インビボ げっ歯類における膨満誘発性尿路上皮ATP放出の内腔測定

要約

このプロトコルは、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を測定するための手順を説明しています。

要約

膀胱膨満に応答して尿路上皮から放出されるATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられている。したがって、生理学的設定での尿路上皮ATP放出の正確な測定は、膀胱内のプリン作動性シグナル伝達を制御するメカニズムを研究する上で重要な最初のステップです。機械的に誘発される尿路上皮ATP放出を研究するための既存の技術は、柔軟な支持体またはUssingチャンバーに固定された膀胱組織に播種された培養細胞を利用します。ただし、これらの各手法は、無傷の膀胱の状態を完全にはエミュレートしません。したがって、げっ歯類の膀胱の内腔におけるATP濃度を直接測定するための実験装置が開発された。

この設定では、麻酔をかけたげっ歯類の膀胱は、膀胱の ドームと外 尿道開口部の両方のカテーテルを介して灌流されます。膀胱内の圧力は、尿道カテーテルをキャップしながら、ドームを介して滅菌液を膀胱に灌流することによって増加します。膀胱内圧の測定は、膀胱測定に使用されるセットアップと同様に、膀胱ドームカテーテルに取り付けられた圧力トランスデューサを使用して行われます。所望の圧力に達すると、尿道カテーテルのキャップが取り外され、ルシフェリン-ルシフェラーゼアッセイによるATP定量のために液体が収集されます。この実験セットアップを通じて、尿路上皮ATP放出の機械的および化学的刺激の両方を制御するメカニズムは、灌流液にさまざまなアゴニストまたはアンタゴニストを含めることによって、または野生型動物と遺伝子組み換え動物の結果を比較することによって調べることができます。

概要

尿中ATPは、排尿の制御において重要な感覚的役割を果たすと考えられています¹。例えば、ATPは膨満に応答して尿路上皮から放出され、膀胱求心性神経の受容体に作用して興奮性を高め、満腹感をもたらすと考えられています²。したがって、尿中ATPは膀胱病変の発症において重要なプレーヤーである可能性があるとも考えられています。この仮説を支持するために、尿中ATP濃度は、過活動膀胱(OAB)³、膀胱痛症候群/間質性膀胱炎(BPS / IC)⁴、または尿路感染症(UTI)^5,6に苦しむ患者で有意に増加します。逆に、膀胱を空にすることができないことを特徴とし、時には膀胱の満腹感を感知する能力の低下を含むことがある低活動膀胱(UAB)に苦しむ患者は、尿中ATP濃度が低下していることが示されています⁷。実験的には、尿中ATP濃度の操作はラットの膀胱反射を変化させる可能性があります。膀胱内腔の内因性ATPアーゼを遮断することによってATP濃度を増加させると排尿頻度を増加させることができ、一方、外因性ATPアーゼを膀胱に注入することによってATP濃度を低下させると排尿頻度が低下する⁸。したがって、膀胱機能に対する尿中ATPの重要性は明らかである。

膀胱病理に対する尿中ATPの明らかな重要性を考えると、尿路上皮ATP放出の正確な測定は、放出を制御するメカニズムを理解する上で重要なステップです。尿路上皮ATP放出を測定するために、異なる実験モデルを用いて多くの研究が完了している。これらの中で最も重要なのは、初代培養または細胞株のいずれかの細胞培養です。しかし、培養尿路上皮細胞の使用は、特殊な透過性膜(Transwell技術[ウェルインサート]^など)で増殖させない限り、尿路上皮細胞が生理学的分極形態をとらないという事実によって複雑になります9。したがって、測定された任意のATP放出を生理学に関連付けることは困難である。ウェルインサート上で増殖した尿路上皮細胞は分極し、 in vivoで見られるものと同様の障壁を形成する可能性があります。ただし、完全に分化した尿路上皮の成長には数日から数週間かかる場合があります。さらに、ウッシングチャンバーにウェルインサートを取り付け、頂端側に圧力を加えて伸張させることは可能ですが、病理学中に膀胱内の状態を模倣するのに十分な圧力(すなわち、30 cm H₂O以上の圧力)を適用することは困難です。膀胱組織全体をストレッチ実験のためにUssingチャンバーに取り付けることもできますが、これにより、尿路上皮細胞の健康、したがって尿路上皮バリア機能を維持する栄養因子とともに、膀胱が生物から除去されます。したがって、伸張または圧力に応答した尿路上皮からのATPの放出を研究するための最も生理学的に関連性のある方法は in vivoである。実験のセットアップに必要な外科的技術は、動物の膀胱測定で一般的に使用されるものと同じであるため、その技術に精通している人なら誰でも簡単に実行できるはずです。

このプロトコルでは、以下で説明する経尿道的カテーテル法は女性の方がはるかに簡単であるため、体重約200〜250 gの雌Sprague Dawleyラットの管腔ATPを調べるために使用される技術について説明します。しかしながら、経尿道的カテーテル法は、雄のげっ歯類¹⁰においても行うことができる。経尿道的カテーテル法は現在、男女両方のマウスでも行われているため¹¹、これらの実験は、研究チームのニーズに応じて、性別またはさまざまなサイズのマウスまたはラットに簡単に適応させることができます。

プロトコル

げっ歯類で行われるすべての手順は、該当するガイドラインに準拠し、地元の施設倫理審査委員会によって承認されなければなりません。この原稿のために行われた実験は、実験動物の世話と使用のための全米研究評議会のガイドに従って実施され、ピッツバーグ大学医学部の施設動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用される標準的なげっ歯類の膀胱測定セットアップの修正バージョンについては 、図1 を参照してください。

1.実験動物

1. ラットを公営住宅(1つのケージに複数のげっ歯類)で維持し、12時間の明暗サイクルと水と食物ペレットへの 自由 アクセスを維持します。

2.麻酔と神経節ブロック

1. 動物をO₂ (1 L / min)の4%-5%イソフルランでガスを飲んだ密閉ボックスに入れることにより、初期麻酔を誘発します。.
2. ウレタンを使用して動物を麻酔します。
   1. ウレタンを両側に皮下注射します(動物の両側に1/2用量)1.2 g / kgの用量で。動物をケージに入れてウレタンを有効にし、通常2時間かかります。
   2. あるいは、ウレタンを腹腔内(i.p.)に投与し、全用量を2回~10分間隔で注射します。
3. ウレタンが効くのに適切な時間(s.c.:2時間、i.p.:30分)を待った後、鉗子を使用して動物の足をつまんで適切な麻酔面をテストします。反射が観察された場合は、追加用量のウレタン(0.05〜0.1 mL i.p.)を投与し、15分間待ってから再度テストします。.手順全体を通して、適切な麻酔面について動物を監視し続けます。
4. 膨張中の膀胱の収縮を防ぐために、ヘキサメトニウム(20 mg / kg、i.p.)などの神経節遮断剤を動物に注射します。.
5. 実験中の乾燥を防ぐために、動物の目に眼科用軟膏を塗布します。

3.外科的処置-恥骨上膀胱カテーテル法

1. 動物の腹部を剃り、正中線開腹術を行って膀胱を露出させます。
2. 炎を使用して、短い長さ(~10-15 cm)のPE50イントラメディックチューブの一端をフレアすることにより、カテーテルを準備します。チューブのもう一方の端に22Gの針を置き、クレブス溶液で満たします(組成については 材料表 を参照)。
3. 膀胱のドームの上に3-0シルク縫合糸の小さなループを置き、上記のカテーテルのフレアエンドを挿入するのに十分な大きさの小さな膀胱瘻造設術(細かいはさみまたは18 G針を使用)を実行します。片手でカテーテルを所定の位置に保持し、もう一方の手で縫合糸のループを締め、カテーテルを所定の位置に固定します。縫合糸に2つの結び目を結び、フレアヘッドが膀胱壁に接触するまでカテーテルを引き戻して、カテーテルの固定を終了します。
   1. あるいは、膀胱測定¹²について前述したように、古典的な巾着縫合技術を使用してカテーテルを固定します。
      注意: この手順では、膀胱に気泡を入れないことが不可欠です。
4. カテーテルを通して少量のクレブス溶液を注入することにより、漏れのセットアップをテストします。膀胱瘻から液体が漏れた場合は、膀胱瘻の周りに追加の縫合糸でカテーテルを再固定します。

4.経尿道的カテーテル法

1. 20 G x 1インチの点滴カテーテルの端を(針を外した状態)外科用潤滑剤に浸します。
2. 一対の鉗子で外尿道口をそっと持ち、先端が隣接する膣口の壁を変形させるまで、カテーテルの先端を尾の方向に尿道開口部に挿入します。カテーテルを90°回転させ(カテーテルのルアーロック端を尾に近づけます)、ゆっくりと前進させます。ルアーロックハブが外尿道開口部から約5mm離れるまで、カテーテルを完全に挿入します。
   注意: カテーテルを深く挿入しすぎると、先端が膀胱の内壁を突く可能性があります。カテーテルの前進中に抵抗が感じられた場合は、停止して再開するか、尿道に穴を開ける危険があります。カテーテル挿入を成功させるためのヒントについては、ディスカッションセクションを参照してください。
3. カテーテルを固定し、外尿道口の周りに短い長さの3-0シルク縫合糸をループさせ、しっかりと結ぶことにより、カテーテルの周りの漏れを防ぎます。誤って引き抜かれないように、カテーテルをテープで尾に固定します。
4. カテーテル挿入したら、恥骨上膀胱カテーテルを介してクレブス溶液を膀胱に静かに注入し、液体が尿道カテーテルの周囲ではなく尿道カテーテルから流出することを確認します。必要に応じて、外尿道開口部の周りの縫合糸を再調整します。
5. 3-0シルク縫合糸を使用して膀胱の腹部切開を閉じます。

5. 実験のセットアップ

1. 尿道カテーテルからの膀胱内液の排出を助けるように傾けることができるボードに動物を固定します。動物とボードの間に加熱パッドと吸収性アンダーパッドを配置して、体温を維持し、尿道カテーテルから排出される液体を吸収します。
2. 恥骨上カテーテルを三方活栓に接続し、カテーテルをシリンジポンプと圧力トランスデューサーに接続します。圧力トランスデューサをアンプとデータ収集システムを介してコンピュータに接続します。
   注意: シリンジポンプ、トランスデューサー、および膀胱カテーテルを接続するチューブに気泡が形成されないように注意する必要があります。
3. 圧力トランスデューサおよび/またはデータ収集ソフトウェアの製造元が提案する手順を使用して、膀胱圧力記録を校正します。
4. 恥骨上カテーテルにクレブス溶液を0.1 mL / minの速度で注入し、尿道カテーテルから液体を1時間排出して、カテーテル移植中に放出された残留ATPを洗い流します。
5. このウォッシュアウト期間の後、ルアーロックプラグを使用して尿道カテーテルにキャップをし、膀胱内の圧力を測定します。膀胱内圧が急激に上昇することなく、膀胱内圧が30 cm H 2 Oの圧力までゆっくりと上昇し、膀胱収縮を示すことを探します(図2を参照)。膀胱の損傷を防ぐために、圧力が30 cm H₂Oに達したら尿道カテーテルからプラグを取り外します。
   注:膀胱収縮が1時間後も引き続き発生する場合は、ヘキサメトニウムを追加投与してください(5 mg / kg用量i.p.)。.

6.サンプルの収集

1. 0.1 mL/minで膀胱を注入し、尿道カテーテルから溶出液を採取します。100 μLの溶出液アリコートをATPについて直ちにテストするか(下記参照)、後でバッチ定量するために凍結します。
2. 管腔ATP濃度に対する膀胱膨満の影響をテストするには、尿道カテーテルをプラグで覆い、膀胱圧が所望のレベルに達するまで監視します。次に、尿道カテーテルのキャップを外し、上記のようにATP測定または凍結のために溶出液を採取します。
3. 膨満するたびに、追加のサンプルを採取する前に、膀胱を休ませて10〜15分間洗い流します。再現性を実証するために、各所望の膨張圧力で合計3〜5個の前濃縮サンプルと3〜5個のサンプルを採取します。
4. ATPの放出に対する薬物の効果をテストするには、膀胱を注入するクレブス溶液を、選択した薬物を含むクレブスに切り替えます。薬が効果を発揮するために0.1 mL / minで10〜15分間灌流し、手順6.1および6.2で説明されているように、非膨張および膨張した膀胱からサンプルを収集します。.

7. 採取したサンプルからのATPの定量

1. 市販のルシフェリン/ルシフェラーゼアッセイキットを使用して、製造元の指示に従って、収集した100 μLサンプル中のATPを定量します。
   1. ATPを定量するには、灌流液100 μLのサンプルとアッセイミックス50 μLを組み合わせ、ルミノメーターに入れて読み取ります。ルミノメーターによって報告された相対光単位(RRU)をATPの濃度に変換するには、クレブス溶液中のATPを10倍希釈で1μMから10pMの範囲で連続希釈して標準曲線を作成し、ルミノメーターで読み取ります。結果の読み取り値をグラフにプロットし、非線形(二次)回帰を実行して、動物から採取したサンプルから濃度を推定します。
      注:多くの薬物がルシフェリン/ルシフェラーゼ反応を妨害するため、実験でテストされた薬物溶液のATP標準を作成することが重要です。

8.動物の安楽死

1. 実験が完了し、すべてのサンプルが収集されたら、USDAガイドラインと実験動物の世話と使用に関する国立研究評議会のガイドに従って、動物を人道的に安楽死させます。
   1. 麻酔をかけた動物を実験装置から取り出し、密閉箱に入れ、100%_CO2でガスを採取します。充填率がチャンバー容積の30%〜70%/分に等しいことを確認してください(たとえば、3 L容量のボックスの場合は7〜10 L / min)。呼吸が停止した後、少なくとも1分間CO₂ フローを継続します。
2. 死を確実にするために安楽死の二次的な形態を使用してください。
   1. 胸骨の尾端にある皮膚の小さな皮弁をつかみ、鋭いハサミで横隔膜の皮膚と筋肉組織に小さな穴を開けることにより、安楽死の二次形態として開胸術を行います。はさみを開口部に挿入し、胸郭を通して吻側を切断し、胸腔を露出させることにより、開胸を完了します。
      注:安楽死させた動物は、施設のガイドラインに従って処分する必要があります。

結果

記載されたプロトコルは、標準的なげっ歯類の膀胱測定セットアップの修正バージョンを使用して、膀胱の内腔からのin vivo での尿路上皮ATP放出の正確な測定を可能にする( 図1を参照)。これにより、研究者は生理学的設定でのストレッチ媒介ATP放出に対する薬物の効果を調べることができます。

ディスカッション

尿路上皮ATP放出に関する研究の大部分は、不死化細胞株またはげっ歯類の尿路上皮細胞の初代培養のいずれかを使用して、培養細胞で行われます。これらのモデルには、スループットが比較的高いという利点がありますが(つまり、1回の培養/継代で細胞のプレート/皿を多数作成できます)、生理学的関連性は、1)尿路上皮細胞が特別な支持体上で増殖しない限り分極的に増殖できないこと、お...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose