiamenti metabolici che portano a lesioni secondarie, potrebbero esserci anche potenziali effetti collaterali come ipotensione, trombocitopenia, tempo di coagulazione prolungato, emorragia intracranica, aritmie, necrosi grassa e squilibrio elettrolitico sierico ^4,5. La diagnosi precoce di HIE nei bambini è spesso difficile in quanto i criteri sono soggettivi e si basano fortemente sui risultati dell'esame fisico, che si evolvono nel tempo. La risonanza magnetica può mostrare cambiamenti che riflettono la lesione da diversi giorni a settimane dopo la lesione. Tuttavia, i cambiamenti morfologici nella risonanza magnetica T1/T2 possono essere normali fino a due terzi dell'encefalopatia moderata, la categoria di neonati che ha maggiori probabilità di beneficiare dell'ipotermia terapeutica¹⁰. Secondo recenti rapporti, la spettroscopia di risonanza magnetica (MRS) può mostrare cambiamenti precoci correlati con l'HIE¹¹ neonatale. Tuttavia, fino ad oggi non è stata eseguita alcuna standardizzazione o convalida.

Molti ricercatori si affidano a modelli animali per valutare potenziali interventi diagnostici o terapeutici per le lesioni cerebrovascolari. Il metodo più frequentemente usato per creare un infarto è la legatura dell'arteria cerebrale media dei roditori ^12,13. Sebbene sia spesso utilizzato per studiare l'ictus ischemico adulto, questo è tecnicamente impegnativo nei roditori neonatali a causa delle piccole dimensioni e della fragilità dei cuccioli all'età equivalente alla malattia neonatale umana. Inoltre, non rappresenta i cambiamenti ischemici cerebrali globali che si possono osservare nell'HIE. Il modello¹⁴ di Rice-Vanucci per la legatura unilaterale dell'arteria carotide nei ratti è stato utilizzato dagli anni '80 come modello di roditore economico per studiare le lesioni cerebrali ipossico-ischemiche. Tuttavia, vi è un'ampia variabilità nelle alterazioni cerebrovascolari precoci e un'elevata mortalità negli esperimenti precedenti. La maggior parte degli studi riporta la lesione cerebrale in cambiamenti a lungo termine (cioè dopo 24 ore di lesione), che sono più coerenti. Questo studio mirava a sviluppare un approccio per valutare i cambiamenti molecolari e radiologici precoci (entro 6 ore) in un modello di ratto di HIE. Il protocollo è stato progettato per garantire l'ischemia in età precoce (equivalente al neonato a termine) e per aumentare la sopravvivenza dei cuccioli, soprattutto durante l'esposizione all'ipossia. La risonanza magnetica/magnetica è stata utilizzata per valutare l'evidenza radiologica di flusso alterato, alterazioni dei tessuti cerebrali e cambiamenti metabolici entro 6 ore dalla lesione. È stata inoltre eseguita una valutazione morfologica macroscopica delle aree dell'infarto. Un'ulteriore convalida della riproducibilità è stata condotta ripetendo gli esperimenti in più cucciolate.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dall'Oklahoma Medical Research Foundation (OMRF) Institutional Animal Care and Use Committee (protocollo IACUC #17-17). Per il presente studio sono stati utilizzati cuccioli di ratto femmina di Sprague-Dawley gravide all'E14. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione degli animali

1. Acclimatare gli animali nella struttura per animali prima della consegna delle cucciolate.
2. Mantenere tutti i ratti su un ciclo luce/buio di 12 ore e nutrire il ratchow standard.
3. Dopo la consegna delle cucciolate, tenere i cuccioli con le rispettive madri. Usa entrambi i sessi per gli esperimenti.
4. All'età postnatale di 10 anni (P10), randomizzare i cuccioli in gruppi sham o HIE.
   NOTA: La cronologia sperimentale è illustrata nella Figura 1. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti lo stesso giorno al P10.

2. Legatura dell'arteria carotidea (CAL) per il gruppo sperimentale HIE

1. Posiziona i cuccioli di ratto su un tappetino riscaldante.
2. Iniziare l'anestesia con isoflurano al 4% in ossigeno (0,6 LPM) utilizzando un cono nasale fino a quando il riflesso di pizzicamento scompare. Ridurre il flusso di gas allo 0,5%-2% per il mantenimento dell'anestesia. Assicurati che i cuccioli siano incoscienti senza sopprimere l'impulso respiratorio.
3. Segna i cuccioli sulla coda per l'identificazione e trattienili delicatamente con del nastro adesivo su tutti e quattro gli arti.
4. Radere la zona del collo e sterilizzare con tamponi di soluzione di iodio e povidone al 70% (vedi Tabella dei materiali).
5. Usando una lama #11, praticare un'incisione del collo di 1 cm attraverso la pelle. Sezionare con cura la ghiandola parotide sinistra e la fascia fino a quando l'arteria carotide sinistra non è esposta. Mobilizzare delicatamente il vaso utilizzando gli emostatici per liberarlo dalla fascia.
6. Utilizzando un piccolo emostato, passare con cautela due punti di sutura 5-0 (vedi Tabella dei materiali) attorno al vaso, a 0,5 cm di distanza, e legarle saldamente.
7. Usando piccole forbici, tagliare l'arteria tra le due suture per garantire la discontinuità del flusso sanguigno. Chiudere la pelle e la fascia con suture di seta 5-0 (vedi Tabella dei materiali).
8. Iniettare buprenorfina (10 unità in 800 μL di soluzione fisiologica normale sterile) per via intraperitoneale e altri 800 μL di soluzione fisiologica normale per via sottocutanea nella parte posteriore del collo per prevenire la disidratazione.
   NOTA: La procedura deve essere completata entro 10-12 minuti.
9. Rimetti i cuccioli nelle gabbie con le loro madri e lascia che i cuccioli si sveglino e si riprendano per 1-2 ore.

3. Procedura chirurgica fittizia per il gruppo di controllo

1. Posiziona i cuccioli di ratto su un tappetino riscaldante.
2. Iniziare l'anestesia con isoflurano al 4% in ossigeno (0,6 LPM) utilizzando un cono nasale fino a quando il riflesso di pizzicamento scompare. Ridurre il flusso di gas allo 0,5%-2% per il mantenimento dell'anestesia. Assicurati che i cuccioli siano incoscienti senza sopprimere l'impulso respiratorio.
3. Segna i cuccioli sulla coda per l'identificazione e trattienili delicatamente con del nastro adesivo su tutti e quattro gli arti.
4. Radere la zona del collo e sterilizzare con tamponi di soluzione di iodio e povidone al 70%.
5. Usando una lama #11, praticare un'incisione del collo di 1 cm attraverso la pelle e poi chiuderla con punti di sutura di seta 5-0.
6. Segui la stessa idratazione, analgesia e cura postoperatoria del gruppo HI (passaggi 2.8-2.9).

4. Esposizione all'ipossia sia per il gruppo CAL che per il gruppo sham

1. Preparare la camera di ipossia in plexiglass trasparente (vedere la Tabella dei materiali) collegando il tubo al coperchio della camera per fornire un flusso d'aria continuo di 6 LPM della miscela di gas ipossia (8% di ossigeno, 92% di azoto).
2. Posiziona un tampone assorbente blu nella camera e posiziona immediatamente i cuccioli di ratto di entrambi i gruppi nella camera. Lasciare che i cuccioli rimangano nella camera dell'ipossia per 45 minuti.
3. Immergere la camera in un bagnomaria con acqua calda che scorre continuamente per mantenere la temperatura impostata a 37 °C all'interno della camera.
4. Idratare i cuccioli con una soluzione salina orale tramite sonda gastrica da 600 μL prima di essere posti nella camera di ipossia e 600 μL alla fine dei 45 minuti.
5. Portate tutti i cuccioli nelle gabbie con le loro madri (sperimentali e finte) e lasciateli riprendersi per 2 ore in una stanza accanto alla struttura di imaging dei piccoli animali.

5. Risonanza magnetica e spettroscopia

1. Eseguire la risonanza magnetica e la risonanza magnetica per identificare e valutare i marcatori radiologici e metabolici 4 ore dopo la fine della legatura dell'arteria carotide. Eseguire la procedura in anestesia con monitoraggio cardiovascolare continuo presso la struttura di imaging per piccoli animali.
2. Anestetizzare ogni animale (con isoflurano all'1,5% e 0,7 L/min di ossigeno) e posizionarlo nella sonda RM (vedi Tabella dei materiali) in posizione supina su un tampone assorbente blu che copre un termoforo. Monitorare continuamente la frequenza respiratoria degli animali utilizzando un cuscino pneumatico addominale (vedi Tabella dei materiali).
3. Utilizzare una bobina di superficie della testa come ricevitore di segnale e trasmettere impulsi a radiofrequenza al campione attraverso una bobina di volume in quadratura (diametro interno 72 mm, vedere la tabella dei materiali).
4. Eseguire la risonanza magnetica per valutare sia le variazioni del flusso sanguigno cerebrale (CBF) che le variazioni delle costanti di diffusione dell'acqua (ADC) seguendo i metodi precedentemente pubblicati 15,16,17. Eseguire la risonanza magnetica della morfologia (T1 e T2), la diffusione e la perfusione per determinare le aree più colpite e meno perfuse del cervello.
   NOTA: I valori medi di perfusione e diffusione (ADC) in ciascun gruppo vengono confrontati tra il lato legato e il lato di controllo (lato dell'arteria carotide intatta).
5. Eseguire la MRS seguendo i metodi^{precedentemente pubblicati 15,17} e analizzare utilizzando un programma codificato internamente utilizzando il software Mathematica (vedi Tabella dei Materiali).
6. Scala gli spettri RM in parti per milione (ppm) calibrando rispetto al picco dell'acqua (4,78 ppm). Identificare i principali picchi metabolici cerebrali come N-acetilaspartato (NAA) a 2,02 ppm, colina (Cho) a 3,22 ppm, creatina (Cr) a 3,02 ppm e mio-inositolo a 3,53 ppm.
   NOTA: Le misurazioni dell'area di picco dei metaboliti vengono utilizzate per calcolare i seguenti rapporti: NAA a Cho (NAA/Cho), Cr a Cho (Cr/Cho) e Myo-Ins a Cho (Myo-Ins/Cho)¹⁵.

6. Analisi del siero e dei tessuti cerebrali

1. Eseguire il prelievo di sangue a 5,5 ore dopo la legatura dell'arteria carotide o la procedura di simulazione secondo i metodi precedentemente pubblicati¹⁸.
2. Anestetizzare nuovamente i cuccioli con isoflurano al 4%.
3. Usando una lama affilata #11, fai un'incisione addominale, seguita da un'incisione diaframmatica per esporre il cuore.
4. Eseguire il prelievo di sangue tramite puntura cardiaca come descritto in precedenza¹⁸. Inserire brevemente un ago da 32 G su una siringa da 1 ml nella camera cardiaca destra e aspirare delicatamente 1 ml di sangue.
5. Lasciare coagulare il sangue intero, quindi centrifugare a 1.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Il siero viene separato in provette da microcentrifuga pulite.
6. Decapitare l'intera testa del cucciolo per la valutazione grossolana della patologia cerebrale e poi immergerla nel ghiaccio per 2 minuti.
7. Fai un'incisione sul cuoio capelluto dorsale dalla base del cranio alla punta del naso e stacca le ossa del cranio intorno al cervello. Rimuovi l'intero cervello intatto in una capsula di Petri pulita.
8. Segna il lato destro del cervello con un marcatore non tossico. Posizionare il cervello con la superficie cefalica verso l'alto in modo che entrambi gli emisferi siano visibili. Usando una lama di rasoio ghiacciata, taglia il cervello in quattro sezioni uguali parallele al piano coronale.
9. Immergere le sezioni cerebrali in una soluzione di cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC, vedi Tabella dei materiali) in una capsula di Petri coperta con un foglio di alluminio per prevenire la fotosensibilizzazione e incubare per 15 minuti a 37 °C.
   NOTA: Le aree infartuate sono delineate come aree bianche prive di colorazione TTC rossa.
10. Se gli infarti sono sottili o difficili da rilevare, iniettare 0,5-1 ml di TTC (1%) in soluzione salina tamponata con fosfato direttamente nel cuore destro dopo l'incisione addominale e la toracotomia e lasciare perfondere per 2 minuti prima della decapitazione del cucciolo.
11. Conservare il tessuto cerebrale e il siero a -80 °C se sono necessarie ulteriori analisi.

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Risultati

L'attuale protocollo per produrre e valutare i cambiamenti cerebrali precoci dopo HIE è stato facile da implementare e ha consentito la visualizzazione patologica e radiologica macroscopica del danno cerebrale entro 6 ore dall'insulto nei cuccioli di ratto a P10. Il piano sperimentale è illustrato nella Figura 1. Entrambi i sessi sono stati analizzati insieme e in ciascun gruppo sono stati esaminati 24 animali di cinque cucciolate. La mortalità animale è...

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Discussione

Un protocollo di ricerca in cuccioli di ratto appena nati è stato progettato con successo per visualizzare e analizzare i marcatori precoci di danno cerebrale nell'HIE. Ad oggi, mancano strumenti di valutazione oggettiva per rilevare precocemente il danno cerebrale nella popolazione neonatale. Dopo la lesione HI, c'è una fase (1-6 ore) in cui la compromissione del metabolismo ossidativo cerebrale ha il potenziale per recuperare parzialmente prima del fallimento della funzione mitocondr...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal saline	Fisher Scientific	Z1376
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Millipore Sigma	T8877
Abdominal pneumatic pillow	SA Instruments, Inc., Stony Brook, NY
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier, 58.4 x 91.4 cm, 680 mL	Fisher Scientific	501060566
BD 30 G Needle and syringe	Fisher Scientific	Catalog No.14-826-10
Biospec 7.0 Tesla/30 cm horizontal-bore magnet small animal imaging system	Bruker Biospin, Ettlingen, Germany
Buprenorphine			Provided by veterenary medicine
Compact Thermometer with Probe	Fisher Scientific	S01549
Gas mixture 92% nitrogen 8% oxygen	Airgas
Head surface coil	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Isoflurane gas			Provided by veterenary medicine
Isotemp Immersion Circulator 2100	Fisher Scientific	Discontinued	Immersed in water bath chamber with continous flowing water via tubing
Lead Ring Flask Weights	VWR	29700-060	Water bath weights to ensure rodent chamber stays submerged in water bath
Mathematica Software	Wolfram Research, Champaign, IL, USA	version 6.0
Pedialyte Electrolyte Solution, Hydration Drink, 1 Liter, Unflavored	Pedialyte		Obtained from CVS
Phosphate-buffered saline (DPBS, 1X), Dulbecco's formula	Millipore Sigma	J67670.AP
Plastic clear bucket			We used an old rodent housing cage- this is a good alternative: Cambro 182615CW135 Camwear Food Storage Box, 18" X 26" X 15", Model #:182615CW135
Plexiglass Rodent Restraint Chamber	Pedialyte/CVS		Vetinary medicine provided a small chamber used to restrain rodents. Approximately 6x4x4 inches
Pregnant Sprague Dawley rats at E14	Charles River	Strain Code 400
Purdue Products Betadine Swabsticks	Fisher Scientific	19-061617
Quadrature volume coil (72-mm inner diameter)	Bruker BioSpin MRI Gmbh, Ettlingen, Germany
Stoelting Silk Suture	Fisher Scientific	Catalog No.10-000-656
Vicryl 5-0 suture	Fisher Scientific	NC1985424