In vivo Medición luminal de la liberación urotelial de ATP evocada por distensión en roedores

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para medir las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga en un roedor anestesiado.

Resumen

Se cree que el ATP, liberado del urotelio en respuesta a la distensión de la vejiga, desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción. Por lo tanto, la medición precisa de la liberación urotelial de ATP en un entorno fisiológico es un primer paso importante en el estudio de los mecanismos que controlan la señalización purinérgica en la vejiga urinaria. Las técnicas existentes para estudiar la liberación urotelial de ATP evocada mecánicamente utilizan células cultivadas en soportes flexibles o tejido vesical fijado en cámaras de Ussing; Sin embargo, cada una de estas técnicas no emula completamente las condiciones en la vejiga intacta. Por lo tanto, se desarrolló una configuración experimental para medir directamente las concentraciones de ATP en la luz de la vejiga urinaria de roedor.

En esta configuración, las vejigas de los roedores anestesiados se perfunden a través de catéteres tanto en la cúpula de la vejiga como a través del orificio uretral externo. La presión en la vejiga aumenta al tapar el catéter uretral mientras se perfunde líquido estéril en la vejiga a través de la cúpula. La medición de la presión intravesical se logra utilizando un transductor de presión conectado al catéter domo de la vejiga, similar a la configuración utilizada para la cistometría. Una vez que se alcanza la presión deseada, se retira la tapa del catéter uretral y se recoge líquido para la cuantificación de ATP mediante el ensayo de luciferina-luciferasa. A través de esta configuración experimental, los mecanismos que controlan la estimulación mecánica y química de la liberación urotelial de ATP pueden ser interrogados mediante la inclusión de varios agonistas o antagonistas en el perfusiónto o mediante la comparación de los resultados entre animales salvajes y genéticamente modificados.

Introducción

Se cree que el ATP urinario desempeña un papel sensorial significativo en el control de la micción¹. Por ejemplo, se cree que el ATP se libera del urotelio en respuesta a la distensión donde puede actuar sobre los receptores sobre los nervios aferentes de la vejiga para aumentar su excitabilidad, dando lugar a sensaciones de plenitud². Por lo tanto, también se piensa que el ATP urinario podría ser un jugador importante en el desarrollo de patologías de la vejiga. En apoyo de esta hipótesis, las concentraciones urinarias de ATP están significativamente aumentadas en pacientes con vejiga hiperactiva (VH)^3....

Protocolo

Todos los procedimientos llevados a cabo en roedores deben cumplir con las pautas aplicables y ser aprobados por el comité local de revisión de ética institucional. Los experimentos realizados para este manuscrito se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad de Pittsburgh. Consulte la Figura 1 para obtener una versión modificada de la configuración estándar de cistometría de roedores utilizada en este protocolo.

Resultados

El protocolo descrito permite la medición precisa de la liberación urotelial de ATP in vivo desde el lumen de la vejiga, utilizando una versión modificada de la configuración estándar de cistometría de roedores (ver Figura 1). Esto permite al investigador examinar los efectos de los fármacos en la liberación de ATP mediada por estiramiento en un entorno fisiológico.

Discusión

La mayor parte de la investigación sobre la liberación urotelial de ATP se lleva a cabo en células cultivadas, utilizando líneas celulares inmortalizadas o cultivos primarios de células uroteliales de roedores. Si bien estos modelos tienen la ventaja de tener un rendimiento relativamente alto (es decir, un cultivo / pasaje puede hacer muchas placas / platos de células), su relevancia fisiológica disminuye debido a: 1) la incapacidad de las células uroteliales para crecer polarizadas a menos que se cultiven en sop.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose