İn Vivo Kemirgenlerde Distansiyon Uyarılmış Ürotelyal ATP Salınımının Luminal Ölçümü

Özet

Bu protokol, anestezi uygulanan bir kemirgende mesanenin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını ölçme prosedürünü açıklar.

Özet

Mesane distansiyonuna yanıt olarak ürotelyumdan salınan ATP'nin, işitasyonun kontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir. Bu nedenle, ürotelyal ATP salınımının fizyolojik bir ortamda doğru ölçülmesi, idrar kesesinde pürinerjik sinyalleşmeyi kontrol eden mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilk adımdır. Mekanik olarak uyarılmış ürotelyal ATP salınımını incelemek için mevcut teknikler, esnek destekler üzerine kaplanmış kültürlü hücreleri veya Ussing odalarına sabitlenmiş mesane dokusunu kullanır; Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri, sağlam mesanedeki koşulları tam olarak taklit etmez. Bu nedenle, kemirgen idrar kesesinin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını doğrudan ölçmek için deneysel bir kurulum geliştirilmiştir.

Bu kurulumda, anestezi uygulanan kemirgenlerin mesaneleri, hem mesanenin kubbesindeki kateterlerden hem de dış üretral delikten geçirilir. Mesanedeki basınç, üretral kateterin kapatılmasıyla arttırılırken, steril sıvının kubbe yoluyla mesaneye nüfuz ettirilmesiyle arttırılır. İntravezikal basıncın ölçümü, sistometri için kullanılan kuruluma benzer şekilde, mesane kubbe kateterine bağlı bir basınç transdüseri kullanılarak gerçekleştirilir. İstenilen basınca ulaşıldıktan sonra, üretral kateter kapağı çıkarılır ve lusiferin-lusiferaz testi ile ATP nicelleştirmesi için sıvı toplanır. Bu deney düzeneği sayesinde, ürotelyal ATP salınımının hem mekanik hem de kimyasal stimülasyonunu kontrol eden mekanizmalar, perfüzyona çeşitli agonistler veya antagonistler dahil edilerek veya vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar arasındaki sonuçlar karşılaştırılarak sorgulanabilir.

Giriş

Üriner ATP'nin miksiyon^kontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir 1. Örneğin, ATP'nin, uyarılabilirliklerini arttırmak için mesane afferent sinirleri üzerindeki reseptörler üzerinde hareket edebileceği ve dolgunluk hissine yol açabileceği distansiyona yanıt olarak ürotelyumdan salındığı düşünülmektedir². Bu nedenle, idrar ATP'sinin mesane patolojilerinin gelişiminde önemli bir oyuncu olabileceği düşünülmektedir. Bu hipotezi desteklemek için, aşırı aktif mesane (OAB)³, mesane ağrısı sendromu/interstisyel sistit (BPS/IC)⁴ veya idrar yolu enfeksiyonu (İYE)^5,6 şikayeti olan hastalarda^, artan aciliyet, sıklık ve bazen ağrı ile karakterize tüm durumlarda, üriner ATP konsantrasyonları anlamlı olarak artmıştır. Tersine, mesanesini boşaltamamakla karakterize olan ve bazen mesane dolgunluğunu algılama yeteneğinin azalmasını içerebilen düşük aktif mesaneden (UAB) muzdarip hastaların, idrar ATP konsantrasyonlarının azaldığı gösterilmiştir⁷. Deneysel olarak, idrar ATP konsantrasyonlarının manipülasyonu sıçandaki mesane reflekslerini değiştirebilir; Mesane lümenindeki endojen ATPazları bloke ederek ATP konsantrasyonlarının arttırılması işeme sıklığını artırabilirken, mesaneye eksojen ATPazlar aşılayarak ATP konsantrasyonlarını azaltmak işeme sıklığını azaltır⁸. Bu nedenle, idrar ATP'sinin mesane fonksiyonu için önemi açıktır.

Üriner ATP'nin mesane patolojisi için belirgin önemi göz önüne alındığında, ürotelyal ATP salınımının doğru ölçülmesi, salınımı kontrol eden mekanizmaların anlaşılmasında önemli bir adımdır. Ürotelyal ATP salınımını ölçmek için farklı deneysel modeller kullanılarak birçok çalışma tamamlanmıştır. Bunların başında hücre kültürleri, birincil kültürler veya hücre hatları gelir. Bununla birlikte, kültürlenmiş ürotelyal hücrelerin kullanımı, ürotelyal hücrelerin özel geçirgen membranlarda (Transwell teknolojisi [kuyu ekleri] gibi) yetiştirilmedikçe fizyolojik polarize morfolojilerini üstlenmemeleri nedeniyle ^{karmaşıktır9}. Bu nedenle, ölçülen herhangi bir ATP salınımını fizyoloji ile ilişkilendirmek zordur. Kuyu uçlarında yetişen ürotelyal hücreler polarize olabilir ve in vivo görülene benzer bir bariyer oluşturabilir; Bununla birlikte, tamamen farklılaşmış bir ürotelyumun büyümesi günler veya haftalar sürebilir. Ek olarak, kuyu uçlarını bir Ussing odasına monte etmek ve gerilmeye neden olmak için apikal tarafa basınç uygulamak mümkün olsa da, patoloji sırasında mesanenin içindeki koşulları taklit etmek için yeterli basınç uygulamak zordur (yani, 30 cm_H2O veya üzeri basınçlar). Tüm mesane dokusu, streç deneyleri için bir Ussing odasına da monte edilebilir, ancak bu, ürotelyal hücre sağlığını ve dolayısıyla ürotelyal bariyer fonksiyonunu koruyan trofik faktörlerle birlikte mesaneyi organizmadan uzaklaştırır. Bu nedenle, gerilme veya basınca yanıt olarak ürotelyumdan ATP salınımını incelemenin fizyolojik olarak en alakalı yolu in vivo'dur. Deneyi kurmak için gereken cerrahi teknikler, hayvan sistometrisinde yaygın olarak kullanılanlarla aynıdır ve bu nedenle, bu tekniğe aşina olan herkes tarafından kolayca uygulanmalıdır.

Bu protokolde, yaklaşık 200-250 g ağırlığındaki dişi Sprague Dawley sıçanlarında luminal ATP'yi incelemek için kullanılan tekniği açıklayacağız, çünkü aşağıda açıklanan transüretral kateterizasyon kadınlarda çok daha kolaydır; Bununla birlikte, transüretral kateterizasyon erkek kemirgenlerde de yapılabilir¹⁰. Transüretral kateterizasyon artık her iki cinsiyetteki farelerde de¹¹ yapıldığından, bu deneyler araştırma ekibinin ihtiyaçlarına bağlı olarak, cinsiyetteki veya farklı boyutlardaki fareler veya sıçanlar için kolayca uyarlanabilir.

Protokol

Kemirgenlerde gerçekleştirilen tüm prosedürler geçerli kılavuzlara uymalı ve yerel kurumsal etik inceleme komitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu makale için yapılan deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Pittsburgh Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan standart kemirgen sistometri kurulumunun değiştirilmiş bir versiyonu için Şekil 1'e bakınız.

1. Laboratuvar hayvanları

1. Sıçanları sosyal konutlarda (bir kafeste birden fazla kemirgen) 12 saatlik bir ışık / karanlık döngüsü ve su ve yiyecek peletlerine ad libitum erişimi ile koruyun.

2. Anestezi ve gangliyonik blok

1. Hayvanı_O2'de (1 L / dak) % 4-5% izofluran ile gazlanmış kapalı bir kutuya yerleştirerek ilk anesteziyi indükleyin.
2. Üretan kullanarak hayvanı anestezi altına alın.
   1. Üretanı deri altından iki taraflı olarak (hayvanın her iki tarafında 1/2 doz) 1.2 g / kg'lık bir dozda enjekte edin. Üretanın etkili olmasına izin vermek için hayvanı bir kafese yerleştirin, bu genellikle 2 saat sürer.
   2. Alternatif olarak, üretanı intraperitoneal olarak (i.p.) tam dozu ~ 10 dakika arayla iki ayrı dozda enjekte ederek uygulayın.
3. Üretanın etkili olması için uygun zamanı bekledikten sonra (s.c.: 2 saat, yani 30 dakika), forseps kullanarak hayvanın ayağını sıkıştırarak uygun bir anestezi düzlemi için test edin. Bir refleks gözlenirse, ek bir doz üretan (0.05-0.1 mL i.p.) uygulayın, 15 dakika bekleyin ve tekrar test edin. İşlem boyunca uygun anestezi düzlemi için hayvanı izlemeye devam edin.
4. Distansiyon sırasında mesanenin kasılmasını önlemek için, hayvana heksametonyum (20 mg / kg, i.p.) gibi gangliyonik bir bloke edici ajan enjekte edin.
5. Deney sırasında kurumayı önlemek için hayvanın gözlerine oftalmik merhem uygulayın.

3. Cerrahi prosedür-suprapubik mesane kateterizasyonu

1. Hayvanın karnını tıraş edin ve idrar kesesini ortaya çıkarmak için orta hat laparotomi yapın.
2. Bir alev kullanarak PE50 intramedik tüpünün kısa (~ 10-15 cm) uzunluğunun bir ucunu alevlendirerek bir kateter hazırlayın. Borunun diğer ucuna 22 G'lik bir iğne yerleştirin ve Krebs çözeltisi ile doldurun (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Mesanenin kubbesinin üzerine 3-0 ipek sütürden küçük bir halka yerleştirin ve yukarıda yapılan kateterin alevli ucunu yerleştirecek kadar büyük küçük bir sistostomi (ince makas veya 18 G iğne kullanarak) uygulayın. Bir eliniz kateteri yerinde tutarken, kateteri yerine sabitlemek için dikişin halkasını sıkmak için diğer elinizi kullanın. Dikişe iki düğüm bağlayarak ve parlayan kafa mesane duvarıyla temas edene kadar kateteri geri çekerek kateteri sabitlemeyi bitirin.
   1. Alternatif olarak, daha önce sistometri 12 için tarif edildiği gibi klasik bir kese ipi sütür tekniği kullanarak kateteri^sabitleyin.
      NOT: Bu işlem sırasında mesaneye hava kabarcıkları sokmamak zorunludur.
4. Kateterden az miktarda Krebs çözeltisi enjekte ederek sızıntı için kurulumu test edin. Sıvı sistostomiden sızarsa, kateteri sistostomi etrafında ek dikişle yeniden sabitleyin.

4. Transüretral kateterizasyon

1. 20 G x 1" I.V. kateterin ucunu (iğne çıkarılmış olarak) cerrahi kayganlaştırıcıya batırın.
2. Dış üretral meatusu bir çift forseps ile nazikçe tutun ve kateterin ucunu, uç bitişik vajinal açıklığın duvarının deforme olmasına neden olana kadar kuyruk yönünde üretral deliğe yerleştirin. Kateteri 90° döndürün (kateterin Luer-Lock ucunu kuyruğa doğru getirin) ve yavaşça ilerleyin. Luer-Lock göbeği eksternal üretral açıklıktan yaklaşık 5 mm distal olana kadar kateteri tamamen takın.
   NOT: Kateteri çok uzağa sokmayın, bu da ucun mesanenin iç duvarını dürtmesine neden olabilir. Kateteri ilerletirken direnç hissedilirse, durun ve tekrar başlayın, aksi takdirde üretrayı delme riski vardır. Başarılı kateterizasyonu artırmak için ipuçları hakkındaki tartışma bölümüne bakın.
3. Kateteri sabitleyin ve dış üretral meatusun etrafına 3-0 ipek sütür uzunluğunda kısa bir süre ilmek ilmek ve sıkıca bağlayarak kateterin etrafındaki sızıntıyı önleyin. Kateteri yanlışlıkla dışarı çekilmesini önlemek için kuyruğa bantla sabitleyin.
4. Kateterize edildikten sonra, Krebs çözeltisini suprapubik mesane kateteri yoluyla mesaneye nazikçe enjekte edin ve sıvının üretral kateterden dışarı aktığını ve etrafında akmadığını doğrulayın. Gerekirse, dış üretral deliğin etrafındaki dikişi emekli edin.
5. Mesane üzerindeki karın kesisini 3-0 ipek dikiş kullanarak kapatın.

5. Deney düzeni

1. Hayvanı, intravezikal sıvının üretral kateter yoluyla boşaltılmasına yardımcı olmak için eğimli olabilecek bir tahtaya sabitleyin. Vücut ısısını korumak ve üretral kateterden boşalan sıvıyı emmek için hayvan ve tahta arasına bir ısıtma yastığı ve emici alt ped yerleştirin.
2. Suprapubik kateteri, kateteri bir şırınga pompasına ve bir basınç dönüştürücüsüne bağlayan üç yönlü bir stopcock'a bağlayın. Basınç dönüştürücüsünü bir amplifikatör ve bir veri toplama sistemi aracılığıyla bir bilgisayara bağlayın.
   NOT: Şırınga pompasını, dönüştürücüyü ve mesane kateterini birbirine bağlayan boruda hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için özen gösterilmelidir.
3. Mesane basınç kaydını, basınç dönüştürücü ve / veya veri toplama yazılımı üreticisi tarafından önerilen prosedürü kullanarak kalibre edin.
4. Krebs solüsyonunu suprapubik kateterden 0.1 mL / dak oranında infüze edin ve kateter implantasyonları sırasında salınan artık ATP'yi yıkamak için sıvının üretral kateterden 1 saat boyunca boşalmasına izin verin.
5. Bu yıkama periyodundan sonra, üretral kateteri bir Luer-Lock tapası kullanarak kapatın ve mesanedeki basıncı ölçün. İntravezikal basınçta, basınçta keskin bir artış olmadan 30 cm_H2O'luk bir basınca yavaş bir artış olup olmadığına bakın, bu da mesane kasılmasını gösterir (bkz. Şekil 2). Mesanenin zarar görmesini önlemek için basınç 30 cm H₂O'ya ulaştığında tıkacı üretral kateterden çıkarın.
   NOT: Mesane kasılmaları 1 saat sonra oluşmaya devam ederse, ek bir heksametonyum dozu (5 mg / kg doz i.p.) verin.

6. Örneklerin toplanması

1. Mesaneyi 0.1 mL / dak'da infüze edin ve üretral kateterden elüatı toplayın. ATP için hemen elüatın 100 μL alikotlarını test edin (aşağıya bakınız) veya daha sonra parti miktarı için dondurun.
2. Mesane distansiyonunun luminal ATP konsantrasyonları üzerindeki etkisini test etmek için, üretral kateteri tıkaç ile kapatın ve istenen seviyeye ulaşana kadar mesane basıncını izleyin. Daha sonra, üretral kateterin kapağını açın ve yukarıda açıklandığı gibi ATP ölçümü veya donma için elatı toplayın.
3. Her distansiyondan sonra, ek numuneler almadan önce mesanenin dinlenmesine ve 10-15 dakika yıkanmasına izin verin. Tekrarlanabilirliği göstermek için istenen her distansiyon basıncında toplam 3-5 predistansiyon numunesi ve 3-5 numune alın.
4. İlaçların ATP salınımı üzerindeki etkisini test etmek için, mesaneyi infüze eden Krebs çözeltisini, seçilen ilacı içeren Krebs'e geçirin. İlacın bir etkiye sahip olması için 10-15 dakika boyunca 0.1 mL / dak'da perfüze edin ve daha sonra 6.1 ve 6.2. adımlarda açıklandığı gibi şişkin olmayan ve şişmiş mesanelerden örnekler toplayın.

7. Toplanan örneklerden ATP'nin ölçülmesi

1. Toplanan 100 μL numunelerdeki ATP'yi, üreticinin talimatlarını ve bir luminometreyi izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir lusiferin / lusiferaz tahlil kiti kullanarak sayısallaştırın.
   1. ATP'yi ölçmek için, 100 μL perfüzyonat numunesini 50 μL tahlil karışımı ile birleştirin ve okumak için luminometreye yerleştirin. Luminometre tarafından bildirilen Bağıl Işık Birimlerini (RLU'lar) bir ATP konsantrasyonuna dönüştürmek için, standart bir eğri oluşturmak ve bunları luminometrede okumak için Krebs çözeltisinde 1 μM ila 10 pM arasında değişen seri ATP seyreltmeleri yapın. Elde edilen okumaları bir grafik üzerinde çizin ve hayvandan alınan örneklerden konsantrasyonları tahmin etmek için doğrusal olmayan (ikinci dereceden) bir regresyon gerçekleştirin.
      NOT: Deneyde test edilen herhangi bir ilaç çözeltisi için ATP standartları oluşturmak önemlidir, çünkü birçok ilaç düzeltilmesi gereken lusiferin / lusiferaz reaksiyonuna müdahale eder.

8. Hayvanların ötenazisi

1. Deney tamamlandığında ve tüm örnekler toplandığında, hayvanı USDA kılavuzlarına ve Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzuna göre insani olarak ötenazi yapın.
   1. Anestezi uygulanan hayvanı deney düzeneğinden çıkarın, kapalı bir kutuya koyun ve% 100 CO_{2 ile gazlayın}. Doldurma hızının dakikada hazne hacminin %30-%70'ine eşit olduğundan emin olun (örneğin, 10 L hacimli bir kutu için 3-7 L/dak). Solunum durduktan sonra CO₂ akışına en az 1 dakika devam edin.
2. Ölümü sağlamak için ikincil bir ötenazi formu kullanın.
   1. Sternumun kaudal ucundaki küçük deri flebini kavrayarak ve diyaframdaki cilt ve kas yapısında küçük bir deliği keskin bir makasla keserek ikincil bir ötenazi formu olarak torakotomi yapın. Makası açıklığa sokarak ve göğüs kafesinden rostral olarak keserek ve göğüs boşluğunu açığa çıkararak torakotomiyi tamamlayın.
      NOT: Ötanize edilen hayvan, kurumsal yönergelere göre bertaraf edilmelidir.

Sonuçlar

Tarif edilen protokol, standart kemirgen sistometri kurulumunun modifiye edilmiş bir versiyonunu kullanarak, mesanenin lümeninden ürotelyal ATP salınımının in vivo olarak doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar (bkz. Şekil 1). Bu, araştırmacının ilaçların fizyolojik bir ortamda streç aracılı ATP salınımı üzerindeki etkilerini incelemesini sağlar.

Tartışmalar

Ürotelyal ATP salınımı ile ilgili araştırmaların çoğu, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları veya kemirgen ürotelyal hücrelerinin birincil kültürleri kullanılarak kültürlenmiş hücrelerde gerçekleştirilir. Bu modeller nispeten yüksek verim avantajına sahip olsa da (yani, bir kültür / pasaj birçok tabak / hücre tabağı yapabilir), fizyolojik alaka düzeyleri şunlardan dolayı azalır: 1) ürotelyal hücrelerin özel destekler üzerinde yetiştirilmedikçe polarize büyüyememesi ve 2) kültür...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose