インビボ げっ歯類における膨満誘発性尿路上皮ATP放出の内腔測定

要約

このプロトコルは、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を測定するための手順を説明しています。

要約

膀胱膨満に応答して尿路上皮から放出されるATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられている。したがって、生理学的設定での尿路上皮ATP放出の正確な測定は、膀胱内のプリン作動性シグナル伝達を制御するメカニズムを研究する上で重要な最初のステップです。機械的に誘発される尿路上皮ATP放出を研究するための既存の技術は、柔軟な支持体またはUssingチャンバーに固定された膀胱組織に播種された培養細胞を利用します。ただし、これらの各手法は、無傷の膀胱の状態を完全にはエミュレートしません。したがって、げっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を直接測定するための実験装置が開発された。

この設定では、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱は、膀胱の ドームと外 尿道開口部の両方のカテーテルを介して灌流されます。膀胱内の圧力は、尿道カテーテルをキャップしながら、ドームを介して滅菌液を膀胱に灌流することによって増加します。膀胱内圧の測定は、膀胱測定に使用されるセットアップと同様に、膀胱ドームカテーテルに取り付けられた圧力トランスデューサを使用して行われます。所望の圧力に達すると、尿道カテーテルのキャップが取り外され、ルシフェリン-ルシフェラーゼアッセイによるATP定量のために液体が収集されます。この実験セットアップを通じて、尿路上皮ATP放出の機械的および化学的刺激の両方を制御するメカニズムは、灌流液にさまざまなアゴニストまたはアンタゴニストを含めることによって、または野生型動物と遺伝子組み換え動物の結果を比較することによって調べることができます。

概要

尿中ATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられています¹。例えば、ATPは膨満に応答して尿路上皮から放出され、膀胱求心性神経の受容体に作用して興奮性を高め、満腹感をもたらすと考えられています²。したがって、尿中ATPは膀胱病変の発症において重要なプレーヤーである可能性があるとも考えられています。この仮説を支持するために、尿中ATP濃度は、過活動膀胱(OAB)³、膀胱痛症候群/間質性膀胱炎(BPS / IC)⁴、または尿路感染症(UTI)^5,6に苦しむ患者で有意に増加します。逆に、膀胱を空にすることができないことを特徴とし、時には膀胱の満腹感を感知する能力の低下を含むことがある低活動膀胱(UAB)に苦しむ患者は、尿中ATP濃度が低下していることが示されています⁷。実験的には、尿中ATP濃度の操作はラットの膀胱反射を変化させる可能性があります。膀胱内腔の内因性ATPアーゼを遮断することによってATP濃度を増加させると排尿頻度を増加させることができ、一方、外因性ATPアーゼを膀胱に注入することによってATP濃度を低下させると排尿頻度が低下する

プロトコル

げっ歯類で行われるすべての手順は、該当するガイドラインに準拠し、地元の施設倫理審査委員会によって承認されなければなりません。この原稿のために行われた実験は、実験動物の世話と使用のための全米研究評議会のガイドに従って実施され、ピッツバーグ大学医学部の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用される標準的なげっ歯類の膀胱測定セットアップの修正バージョンについては 、図1 を参照してください。

1.実験動物

1. ラットを公営住宅(1つのケージに複数のげっ歯類)で維持し、12時間の明暗サイクルと水と食物ペレットへの 自由 アクセスを維持します。

2.麻酔と神経節ブロック

1. 動物をO₂ (1 L / min)の4%-5%イソフルランでガスを飲んだ密閉ボックスに入れることにより、初期麻酔を誘発します。.
2. ウレタンを使用して動物を麻酔します。
   1. ウレタンを両側に皮下注射します(動物の両側に1/2用量)1.2 g / kgの用量で。動物をケージに入れてウレタンを有効にし、通常2時間かかります。
   2. あるいは、ウレタンを腹腔内(i.p.)に投....

結果

記載されたプロトコルは、標準的なげっ歯類の膀胱測定セットアップの修正バージョンを使用して、膀胱の内腔からのin vivo での尿路上皮ATP放出の正確な測定を可能にする( 図1を参照)。これにより、研究者は生理学的設定でのストレッチ媒介ATP放出に対する薬物の効果を調べることができます。

ディスカッション

尿路上皮ATP放出に関する研究の大部分は、不死化細胞株またはげっ歯類の尿路上皮細胞の初代培養のいずれかを使用して、培養細胞で行われます。これらのモデルには、スループットが比較的高いという利点がありますが(つまり、1回の培養/継代で細胞のプレート/皿を多数作成できます)、生理学的関連性は、1)尿路上皮細胞が特別な支持体上で増殖しない限り分極的に増殖できないこと、お.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose