İn Vivo Kemirgenlerde Distansiyon Uyarılmış Ürotelyal ATP Salınımının Luminal Ölçümü

Özet

Bu protokol, anestezi uygulanan bir kemirgende mesanenin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını ölçme prosedürünü açıklar.

Özet

Mesane distansiyonuna yanıt olarak ürotelyumdan salınan ATP'nin, işitasyonun kontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir. Bu nedenle, ürotelyal ATP salınımının fizyolojik bir ortamda doğru ölçülmesi, idrar kesesinde pürinerjik sinyalleşmeyi kontrol eden mekanizmaların incelenmesinde önemli bir ilk adımdır. Mekanik olarak uyarılmış ürotelyal ATP salınımını incelemek için mevcut teknikler, esnek destekler üzerine kaplanmış kültürlü hücreleri veya Ussing odalarına sabitlenmiş mesane dokusunu kullanır; Bununla birlikte, bu tekniklerin her biri, sağlam mesanedeki koşulları tam olarak taklit etmez. Bu nedenle, kemirgen idrar kesesinin lümenindeki ATP konsantrasyonlarını doğrudan ölçmek için deneysel bir kurulum geliştirilmiştir.

Bu kurulumda, anestezi uygulanan kemirgenlerin mesaneleri, hem mesanenin kubbesindeki kateterlerden hem de dış üretral delikten geçirilir. Mesanedeki basınç, üretral kateterin kapatılmasıyla arttırılırken, steril sıvının kubbe yoluyla mesaneye nüfuz ettirilmesiyle arttırılır. İntravezikal basıncın ölçümü, sistometri için kullanılan kuruluma benzer şekilde, mesane kubbe kateterine bağlı bir basınç transdüseri kullanılarak gerçekleştirilir. İstenilen basınca ulaşıldıktan sonra, üretral kateter kapağı çıkarılır ve lusiferin-lusiferaz testi ile ATP nicelleştirmesi için sıvı toplanır. Bu deney düzeneği sayesinde, ürotelyal ATP salınımının hem mekanik hem de kimyasal stimülasyonunu kontrol eden mekanizmalar, perfüzyona çeşitli agonistler veya antagonistler dahil edilerek veya vahşi tip ve genetiği değiştirilmiş hayvanlar arasındaki sonuçlar karşılaştırılarak sorgulanabilir.

Giriş

Üriner ATP'nin miksiyon^kontrolünde önemli bir duyusal rol oynadığı düşünülmektedir 1. Örneğin, ATP'nin, uyarılabilirliklerini arttırmak için mesane afferent sinirleri üzerindeki reseptörler üzerinde hareket edebileceği ve dolgunluk hissine yol açabileceği distansiyona yanıt olarak ürotelyumdan salındığı düşünülmektedir². Bu nedenle, idrar ATP'sinin mesane patolojilerinin gelişiminde önemli bir oyuncu olabileceği düşünülmektedir. Bu hipotezi desteklemek için, aşırı aktif mesane (OAB)³, mesane ağrısı sendromu/interstisyel sistit (BPS/IC)⁴ veya idrar yolu enfeksiyonu (İYE)

Protokol

Kemirgenlerde gerçekleştirilen tüm prosedürler geçerli kılavuzlara uymalı ve yerel kurumsal etik inceleme komitesi tarafından onaylanmalıdır. Bu makale için yapılan deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirilmiş ve Pittsburgh Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan standart kemirgen sistometri kurulumunun değiştirilmiş bir versiyonu için Şekil 1'e bakınız.

1. Laboratuvar hayvanları

1. Sıçanları sosyal konutlarda (bir k....

Sonuçlar

Tarif edilen protokol, standart kemirgen sistometri kurulumunun modifiye edilmiş bir versiyonunu kullanarak, mesanenin lümeninden ürotelyal ATP salınımının in vivo olarak doğru bir şekilde ölçülmesini sağlar (bkz. Şekil 1). Bu, araştırmacının ilaçların fizyolojik bir ortamda streç aracılı ATP salınımı üzerindeki etkilerini incelemesini sağlar.

Tartışmalar

Ürotelyal ATP salınımı ile ilgili araştırmaların çoğu, ölümsüzleştirilmiş hücre hatları veya kemirgen ürotelyal hücrelerinin birincil kültürleri kullanılarak kültürlenmiş hücrelerde gerçekleştirilir. Bu modeller nispeten yüksek verim avantajına sahip olsa da (yani, bir kültür / pasaj birçok tabak / hücre tabağı yapabilir), fizyolojik alaka düzeyleri şunlardan dolayı azalır: 1) ürotelyal hücrelerin özel destekler üzerinde yetiştirilmedikçe polarize büyüyememesi ve 2) kültür.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose