In vivo Medición luminal de la liberación urotelial de ATP evocada por distensión en roedores

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para medir las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga en un roedor anestesiado.

Resumen

Se cree que el ATP, liberado del urotelio en respuesta a la distensión de la vejiga, desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción. Por lo tanto, la medición precisa de la liberación urotelial de ATP en un entorno fisiológico es un primer paso importante en el estudio de los mecanismos que controlan la señalización purinérgica en la vejiga urinaria. Las técnicas existentes para estudiar la liberación urotelial de ATP evocada mecánicamente utilizan células cultivadas en soportes flexibles o tejido vesical fijado en cámaras de Ussing; Sin embargo, cada una de estas técnicas no emula completamente las condiciones en la vejiga intacta. Por lo tanto, se desarrolló una configuración experimental para medir directamente las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga urinaria de roedor.

En esta configuración, las vejigas de los roedores anestesiados se perfunden a través de catéteres tanto en la cúpula de la vejiga como a través del orificio uretral externo. La presión en la vejiga aumenta al tapar el catéter uretral mientras se perfunde líquido estéril en la vejiga a través de la cúpula. La medición de la presión intravesical se logra utilizando un transductor de presión conectado al catéter domo de la vejiga, similar a la configuración utilizada para la cistometría. Una vez que se alcanza la presión deseada, se retira la tapa del catéter uretral y se recoge líquido para la cuantificación de ATP mediante el ensayo de luciferina-luciferasa. A través de esta configuración experimental, los mecanismos que controlan la estimulación mecánica y química de la liberación urotelial de ATP pueden ser interrogados mediante la inclusión de varios agonistas o antagonistas en el perfusiónto o mediante la comparación de los resultados entre animales salvajes y genéticamente modificados.

Introducción

Se cree que el ATP urinario desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción¹. Por ejemplo, se cree que el ATP se libera del urotelio en respuesta a la distensión donde puede actuar sobre los receptores sobre los nervios aferentes de la vejiga para aumentar su excitabilidad, dando lugar a sensaciones de plenitud². Por lo tanto, también se piensa que el ATP urinario podría ser un jugador importante en el desarrollo de patologías de la vejiga. En apoyo de esta hipótesis, las concentraciones urinarias de ATP están significativamente aumentadas en pacientes con vejiga hiperactiva (VH)³, síndrome de dolor vesical/cistitis intersticial (BPS/IC)⁴ o infección urinaria (ITU)^5,6, todas ellas condiciones caracterizadas por mayor urgencia, frecuencia y, a veces^, dolor. Por el contrario, se ha demostrado que los pacientes que sufren de vejiga hipoactiva (BAU), que se caracteriza por una incapacidad para vaciar la vejiga y a veces puede incluir una disminución de la capacidad para detectar la plenitud de la vejiga, tienen concentraciones urinarias de ATP disminuidas⁷. Experimentalmente, la manipulación de las concentraciones urinarias de ATP puede alterar los reflejos vesicales en la rata; El aumento de las concentraciones de ATP mediante el bloqueo de las ATPasas endógenas en la luz de la vejiga puede aumentar la frecuencia miccional, mientras que la disminución de las concentraciones de ATP mediante la instilación de ATPasas exógenas en la vejiga reduce la frecuencia miccional⁸. Por lo tanto, la importancia del ATP urinario para la función de la vejiga es clara.

Dada la aparente importancia del ATP urinario para la patología de la vejiga, la medición precisa de la liberación urotelial de ATP es un paso importante para comprender los mecanismos que controlan la liberación. Se han completado muchos estudios utilizando diferentes modelos experimentales para medir la liberación urotelial de ATP. Los más importantes son los cultivos celulares, ya sean cultivos primarios o líneas celulares. Sin embargo, el uso de células uroteliales cultivadas se complica por el hecho de que las células uroteliales no adquieren su morfología fisiológica polarizada a menos que se cultiven en membranas permeables especiales (como la tecnología Transwell [insertos de pozo])⁹. Por lo tanto, es difícil relacionar cualquier liberación de ATP medida con la fisiología. Las células uroteliales cultivadas en insertos de pozos pueden polarizarse y formar una barrera similar a lo que se ve in vivo; Sin embargo, el crecimiento de un urotelio completamente diferenciado puede tardar días o semanas. Además, si bien es posible montar inserciones de pozo en una cámara de Ussing y aplicar presión al lado apical para causar estiramiento, es difícil aplicar suficiente presión para imitar las condiciones dentro de la vejiga durante la patología (es decir, presiones de 30 cm H₂O o más). El tejido de toda la vejiga también se puede montar en una cámara de Ussing para experimentos de estiramiento, pero esto elimina la vejiga del organismo junto con los factores tróficos que mantienen la salud de las células uroteliales y, por lo tanto, la función de barrera urotelial. Por lo tanto, la forma fisiológicamente más relevante de estudiar la liberación de ATP del urotelio en respuesta al estiramiento o la presión es in vivo. Las técnicas quirúrgicas necesarias para establecer el experimento son idénticas a las comúnmente utilizadas en la cistometría animal y, por lo tanto, deben ser realizadas fácilmente por cualquier persona familiarizada con esa técnica.

En este protocolo, describiremos la técnica utilizada para examinar el ATP luminal en ratas hembras Sprague Dawley que pesan aproximadamente 200-250 g, ya que el cateterismo transuretral descrito a continuación es mucho más fácil en hembras; Sin embargo, el cateterismo transuretral también puede ser realizado en roedores machos¹⁰. Como el cateterismo transuretral también se ha realizado en ratones de ambos sexos¹¹, estos experimentos pueden adaptarse fácilmente para ratones o ratas de cualquier sexo o de diferentes tamaños, dependiendo de las necesidades del equipo de investigación.

Protocolo

Todos los procedimientos llevados a cabo en roedores deben cumplir con las pautas aplicables y ser aprobados por el comité local de revisión de ética institucional. Los experimentos realizados para este manuscrito se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh. Consulte la Figura 1 para obtener una versión modificada de la configuración estándar de cistometría de roedores utilizada en este protocolo.

1. Animales de laboratorio

1. Mantener a las ratas en viviendas sociales (múltiples roedores en una jaula) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y acceso ad libitum a agua y pellets de comida.

2. Anestesia y bloqueo ganglionar

1. Inducir la anestesia inicial colocando al animal en una caja cerrada gaseada con isoflurano al 4%-5% en_O2 (1 L/min).
2. Anestesiar al animal usando uretano.
   1. Inyectar uretano por vía subcutánea bilateralmente (1/2 dosis en cada lado del animal) a una dosis de 1,2 g/kg. Coloque al animal en una jaula para permitir que el uretano haga efecto, lo que generalmente toma 2 h.
   2. Alternativamente, administre uretano por vía intraperitoneal (i.p.) inyectando la dosis completa en dos dosis separadas ~ 10 min de diferencia.
3. Después de esperar el momento adecuado para que el uretano haga efecto (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), pruebe un plano adecuado de anestesia pellizcando el pie del animal con fórceps. Si se observa un reflejo, administre una dosis adicional de uretano (0.05-0.1 ml i.p.), espere 15 min y vuelva a realizar la prueba. Continúe monitoreando al animal para el plano adecuado de anestesia durante todo el procedimiento.
4. Para evitar una contracción de la vejiga durante la distensión, inyecte al animal un agente bloqueador ganglionar, como hexametonio (20 mg / kg, i.p.).
5. Aplique ungüento oftálmico en los ojos del animal para evitar que se seque durante el experimento.

3. Procedimiento quirúrgico: cateterismo vesical suprapúbico

1. Afeitar el abdomen del animal y realizar una laparotomía de línea media para exponer la vejiga urinaria.
2. Prepare un catéter quemando un extremo de un tubo intramédico PE50 de longitud corta (~10-15 cm) con una llama. Coloque una aguja de 22 G en el otro extremo del tubo y llénela con solución de Krebs (consulte la Tabla de materiales para la composición).
3. Coloque un pequeño lazo de sutura de seda 3-0 sobre la cúpula de la vejiga y realice una pequeña cistostomía (usando tijeras finas o una aguja de 18 G) lo suficientemente grande como para insertar el extremo ensanchado del catéter hecho arriba. Con una mano sosteniendo el catéter en su lugar, use la otra mano para apretar el asa de la sutura para asegurar el catéter en su lugar. Termine de asegurar el catéter atando dos nudos en la sutura y tirando del catéter hacia atrás hasta que la cabeza ensanchada esté en contacto con la pared de la vejiga.
   1. Alternativamente, asegure el catéter utilizando una técnica clásica de sutura con cuerdas de bolso, como se describió anteriormente para la cistometría¹².
      NOTA: Es imperativo no introducir burbujas de aire en la vejiga durante este procedimiento.
4. Pruebe la configuración para detectar fugas infundiendo una pequeña cantidad de solución de Krebs a través del catéter. Si el líquido se escapa de la cistostomía, vuelva a asegurar el catéter con sutura adicional alrededor de la cistostomía.

4. Cateterismo transuretral

1. Sumerja el extremo de un catéter intravenoso de 20 G x 1" (sin la aguja) en lubricante quirúrgico.
2. Sostenga suavemente el meato uretral externo con un par de fórceps e inserte la punta del catéter en el orificio uretral en la dirección de la cola hasta que la punta haga que la pared de la abertura vaginal adyacente se deforme. Gire el catéter 90° (llevando el extremo Luer-Lock del catéter hacia la cola) y avance suavemente. Inserte completamente el catéter hasta que el cubo Luer-Lock esté aproximadamente a 5 mm distal de la abertura uretral externa.
   NOTA: No inserte el catéter demasiado lejos, ya que puede hacer que la punta pinche la pared interior de la vejiga. Si se siente resistencia al avanzar el catéter, deténgase y comience de nuevo o corra el riesgo de perforar la uretra. Consulte la sección de discusión sobre consejos para aumentar el éxito del cateterismo.
3. Asegure el catéter y evite fugas alrededor del catéter enrollando una longitud corta de sutura de seda 3-0 alrededor del meato uretral externo y átelo firmemente. Asegure el catéter a la cola con cinta adhesiva para evitar que se saque accidentalmente.
4. Una vez cateterizado, infunda suavemente la solución de Krebs en la vejiga a través del catéter suprapúbico de la vejiga y confirme que el líquido fluye fuera del catéter uretral y no alrededor de él. Si es necesario, vuelva a colocar la sutura alrededor del orificio uretral externo.
5. Cierre la incisión abdominal sobre la vejiga con una sutura de seda 3-0.

5. Configuración experimental

1. Asegure al animal en una tabla capaz de inclinarse para ayudar en el drenaje del líquido intravesical a través del catéter uretral. Coloque una almohadilla térmica y una almohadilla absorbente entre el animal y la tabla para mantener el calor corporal y absorber el líquido que drena del catéter uretral.
2. Conecte el catéter suprapúbico a una llave de paso de tres vías, que conecta el catéter a una bomba de jeringa y un transductor de presión. Conecte el transductor de presión a una computadora por medio de un amplificador y un sistema de adquisición de datos.
   NOTA: Se debe tener cuidado para evitar que se formen burbujas de aire en el tubo que conecta la bomba de jeringa, el transductor y el catéter vesical.
3. Calibre el registro de la presión de la vejiga utilizando el procedimiento sugerido por el fabricante del transductor de presión y/o del software de adquisición de datos.
4. Infundir la solución de Krebs a través del catéter suprapúbico a una velocidad de 0,1 ml/min y dejar que el líquido drene del catéter uretral durante 1 h para eliminar cualquier ATP residual liberado durante los implantes del catéter.
5. Después de este período de lavado, tapa el catéter uretral con un tapón Luer-Lock y mide la presión en la vejiga. Busque un aumento lento de la presión intravesical a una presión de 30 cm_H2Osin un aumento brusco de la presión, lo que indicaría una contracción de la vejiga (ver Figura 2). Retire el tapón del catéter uretral cuando la presión alcance los 30 cm de_H2Opara evitar daños en la vejiga.
   NOTA: Si las contracciones de la vejiga continúan ocurriendo después de 1 h, administre una dosis adicional de hexametonio (dosis de 5 mg/kg i.p.).

6. Recogida de muestras

1. Infundir la vejiga a 0,1 ml/min y recoger el elueido del catéter uretral. Pruebe inmediatamente las alícuotas de 100 μL del eluido para detectar ATP (véase más adelante) o congele para la posterior cuantificación del lote.
2. Para probar el efecto de la distensión vesical en las concentraciones luminales de ATP, tapa el catéter uretral con el tapón y monitorea la presión de la vejiga hasta que alcance el nivel deseado. Luego, destape el catéter uretral y recoja el eluyido para la medición o congelación de ATP, como se describió anteriormente.
3. Después de cada distensión, deje que la vejiga descanse y se lave durante 10-15 minutos antes de tomar muestras adicionales. Tome un total de 3-5 muestras de predistensión y 3-5 muestras a cada presión de distensión deseada para demostrar la repetibilidad.
4. Para probar el efecto de los medicamentos en la liberación de ATP, cambie la solución de Krebs que infunde la vejiga a Krebs que contiene el medicamento de elección. Perfundir a 0,1 ml/min durante 10-15 min para que el fármaco tenga un efecto, y luego recoger las muestras de vejigas no distendidas y distendidas como se describe en los pasos 6.1 y 6.2.

7. Cuantificación de ATP a partir de muestras recogidas

1. Cuantificar ATP en las muestras de 100 μL recolectadas utilizando un kit de ensayo de luciferina / luciferasa disponible comercialmente siguiendo las instrucciones del fabricante y un luminómetro.
   1. Para cuantificar el ATP, combine muestras de 100 μL de perfusión con 50 μL de la mezcla de ensayo y colóquelas en el luminómetro para su lectura. Para convertir las unidades de luz relativa (RLU) informadas por el luminómetro a una concentración de ATP, realice diluciones seriadas de ATP en solución de Krebs que van de 1 μM a 10 pM en diluciones de 10 veces para crear una curva estándar y léalas en el luminómetro. Trazar las lecturas resultantes en un gráfico y realizar una regresión no lineal (cuadrática) para extrapolar las concentraciones de las muestras tomadas del animal.
      NOTA: Es importante hacer estándares de ATP para cualquier solución farmacológica probada en el experimento, ya que muchos medicamentos interfieren con la reacción luciferina / luciferasa, que debe corregirse.

8. Eutanasia de animales

1. Cuando se complete el experimento y se recojan todas las muestras, sacrificar humanamente al animal de acuerdo con las pautas del USDA y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación.
   1. Retire al animal anestesiado de la configuración experimental, colóquelo en una caja cerrada y gaseo con 100% de_CO2. Asegúrese de que la tasa de llenado sea igual al 30% -70% del volumen de la cámara por minuto (por ejemplo, 3-7 L / min para una caja con un volumen de 10 L). Continúe el flujo de_CO2 durante al menos 1 minuto después de que cese la respiración.
2. Use una forma secundaria de eutanasia para asegurar la muerte.
   1. Realice una toracotomía como una forma secundaria de eutanasia agarrando el pequeño colgajo de piel en el extremo caudal del esternón y cortando un pequeño agujero en la piel y la musculatura en el diafragma con un par de tijeras afiladas. Complete la toracotomía insertando las tijeras en la abertura y cortando rostralmente a través de la caja torácica y exponiendo la cavidad torácica.
      NOTA: El animal sacrificado debe ser eliminado de acuerdo con las directrices institucionales.

Resultados

El protocolo descrito permite la medición precisa de la liberación urotelial de ATP in vivo desde el lumen de la vejiga, utilizando una versión modificada de la configuración estándar de cistometría de roedores (ver Figura 1). Esto permite al investigador examinar los efectos de los fármacos en la liberación de ATP mediada por estiramiento en un entorno fisiológico.

Discusión

La mayor parte de la investigación sobre la liberación urotelial de ATP se lleva a cabo en células cultivadas, utilizando líneas celulares inmortalizadas o cultivos primarios de células uroteliales de roedores. Si bien estos modelos tienen la ventaja de tener un rendimiento relativamente alto (es decir, un cultivo / pasaje puede hacer muchas placas / platos de células), su relevancia fisiológica disminuye debido a: 1) la incapacidad de las células uroteliales para crecer polarizadas a menos que se cultiven en sop...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose