생체 내 설치류에서 팽창 유발 요로 상피 ATP 방출의 내강 측정

요약

이 프로토콜은 마취 된 설치류에서 방광 내강의 ATP 농도를 측정하는 절차를 설명합니다.

초록

방광 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 ATP는 배뇨 조절에 중요한 감각 역할을하는 것으로 생각됩니다. 따라서 생리학적 환경에서 요로상피 ATP 방출을 정확하게 측정하는 것은 방광에서 청도성 신호 전달을 제어하는 메커니즘을 연구하는 중요한 첫 번째 단계입니다. 기계적으로 유발 된 요로 상피 ATP 방출을 연구하는 기존 기술은 Ussing 챔버에 고정 된 유연한 지지체 또는 방광 조직에 도금 된 배양 세포를 활용합니다. 그러나 이러한 각 기술은 손상되지 않은 방광의 상태를 완전히 모방하지 않습니다. 따라서 설치류 방광의 내강에서 ATP 농도를 직접 측정하기위한 실험 설정이 개발되었습니다.

이 설정에서 마취 된 설치류의 방광은 방광의 돔과 외부 요도 구멍을 통해 카테터를 통해 관류됩니다. 방광의 압력은 요도 카테터를 덮는 동시에 멸균 유체를 돔을 통해 방광으로 관류함으로써 증가합니다. 방광 내 압력 측정은 방광 돔 카테터에 부착 된 압력 변환기를 사용하여 이루어지며, 방광 측정에 사용되는 설정과 유사합니다. 원하는 압력에 도달하면 요도 카테터의 캡을 제거하고 루시페린-루시페라아제 분석에 의해 ATP 정량화를 위해 유체를 수집합니다. 이 실험 설정을 통해 요로 상피 ATP 방출의 기계적 및 화학적 자극을 제어하는 메커니즘은 관류에 다양한 작용제 또는 길항제를 포함하거나 야생형과 유전자 변형 동물 간의 결과를 비교하여 조사 할 수 있습니다.

서문

비뇨기 ATP는 배뇨¹의 조절에 중요한 감각적 역할을 하는 것으로 생각됩니다. 예를 들어, ATP는 방광 구 심성 신경의 수용체에 작용하여 흥분성을 증가시켜 충만감을 유발할 수있는 팽창에 반응하여 요로 상피에서 방출되는 것으로 생각됩니다². 따라서 비뇨기 ATP는 방광 병리의 발달에 중요한 역할을 할 수 있다고 생각됩니다. 이 가설을 뒷받침하기 위해 과민성 방광(OAB)³, 방광 통증 증후군/간질성 방광염(BPS/IC)⁴ 또는 요로 감염(UTI)^5,6을 앓고 있는 환자에서 요중 ATP 농도가 유의하게 증가하며, 모든 상태는 긴급성^, 빈도 및 때로는 통증 증가를 특징으로 합니다. 반대로, 방광을 비울 수 없고 때때로 방광 충만감을 감지하는 능력이 감소할 수 있는 저활동성 방광(UAB)을 앓고 있는 환자는 소변 ATP 농도가 감소한 것으로^{나타났습니다7.} 실험적으로 소변 ATP 농도를 조작하면 쥐의 방광 반사가 바뀔 수 있습니다. 방광 내강에서 내인성 ATPase를 차단하여 ATP 농도를 높이면 배뇨 빈도가 증가할 수 있는 반면, 외인성 ATPase를 방광에 주입하여 ATP 농도를 낮추면 배^{뇨 빈도가} 감소합니다8. 따라서 방광 기능에 대한 비뇨기 ATP의 중요성은 분명합니다.

방광 병리학에 대한 비뇨기 ATP의 명백한 중요성을 감안할 때, 요로 상피 ATP 방출의 정확한 측정은 방출을 제어하는 메커니즘을 이해하는 데 중요한 단계입니다. 요로 상피 ATP 방출을 측정하기 위해 다양한 실험 모델을 사용하여 많은 연구가 완료되었습니다. 이들 중 가장 중요한 것은 1 차 배양 또는 세포주 중 하나 인 세포 배양입니다. 그러나 배양된 요로상피 세포의 사용은 요로상피 세포가 특수 투과성 막(예: Transwell 기술[웰 인서트])에서 성장하지 않는 한 생리학적 분극 형태를 취하지 않는다는 사실로 인해 복잡합니다.⁹. 따라서, 측정된 임의의 ATP 방출을 생리학과 연관시키는 것은 어렵다. 웰 삽입물에서 성장한 요로 상피 세포는 분극화되어 생체 내에서 볼 수있는 것과 유사한 장벽을 형성 할 수 있습니다. 그러나 완전히 분화 된 요로 상피의 성장에는 며칠 또는 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 추가적으로, 웰 인서트를 Ussing 챔버에 장착하고 정점 측에 압력을 가하여 스트레칭을 유발할 수 있지만, 병리학 동안 방광 내부의 조건(즉, 30cm_H2O이상의 압력)을 모방하기에 충분한 압력을 가하는 것은 어렵다. 전체 방광 조직은 스트레치 실험을 위해 Ussing 챔버에 장착 할 수도 있지만, 이는 요로 상피 세포 건강 및 요로 상피 장벽 기능을 유지하는 영양 인자와 함께 유기체에서 방광을 제거합니다. 따라서 스트레칭이나 압력에 반응하여 요로 상피에서 ATP의 방출을 연구하는 가장 생리 학적으로 관련된 방법은 생체 내입니다. 실험을 설정하는 데 필요한 수술 기술은 동물 방광 측정술에서 일반적으로 사용되는 것과 동일하므로 해당 기술에 익숙한 사람이라면 누구나 쉽게 수행 할 수 있어야합니다.

이 프로토콜에서는 아래에 설명 된 경 요도 카테터 삽입이 암컷에서 훨씬 쉽기 때문에 체중이 약 200-250g 인 암컷 Sprague Dawley 쥐에서 내강 ATP를 검사하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 그러나, 경요도 카테터 삽입은 또한 수컷 설치류¹⁰에서 수행될 수 있다. 경요도 카테터 삽입술이 현재 남녀 모두의 마우스에서도 수행되었기 때문에¹¹, 이러한 실험은 연구팀의 필요에 따라 성별 또는 다양한 크기의 마우스 또는 쥐에 쉽게 적응할 수 있습니다.

프로토콜

설치류에서 수행되는 모든 절차는 해당 지침을 준수해야하며 지역 기관 윤리 검토위원회의 승인을 받아야합니다. 이 원고를 위해 수행 된 실험은 국립 연구위원회의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 피츠버그 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 표준 설치류 방광 측정 설정의 수정 된 버전은 그림 1 을 참조하십시오.

1. 실험실 동물

1. 쥐를 사회 주택 (한 케이지에 여러 설치류)에 12 시간의 명암 주기와 물과 음식 알갱이에 대한 자유로운 접근으로 유지하십시오.

2. 마취 및 신경절 차단

1. O2 (1 L / min)에서 4 % -5 % 이소 플루 란으로 가스를 주입 한 밀폐 된 상자에 동물을 넣어 초기 마취를 유도하십시오.
2. 우레탄을 사용하여 동물을 마취하십시오.
   1. 우레탄을 1.2g/kg의 용량으로 양측 피하(동물의 각 면에 1/2 용량) 주사합니다. 우레탄이 효과를 발휘할 수 있도록 동물을 새장에 넣으면 일반적으로 2 시간이 걸립니다.
   2. 또는 우레탄을 복강 내 (i.p.)로 투여하여 전체 용량을 두 개의 개별 용량으로 ~ 10 분 간격으로 주사합니다.
3. 우레탄이 효과를 발휘할 때까지 적절한 시간 (sc : 2 시간, i.p. : 30 분)을 기다린 후 집게를 사용하여 동물의 발을 꼬집어 적절한 마취면을 테스트하십시오. 반사가 관찰되면 추가 용량의 우레탄 (0.05-0.1 mL i.p.)을 투여하고 15 분 동안 기다린 다음 다시 테스트하십시오. 절차 전반에 걸쳐 적절한 마취 평면에 대해 동물을 계속 모니터링하십시오.
4. 팽창 중 방광의 수축을 방지하려면 동물에게 헥사 메토 늄 (20 mg / kg, i.p.)과 같은 신경절 차단제를 주사하십시오.
5. 실험 중 건조를 방지하기 위해 동물의 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.

3. 수술 절차-치골 상 방광 카테터 삽입

1. 동물의 복부를 면도하고 정중선 개복술을 시행하여 방광을 노출시킵니다.
2. 화염을 사용하여 짧은(~15cm) 길이의 PE50 의료 튜브의 한쪽 끝을 플레어링하여 카테터를 준비합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 22G 바늘을 놓고 Krebs 용액으로 채 웁니다 (구성에 대한 재료 표 참조).
3. 방광의 돔 위에 3-0 실크 봉합사의 작은 고리를 놓고 위에서 만든 카테터의 플레어 끝을 삽입 할 수있을만큼 큰 작은 방광 절제술 (가는 가위 또는 18G 바늘 사용)을 수행합니다. 한 손으로 카테터를 제자리에 잡고 다른 손으로 봉합사의 고리를 조여 카테터를 제자리에 고정합니다. 봉합사에 두 개의 매듭을 묶고 플레어 헤드가 방광 벽과 접촉 할 때까지 카테터를 뒤로 당겨 카테터 고정을 마칩니다.
   1. 또는 방광 측정법¹²에 대해 이전에 설명한 것처럼 고전적인 지갑 끈 봉합 기술을 사용하여 카테터를 고정합니다.
      알림: 이 절차 중에 방광에 기포가 유입되지 않도록 해야 합니다.
4. 카테터를 통해 소량의 Krebs 용액을 주입하여 누출 설정을 테스트합니다. 유체가 방광 절제술에서 누출되면 방광 절제술 주위에 추가 봉합사로 카테터를 다시 고정하십시오.

4. 경요도 카테터 삽입

1. 20G x 1" IV 카테터(바늘이 제거된 상태)의 끝을 수술용 윤활유에 담급니다.
2. 한 쌍의 집게로 외부 요도 미투스를 부드럽게 잡고 팁이 인접한 질 입구의 벽이 변형 될 때까지 카테터 끝을 꼬리 방향으로 요도 구멍에 삽입합니다. 카테터를 90° 회전하고(카테터의 Luer-Lock 끝을 꼬리 쪽으로 가져옴) 부드럽게 전진합니다. Luer-Lock 허브가 외부 요도 개구부에서 약 5mm 원위가 될 때까지 카테터를 완전히 삽입합니다.
   알림: 팁이 방광 내벽을 찌를 수 있으므로 카테터를 너무 멀리 삽입하지 마십시오. 카테터를 전진시키는 동안 저항이 느껴지면 중지했다가 다시 시작하거나 요도에 구멍이 뚫릴 위험이 있습니다. 성공적인 카테터 삽입을 늘리기 위한 팁에 대한 토론 섹션을 참조하십시오.
3. 외부 요도 미투스 주위에 짧은 길이의 3-0 실크 봉합사를 고리로 묶어 카테터를 고정하고 카테터 주위의 누출을 방지합니다. 카테터가 실수로 빠지지 않도록 테이프로 꼬리에 고정하십시오.
4. 카테터 삽입이 완료되면 치골상 방광 카테터를 통해 Krebs 용액을 방광에 부드럽게 주입하고 체액이 요도 카테터 주변이 아닌 요도 카테터 밖으로 흘러나오는지 확인합니다. 필요한 경우 외부 요도 구멍 주위의 봉합사를 다시 고정하십시오.
5. 3-0 실크 봉합사를 사용하여 방광 위의 복부 절개를 닫습니다.

5. 실험 설정

1. 요도 카테터를 통한 방광 내 유체의 배출을 도울 수있는 보드에 동물을 고정하십시오. 동물과 보드 사이에 가열 패드와 흡수성 언더 패드를 놓아 체온을 유지하고 요도 카테터에서 배출되는 체액을 흡수합니다.
2. 치골 상부 카테터를 3 방향 스톱 콕에 연결하고 카테터를 주사기 펌프 및 압력 변환기에 연결합니다. 압력 변환기를 증폭기와 데이터 수집 시스템을 통해 컴퓨터에 연결합니다.
   알림: 주사기 펌프, 변환기 및 방광 카테터를 연결하는 튜브에 기포가 형성되지 않도록 주의해야 합니다.
3. 압력 변환기 및/또는 데이터 수집 소프트웨어 제조업체에서 제안한 절차를 사용하여 방광 압력 기록을 교정합니다.
4. 0.1mL/min의 속도로 치골상 카테터를 통해 Krebs 용액을 주입하고 유체가 요도 카테터에서 1시간 동안 배출되도록 하여 카테터 이식 중에 방출되는 잔류 ATP를 씻어냅니다.
5. 이 세척 기간이 지나면 Luer-Lock 플러그를 사용하여 요도 카테터를 덮고 방광의 압력을 측정합니다. 방광 수축을 나타내는 압력의 급격한 증가없이 30cm H 2 O의 압력으로 방광 내압력이 천천히 상승하는 것을 찾으십시오 (그림 2 참조). 방광 손상을 방지하기 위해 압력이 30cm H₂O에 도달하면 요도 카테터에서 플러그를 제거하십시오.
   알림: 1 시간 후에도 방광 수축이 계속 발생하면 헥사 메 토늄을 추가로 투여하십시오 (5mg / kg 용량 i.p.).

6. 샘플 수집

1. 방광에 0.1mL/min을 주입하고 요도 카테터에서 용출액을 수집합니다. ATP에 대해 용리액의 100μL 분취량을 즉시 테스트하거나(아래 참조) 이후 배치 정량화를 위해 동결합니다.
2. 방광 팽창이 내강 ATP 농도에 미치는 영향을 테스트하려면 요도 카테터를 플러그로 덮고 원하는 수준에 도달할 때까지 방광 압력을 모니터링합니다. 이어서, 요도 카테터의 캡을 풀고 전술한 바와 같이 ATP 측정 또는 동결을 위한 용출액을 수집한다.
3. 각 팽창 후 방광을 쉬게하고 추가 샘플을 채취하기 전에 10-15 분 동안 씻어냅니다. 반복성을 입증하기 위해 각 원하는 팽창 압력에서 총 3-5개의 팽창 샘플과 3-5개의 샘플을 취하십시오.
4. ATP 방출에 대한 약물의 효과를 테스트하려면 방광을 주입하는 Krebs 용액을 선택한 약물이 들어있는 Krebs로 전환하십시오. 약물이 효과를 내기 위해 0.1mL/min으로 10-15분 동안 관류한 다음 6.1단계 및 6.2단계에 설명된 대로 팽창되지 않고 팽창된 방광에서 샘플을 수집합니다.

7. 수집된 샘플에서 ATP 정량화

1. 제조업체의 지침과 루미노미터에 따라 시중에서 판매하는 루시페린/루시페라아제 분석 키트를 사용하여 수집된 100μL 샘플에서 ATP를 정량화합니다.
   1. ATP를 정량화하려면 100μL 향수 샘플을 50μL의 분석 혼합물과 결합하고 판독을 위해 루미노미터에 놓습니다. 광도계에서 보고한 상대광 단위(RLU)를 ATP 농도로 변환하려면 1μM에서 10pM 범위의 Krebs 용액에서 ATP를 10배 희석하여 표준 곡선을 만들고 광도계에서 읽습니다. 결과 판독값을 그래프에 플로팅하고 비선형(2차) 회귀를 수행하여 동물에서 채취한 샘플의 농도를 외삽합니다.
      참고: 많은 약물이 루시페린/루시페라아제 반응을 방해하므로 실험에서 테스트한 모든 약물 용액에 대해 ATP 표준을 만드는 것이 중요합니다.

8. 동물의 안락사

1. 실험이 완료되고 모든 샘플이 수집되면 USDA 지침 및 국립 연구위원회의 실험실 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 동물을 인도적으로 안락사시킵니다.
   1. 실험 설정에서 마취된 동물을 제거하고 밀폐된 상자에 넣고 100%_CO2로 가스를 가스화합니다. 충전 속도가 분당 챔버 부피의 30%-70%와 같은지 확인합니다(예: 부피가 3L인 상자의 경우 7-10L/분). 호흡이 멈춘 후 적어도 1분 동안_CO2 흐름을 계속한다.
2. 죽음을 보장하기 위해 2 차 형태의 안락사를 사용하십시오.
   1. 흉골의 꼬리 끝에있는 피부의 작은 플랩을 잡고 날카로운 가위로 횡격막의 피부와 근육계에 작은 구멍을 뚫어 안락사의 2 차 형태로 개흉술을 시행하십시오. 가위를 개구부에 삽입하고 흉곽을 통해 주둥이를 자르고 흉강을 노출시켜 개흉술을 완료하십시오.
      참고: 안락사된 동물은 제도적 지침에 따라 폐기해야 합니다.

결과

설명 된 프로토콜은 표준 설치류 방광 측정 설정의 수정 된 버전을 사용하여 방광 내강에서 생체 내에서 urothelial ATP 방출을 정확하게 측정 할 수 있습니다 ( 그림 1 참조). 이를 통해 연구원은 생리학적 환경에서 스트레치 매개 ATP 방출에 대한 약물의 효과를 조사할 수 있습니다.

토론

요로 상피 ATP 방출에 대한 대부분의 연구는 불멸화 된 세포주 또는 설치류 요로 상피 세포의 1 차 배양을 사용하여 배양 된 세포에서 수행됩니다. 이러한 모델은 상대적으로 높은 처리량(즉, 하나의 배양/계대가 많은 세포 플레이트/접시를 만들 수 있음)이라는 이점이 있지만, 1) 특수 지지체에서 성장하지 않는 한 요로 상피 세포가 분극적으로 성장할 수 없고 2) 배양된 세포를 생리학적 수준의 스?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose