В городе Виво Просветное измерение высвобождения уротелиального АТФ, вызванного растяжением, у грызунов

Резюме

Данный протокол описывает процедуру измерения концентраций АТФ в просвете мочевого пузыря у обезболенного грызуна.

Аннотация

АТФ, высвобождаемый из уротелия в ответ на растяжение мочевого пузыря, как полагают, играет значительную сенсорную роль в контроле мочеиспускания. Поэтому точное измерение высвобождения уротелиальной АТФ в физиологических условиях является важным первым шагом в изучении механизмов, которые контролируют пуринергическую сигнализацию в мочевом пузыре. Существующие методы изучения механически вызванного высвобождения уротелиального АТФ используют культивируемые клетки, покрытые гибкими опорами или тканью мочевого пузыря, закрепленной в камерах Ussing; однако каждый из этих методов не полностью эмулирует состояния в неповрежденном мочевом пузыре. Поэтому была разработана экспериментальная установка для непосредственного измерения концентраций АТФ в просвете мочевого пузыря грызунов.

В этой установке мочевые пузыри анестезированных грызунов перфузируются через катетеры как в куполе мочевого пузыря, так и через наружное уретральное отверстие. Давление в мочевом пузыре увеличивается путем закрытия уретрального катетера при перфузии стерильной жидкости в мочевой пузырь через купол. Измерение внутрипузырного давления достигается с помощью датчика давления, прикрепленного к купольному катетеру мочевого пузыря, аналогично установке, используемой для цистометрии. Как только желаемое давление достигнуто, крышка уретрального катетера удаляется, а жидкость собирается для количественной оценки АТФ с помощью анализа люциферин-люциферазы. С помощью этой экспериментальной установки механизмы, контролирующие как механическую, так и химическую стимуляцию высвобождения уротелиального АТФ, могут быть опрошены путем включения различных агонистов или антагонистов в перфусат или путем сравнения результатов между диким типом и генетически модифицированными животными.

Введение

Считается, что АТФ в моче играет значительную сенсорную роль в контроле мочеиспускания¹. Например, считается, что АТФ высвобождается из уротелия в ответ на растяжение, где он может воздействовать на рецепторы афферентных нервов мочевого пузыря, чтобы увеличить их возбудимость, что приводит к ощущениям полноты². Таким образом, также считается, что атФ мочи может быть важным игроком в развитии патологий мочевого пузыря. В подтверждение этой гипотезы концентрации АТФ в моче значительно повышены у пациентов, страдающих гиперактивным мочевым пузырем (ОАБ)³, синдромом боли в мочевом пузыре / интерстициальным циститом (BPS / IC) ⁴ или инфекцией мочевыводящих путей (ИМП) ^5,6, все состояния характеризуются повышенной срочностью, частотой и, иногда, болью. И наоборот, было показано, что у пациентов, страдающих недостаточной активностью мочевого пузыря (UAB), который характеризуется неспособностью опорожнить мочевой пузырь и иногда может включать снижение способности чувствовать полноту мочевого пузыря, было показано снижение концентрации АТФ^{в моче 7}. Экспериментально манипуляции с концентрациями АТФ в моче могут изменить рефлексы мочевого пузыря у крыс; увеличение концентрации АТФ путем блокирования эндогенных АТФаз в просвете мочевого пузыря может увеличить частоту мочеиспускания, в то время как снижение концентрации АТФ путем закапывания экзогенных АТФаз в мочевой пузырь снижает частоту мочеиспускания⁸. Таким образом, важность АТФ в моче для функции мочевого пузыря очевидна.

Учитывая очевидную важность АТФ в моче для патологии мочевого пузыря, точное измерение высвобождения уротелиального АТФ является важным шагом в понимании механизмов, контролирующих высвобождение. Многие исследования были завершены с использованием различных экспериментальных моделей для измерения высвобождения уротелиального АТФ. Главными среди них являются клеточные культуры, либо первичные культуры, либо клеточные линии. Однако использование культивируемых уротелиальных клеток осложняется тем фактом, что уротелиальные клетки не приобретают свою физиологическую поляризованную морфологию, если они не выращиваются на специальных проницаемых мембранах (таких как технология Transwell [вставки колодца])⁹. Таким образом, трудно связать какое-либо высвобождение АТФ, измеренное с физиологией. Уротелиальные клетки, выращенные на колодцах, могут поляризоваться и образовывать барьер, похожий на то, что видно in vivo; однако рост полностью дифференцированного уротелия может занять дни или недели. Кроме того, хотя можно хорошо установить вставки в камеру Ussing и приложить давление к апикальной стороне, чтобы вызвать растяжение, трудно применить достаточное давление, чтобы имитировать условия внутри мочевого пузыря во время патологии (т. Е. Давление 30 см H₂O или выше). Вся ткань мочевого пузыря также может быть установлена в камере Ussing для экспериментов с растяжкой, но это удаляет мочевой пузырь из организма вместе с трофическими факторами, поддерживающими здоровье уротелиальных клеток и, следовательно, функцию уротелиального барьера. Поэтому наиболее физиологически значимым способом изучения высвобождения АТФ из уротелия в ответ на растяжение или давление является in vivo. Хирургические методы, необходимые для проведения эксперимента, идентичны тем, которые обычно используются в цистометрии животных, и, следовательно, должны быть легко выполнены любым, кто знаком с этой техникой.

В этом протоколе мы опишем методику, используемую для исследования просветной АТФ у самок крыс Sprague Dawley массой примерно 200-250 г, так как трансуретральная катетеризация, описанная ниже, намного легче у самок; однако трансуретральная катетеризация также может быть выполнена у самцов грызунов¹⁰. Поскольку трансуретральная катетеризация в настоящее время проводится у мышей обоих полов, а также¹¹, эти эксперименты могут быть легко адаптированы для мышей или крыс любого пола или различных размеров, в зависимости от потребностей исследовательской группы.

протокол

Все процедуры, проводимые на грызунах, должны соответствовать применимым руководящим принципам и быть одобрены местным институциональным комитетом по проверке этики. Эксперименты, проведенные для этой рукописи, были проведены в соответствии с Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных и одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Медицинской школы Университета Питтсбурга. На рисунке 1 показана модифицированная версия стандартной установки цистометрии грызунов, используемой в этом протоколе.

1. Лабораторные животные

1. Поддерживайте крыс в социальном жилье (несколько грызунов в одной клетке) с 12-часовым циклом света / темноты и доступом ad libitum к воде и пищевым гранулам .

2. Анестезия и ганглионная блокада

1. Индуцировать начальную анестезию путем помещения животного в закрытую коробку, отравленную газом 4%-5% изофлурана в_О2 (1 л/мин).
2. Обезболить животное с помощью уретана.
   1. Вводят уретан подкожно двусторонне (по 1/2 дозы с каждой стороны животного) в дозе 1,2 г/кг. Поместите животное в клетку, чтобы позволить уретану вступить в силу, что обычно занимает 2 ч.
   2. Альтернативно, вводят уретан внутрибрюшинно (т..) путем введения полной дозы в двух отдельных дозах ~ 10 мин с интервалом.
3. После ожидания подходящего времени для вступления уретана в силу (s.c.: 2 ч, т..: 30 мин), проверьте правильную плоскость анестезии, зажав ногу животного с помощью щипцов. При соблюдении рефлекса вводят дополнительную дозу уретана (0,05-0,1 мл в..), ждут 15 мин и снова тестируют. Продолжайте следить за животным для правильной плоскости анестезии на протяжении всей процедуры.
4. Чтобы предотвратить сокращение мочевого пузыря во время растяжения, вводят животному ганглионную блокирующую агенту, такую как гексаметоний (20 мг/кг, т..).
5. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза животного, чтобы предотвратить пересыхание во время эксперимента.

3. Хирургическая процедура - надлобковая катетеризация мочевого пузыря

1. Побрить брюшко животного и выполнить лапаротомию средней линии, чтобы обнажить мочевой пузырь.
2. Подготовьте катетер, вспыхнув одним концом короткой (~10-15 см) интрамедицинской трубки PE50 с помощью пламени. Поместите иглу весом 22 г в другой конец трубки и заполните раствором Кребса (см. Таблицу материалов для состава).
3. Поместите небольшую петлю из 3-0 шелкового шва над куполом мочевого пузыря и выполните небольшую цистостомию (используя тонкие ножницы или иглу 18 G), достаточно большую, чтобы вставить расклешенный конец катетера, сделанного выше. Одной рукой удерживая катетер на месте, другой рукой затяните петлю шва, чтобы закрепить катетер на месте. Закончите закрепление катетера, завязав два узла в шве и потянув катетер обратно, пока расклешенная головка не соприкоснется со стенкой мочевого пузыря.
   1. В качестве альтернативы, закрепите катетер, используя классическую технику шва кошелька, как описано ранее для цистометрии¹².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этой процедуры обязательно не вводите пузырьки воздуха в мочевой пузырь.
4. Проверьте установку на наличие утечек, вливая небольшое количество раствора Кребса через катетер. Если жидкость вытекает из цистостомии, повторно закрепите катетер дополнительным швом вокруг цистостомии.

4. Трансуретральная катетеризация

1. Окуните конец внутривенного катетера 20 G x 1" (с удаленной иглой) в хирургическую смазку.
2. Осторожно удерживайте наружный уретральный меатус парой щипцов и вставьте кончик катетера в уретральное отверстие в направлении хвоста, пока кончик не приведет к деформации стенки соседнего влагалищного отверстия. Поверните катетер на 90° (поднеся конец катетера Luer-Lock к хвосту) и осторожно двиньтесь вперед. Полностью вставьте катетер до тех пор, пока ступица Luer-Lock не окажется примерно на расстоянии 5 мм от наружного отверстия уретры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не вставляйте катетер слишком далеко, что может привести к тому, что наконечник просунет внутреннюю стенку мочевого пузыря. Если сопротивление ощущается при продвижении катетера, остановитесь и начните снова или рискуйте проколоть уретру. Смотрите раздел обсуждения о советах по увеличению успешной катетеризации.
3. Закрепите катетер и предотвратите утечку вокруг катетера, закольцовав короткий шелковый шов длиной 3-0 вокруг наружного уретрального мяса и плотно завязав его. Закрепите катетер на хвосте с помощью ленты, чтобы предотвратить его случайное вытаскивание.
4. После катетеризации осторожно вводят раствор Кребса в мочевой пузырь через надлобковый катетер мочевого пузыря и подтверждают, что жидкость вытекает из уретрального катетера, а не вокруг него. При необходимости повторите шов вокруг наружного отверстия уретры.
5. Закройте брюшной разрез над мочевым пузырем с помощью шелкового шва 3-0.

5. Экспериментальная установка

1. Закрепите животное на доске, способной быть склонным помогать в дренаже внутрипузырной жидкости через уретральный катетер. Поместите грелку и абсорбирующую подкладку между животным и доской, чтобы поддерживать тепло тела и поглощать жидкость, стекающую из уретрального катетера.
2. Подключите надлобковый катетер к трехстороннему запорному крану, который соединяет катетер со шприцевым насосом и преобразователем давления. Подключите датчик давления к компьютеру с помощью усилителя и системы сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следует соблюдать осторожность, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в трубке, соединяющей шприцевой насос, датчик и катетер мочевого пузыря.
3. Откалибруйте запись давления в мочевом пузыре, используя процедуру, предложенную производителем датчика давления и/или программного обеспечения для сбора данных.
4. Вводят раствор Кребса через надлобковый катетер со скоростью 0,1 мл/мин и дают жидкости стекать из уретрального катетера в течение 1 ч, чтобы вымыть любые остаточные АТФ, высвобождаемые во время имплантации катетера.
5. После этого периода промывания закройте уретральный катетер с помощью пробки Luer-Lock и измерьте давление в мочевом пузыре. Ищите медленное повышение внутрипузырного давления до давления 30 см_H2Oбез резкого повышения давления, что будет указывать на сокращение мочевого пузыря (см. Рисунок 2). Снимите пробку из уретрального катетера, когда давление достигнет 30 см H_2O, чтобы предотвратить повреждение мочевого пузыря.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если сокращения мочевого пузыря продолжают происходить через 1 ч, вводят дополнительную дозу гексаметония (доза 5 мг/кг в.п.).

6. Сбор образцов

1. Вводят мочевой пузырь со скоростью 0,1 мл/мин и собирают элюат из уретрального катетера. Испытайте 100 мкл аликвот элюата немедленно на АТФ (см. ниже) или заморозьте для последующей количественной оценки партии.
2. Чтобы проверить влияние растяжения мочевого пузыря на концентрацию АТФ в просвете, закройте уретральный катетер пробкой и контролируйте давление в мочевом пузыре, пока оно не достигнет желаемого уровня. Затем снимите крышку уретрального катетера и соберите элюат для измерения АТФ или замораживания, как описано выше.
3. После каждого растяжения дайте мочевому пузырю отдохнуть и промыть в течение 10-15 минут, прежде чем брать дополнительные пробы. Возьмите в общей сложности 3-5 образцов предопределения и 3-5 образцов при каждом желаемом давлении растяжения, чтобы продемонстрировать повторяемость.
4. Чтобы проверить влияние препаратов на высвобождение АТФ, переключите раствор Кребса, настояющий мочевой пузырь, на Кребс, содержащий препарат выбора. Перфьюируйте при 0,1 мл/мин в течение 10-15 мин, чтобы препарат оказывал эффект, а затем соберите образцы из нерастянутых и растянутых мочевых пузырей, как описано в шагах 6.1 и 6.2.

7. Количественная оценка АТФ из собранных образцов

1. Количественное определение АТФ в собранных образцах объемом 100 мкл с использованием коммерчески доступного набора для анализа люциферина/люциферазы в соответствии с инструкциями производителя и люминометром.
   1. Для количественной оценки АТФ соедините образцы перфусата объемом 100 мкл с 50 мкл смеси для анализа и поместите их в люминометр для считывания показаний. Для преобразования относительных световых единиц (RLU), сообщаемых люминометром, в концентрацию АТФ производят последовательные разбавления АТФ в растворе Кребса в диапазоне от 1 мкМ до 10 пМ в 10-кратных разведениях для создания стандартной кривой и считывания их в люминометре. Нанесите полученные показания на график и выполните нелинейную (квадратичную) регрессию для экстраполяции концентраций из образцов, взятых у животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно установить стандарты АТФ для любого лекарственного раствора, протестированного в эксперименте, так как многие препараты вмешиваются в реакцию люциферин/люцифераза, которая должна быть скорректирована.

8. Эвтаназия животных

1. Когда эксперимент будет завершен и все образцы собраны, гуманно усыпить животное в соответствии с руководящими принципами Министерства сельского хозяйства США и Руководством Национального исследовательского совета по уходу и использованию лабораторных животных.
   1. Извлеките обезболенное животное из экспериментальной установки, поместите его в закрытую коробку и загазуйте его 100% CO₂. Убедитесь, что скорость заполнения равна 30%-70% объема камеры в минуту (например, 3-7 л/мин для коробки с объемом 10 л). Продолжайте поток CO₂ в течение не менее 1 мин после прекращения дыхания.
2. Используйте вторичную форму эвтаназии, чтобы обеспечить смерть.
   1. Выполните торакотомию как вторичную форму эвтаназии, захватив небольшой лоскут кожи на каудальном конце грудины и разрезав небольшое отверстие в коже и мускулатуре на диафрагме острыми ножницами. Завершите торакотомию, вставив ножницы в отверстие и разрезав рострально через грудную клетку и обнажив грудную полость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усыпленное животное должно быть утилизировано в соответствии с институциональными руководящими принципами.

Результаты

Описанный протокол позволяет точно измерять высвобождение уротелиальной АТФ in vivo из просвета мочевого пузыря с использованием модифицированной версии стандартной установки цистометрии грызунов (см. Рисунок 1). Это позволяет исследователю изучить влияние лекарст...

Обсуждение

Большинство исследований высвобождения уротелиального АТФ проводится в культивируемых клетках с использованием либо увековеченных клеточных линий, либо первичных культур уротелиальных клеток грызунов. Хотя эти модели имеют преимущество в том, что они имеют относительно высокую про...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose