In vivo Mesure luminale de la libération d’ATP urothéliale évoquée par distension chez les rongeurs

Résumé

Ce protocole décrit la procédure de mesure des concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie chez un rongeur anesthésié.

Résumé

On pense que l’ATP, libéré par l’urothélium en réponse à la distension de la vessie, joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction. Par conséquent, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale dans un contexte physiologique est une première étape importante dans l’étude des mécanismes qui contrôlent la signalisation purinergique dans la vessie. Les techniques existantes pour étudier la libération d’ATP urothéliale évoquée mécaniquement utilisent des cellules cultivées plaquées sur des supports flexibles ou des tissus vésicaux épinglés dans des chambres d’Ussing; Cependant, chacune de ces techniques n’imite pas complètement les conditions dans la vessie intacte. Par conséquent, une installation expérimentale a été développée pour mesurer directement les concentrations d’ATP dans la lumière de la vessie des rongeurs.

Dans cette configuration, les vessies des rongeurs anesthésiés sont perfusées à travers des cathéters à la fois dans le dôme de la vessie et via l’orifice urétral externe. La pression dans la vessie est augmentée en coiffant le cathéter urétral tout en perfusant du liquide stérile dans la vessie à travers le dôme. La mesure de la pression intravésicale est réalisée à l’aide d’un transducteur de pression fixé au cathéter à dôme vésical, semblable à la configuration utilisée pour la cystométrie. Une fois la pression désirée atteinte, le capuchon du cathéter urétral est retiré et le liquide prélevé pour la quantification de l’ATP par dosage de la luciférine-luciférase. Grâce à cette configuration expérimentale, les mécanismes contrôlant à la fois la stimulation mécanique et chimique de la libération d’ATP urothéliale peuvent être interrogés en incluant divers agonistes ou antagonistes dans le perfusat ou en comparant les résultats entre les animaux de type sauvage et génétiquement modifiés.

Introduction

On pense que l’ATP urinaire joue un rôle sensoriel important dans le contrôle de la miction¹. Par exemple, on pense que l’ATP est libéré de l’urothélium en réponse à la distension où il peut agir sur les récepteurs des nerfs afférents de la vessie pour augmenter leur excitabilité, conduisant à des sensations de plénitude². Ainsi, on pense également que l’ATP urinaire pourrait être un acteur important dans le développement des pathologies de la vessie. À l’appui de cette hypothèse, les concentrations urinaires d’ATP sont significativement augmentées chez les patients souffrant d’hyperactivité vésicale (vessie hyperactive)³, de syndrome de douleur vésicale/cystite interstitielle (SPB/IC)⁴ ou d’infection des voies urinaires (IVU)^5,6, toutes conditions caractérisées par une urgence, une fréquence et^, parfois, une douleur accrues. À l’inverse, il a été démontré que les patients souffrant de vessie sous-active (UAB), qui se caractérise par une incapacité à vider sa vessie et peut parfois inclure une diminution de la capacité à sentir la plénitude de la vessie, ont diminué les concentrations urinaires^{d’ATP 7}. Expérimentalement, la manipulation des concentrations urinaires d’ATP peut modifier les réflexes vésicaux chez le rat; l’augmentation des concentrations d’ATP en bloquant les ATPases endogènes dans la lumière de la vessie peut augmenter la fréquence de miction, tandis que la diminution des concentrations d’ATP en instillant des ATPases exogènes dans la vessie réduit la fréquence de miction⁸. Ainsi, l’importance de l’ATP urinaire pour la fonction de la vessie est claire.

Compte tenu de l’importance apparente de l’ATP urinaire pour la pathologie de la vessie, la mesure précise de la libération d’ATP urothéliale est une étape importante dans la compréhension des mécanismes qui contrôlent la libération. De nombreuses études ont été réalisées en utilisant différents modèles expérimentaux pour mesurer la libération d’ATP urothéliale. Au premier rang d’entre eux sont les cultures cellulaires, soit des cultures primaires, soit des lignées cellulaires. Cependant, l’utilisation de cellules urothéliales en culture est compliquée par le fait que les cellules urothéliales ne prennent pas leur morphologie polarisée physiologique à moins qu’elles ne soient cultivées sur des membranes perméables spéciales (telles que la technologie Transwell [inserts de puits])⁹. Ainsi, il est difficile de relier une libération d’ATP mesurée à la physiologie. Les cellules urothéliales cultivées sur des inserts de puits peuvent se polariser et former une barrière semblable à ce que l’on voit in vivo; Cependant, la croissance d’un urothélium complètement différencié peut prendre des jours ou des semaines. De plus, bien qu’il soit possible de monter des inserts de puits dans une chambre d’Ussing et d’appliquer une pression sur le côté apical pour provoquer un étirement, il est difficile d’appliquer une pression suffisante pour imiter les conditions à l’intérieur de la vessie pendant la pathologie (c.-à-d. pressions de 30 cm H₂O ou plus). Le tissu entier de la vessie peut également être monté dans une chambre d’Ussing pour des expériences d’étirement, mais cela élimine la vessie de l’organisme ainsi que les facteurs trophiques maintenant la santé des cellules urothéliales et, par conséquent, la fonction de barrière urothéliale. Par conséquent, la façon la plus physiologiquement pertinente d’étudier la libération d’ATP par l’urothélium en réponse à l’étirement ou à la pression est in vivo. Les techniques chirurgicales nécessaires à la mise en place de l’expérience sont identiques à celles couramment utilisées en cystométrie animale et, par conséquent, devraient être facilement effectuées par toute personne familière avec cette technique.

Dans ce protocole, nous décrirons la technique utilisée pour examiner l’ATP luminal chez les rats Sprague Dawley femelles pesant environ 200-250 g, car le cathétérisme transurétral décrit ci-dessous est beaucoup plus facile chez les femelles; Cependant, le cathétérisme transurétral peut également être effectué chez les rongeurs mâles¹⁰. Comme le cathétérisme transurétral a maintenant été effectué chez des souris des deux sexes¹¹, ces expériences peuvent facilement être adaptées à des souris ou des rats des deux sexes ou de tailles variables, selon les besoins de l’équipe de recherche.

Protocole

Toutes les procédures effectuées chez les rongeurs doivent respecter les lignes directrices applicables et être approuvées par le comité d’éthique de l’établissement local. Les expériences réalisées pour ce manuscrit ont été réalisées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du Conseil national de recherches du Canada et approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la faculté de médecine de l’Université de Pittsburgh. Voir la figure 1 pour une version modifiée de la configuration standard de cystométrie des rongeurs utilisée dans ce protocole.

1. Animaux de laboratoire

1. Maintenir les rats dans des logements sociaux (plusieurs rongeurs dans une cage) avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et un accès ad libitum à de l’eau et des granulés de nourriture.

2. Anesthésie et bloc ganglionnaire

1. Induire l’anesthésie initiale en plaçant l’animal dans une boîte fermée gazée avec 4 % à 5 % d’isoflurane dans O₂ (1 L/min).
2. Anesthésiez l’animal à l’aide d’uréthane.
   1. Injecter de l’uréthane par voie sous-cutanée bilatérale (1/2 dose de chaque côté de l’animal) à une dose de 1,2 g/kg. Placez l’animal dans une cage pour permettre à l’uréthane de faire effet, ce qui prend généralement 2 h.
   2. Alternativement, administrer l’uréthane par voie intrapéritonéale (i.p.) en injectant la dose complète en deux doses distinctes ~ 10 min d’intervalle.
3. Après avoir attendu le moment opportun pour que l’uréthane fasse effet (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), tester un plan d’anesthésie approprié en pinçant le pied de l’animal à l’aide d’une pince. Si un réflexe est observé, administrer une dose supplémentaire d’uréthane (0,05-0,1 mL i.p.), attendre 15 minutes et tester à nouveau. Continuez à surveiller l’animal pour le plan d’anesthésie approprié tout au long de la procédure.
4. Pour éviter une contraction de la vessie lors de la distension, injecter à l’animal un agent bloquant ganglionnaire, tel que l’hexaméthonium (20 mg/kg, i.p.).
5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de l’animal pour éviter le dessèchement pendant l’expérience.

3. Procédure chirurgicale - cathétérisme vésical sus-pubien

1. Rasez l’abdomen de l’animal et effectuez une laparotomie médiane pour exposer la vessie.
2. Préparer un cathéter en évasant une extrémité d’une courte longueur (~10-15 cm) de tube intramédical PE50 à l’aide d’une flamme. Placez une aiguille de 22 G à l’autre extrémité du tube et remplissez-la de solution de Krebs (voir le tableau des matériaux pour la composition).
3. Placez une petite boucle de suture de soie 3-0 sur le dôme de la vessie et effectuez une petite cystostomie (à l’aide de ciseaux fins ou d’une aiguille de 18 G) suffisamment grande pour insérer l’extrémité évasée du cathéter fabriqué au-dessus. Avec une main tenant le cathéter en place, utilisez l’autre main pour resserrer la boucle de la suture afin de fixer le cathéter en place. Terminez de fixer le cathéter en attachant deux nœuds dans la suture et en tirant le cathéter vers l’arrière jusqu’à ce que la tête évasée soit en contact avec la paroi de la vessie.
   1. Vous pouvez également fixer le cathéter à l’aide d’une technique classique de suture à cordon de bourse, comme décrit précédemment pour la cystométrie¹².
      REMARQUE: Il est impératif de ne pas introduire de bulles d’air dans la vessie pendant cette procédure.
4. Testez la configuration pour détecter les fuites en perfusant une petite quantité de solution de Krebs à travers le cathéter. Si le liquide s’échappe de la cystostomie, refixez le cathéter avec une suture supplémentaire autour de la cystostomie.

4. Cathétérisme transurétral

1. Trempez l’extrémité d’un cathéter intraveineux de 20 G x 1 » (avec l’aiguille retirée) dans un lubrifiant chirurgical.
2. Tenez doucement le méat urétral externe avec une paire de pinces et insérez l’extrémité du cathéter dans l’orifice urétral dans la direction de la queue jusqu’à ce que l’extrémité provoque la déformation de la paroi de l’ouverture vaginale adjacente. Faites pivoter le cathéter de 90° (en amenant l’extrémité Luer-Lock du cathéter vers la queue) et avancez doucement. Insérez complètement le cathéter jusqu’à ce que le moyeu Luer-Lock soit distal d’environ 5 mm de l’ouverture urétrale externe.
   REMARQUE: N’insérez pas le cathéter trop loin, ce qui pourrait provoquer une poussée de la paroi interne de la vessie. Si une résistance est ressentie en avançant le cathéter, arrêtez-vous et recommencez ou risquez de perforer l’urètre. Voir la section de discussion sur les conseils pour augmenter le succès du cathétérisme.
3. Fixez le cathéter et évitez les fuites autour du cathéter en bouclant une courte longueur de suture de soie 3-0 autour du méat urétral externe et attachez-le fermement. Fixez le cathéter à la queue avec du ruban adhésif pour éviter qu’il ne soit accidentellement retiré.
4. Une fois le cathétérisme effectué, infuser doucement la solution de Krebs dans la vessie à travers le cathéter vésical sus-pubien et confirmer que le liquide s’écoule hors du cathéter urétral et non autour de celui-ci. Si nécessaire, renouez la suture autour de l’orifice urétral externe.
5. Fermez l’incision abdominale sur la vessie à l’aide d’une suture en soie 3-0.

5. Configuration expérimentale

1. Fixez l’animal sur une planche capable d’être inclinée pour aider à l’évacuation du liquide intravésical à travers le cathéter urétral. Placez un coussin chauffant et un sous-coussin absorbant entre l’animal et la planche pour maintenir la chaleur corporelle et absorber le liquide qui s’écoule du cathéter urétral.
2. Connectez le cathéter sus-pubien à un robinet d’arrêt à trois voies, qui relie le cathéter à une pompe à seringue et à un transducteur de pression. Connectez le transducteur de pression à un ordinateur au moyen d’un amplificateur et d’un système d’acquisition de données.
   REMARQUE: Des précautions doivent être prises pour empêcher la formation de bulles d’air dans le tube reliant la pompe à seringue, le transducteur et le cathéter de la vessie.
3. Calibrer l’enregistrement de la pression vésicale en utilisant la procédure suggérée par le fabricant du transducteur de pression et/ou du logiciel d’acquisition de données.
4. Injecter la solution de Krebs à travers le cathéter sus-pubien à un débit de 0,1 mL/min et laisser le liquide s’écouler du cathéter urétral pendant 1 h pour éliminer tout résidu d’ATP libéré lors des implantations du cathéter.
5. Après cette période de lavage, boucher le cathéter urétral à l’aide d’un bouchon Luer-Lock et mesurer la pression dans la vessie. Rechercher une augmentation lente de la pression intravésicale jusqu’à une pression de 30 cm_H2Osans forte augmentation de la pression, ce qui indiquerait une contraction de la vessie (voir Figure 2). Retirez le bouchon du cathéter urétral lorsque la pression atteint 30 cm_H2Opour éviter d’endommager la vessie.
   NOTE: Si les contractions de la vessie continuent de se produire après 1 h, administrer une dose supplémentaire d’hexaméthonium (dose de 5 mg / kg i.p.).

6. Prélèvement d’échantillons

1. Infuser la vessie à 0,1 mL/min et prélever l’éluat du cathéter urétral. Tester immédiatement 100 μL d’aliquotes de l’éluat pour l’ATP (voir ci-dessous) ou congeler pour une quantification ultérieure du lot.
2. Pour tester l’effet de la distension de la vessie sur les concentrations luminales d’ATP, boucher le cathéter urétral avec le bouchon et surveiller la pression de la vessie jusqu’à ce qu’elle atteigne le niveau souhaité. Ensuite, décapsulez le cathéter urétral et prélevez l’éluat pour la mesure ou la congélation de l’ATP, comme décrit ci-dessus.
3. Après chaque distension, laissez la vessie reposer et laver pendant 10 à 15 minutes avant de prélever des échantillons supplémentaires. Prélever un total de 3 à 5 échantillons de prédistension et 3 à 5 échantillons à chaque pression de distension souhaitée pour démontrer la répétabilité.
4. Pour tester l’effet des médicaments sur la libération d’ATP, remplacer la solution de Krebs par injection de la vessie par Krebs contenant le médicament de votre choix. Perfuser à 0,1 mL/min pendant 10-15 min pour que le médicament ait un effet, puis prélever les échantillons des vessies non distendues et distendues comme décrit aux étapes 6.1 et 6.2.

7. Quantifier l’ATP à partir d’échantillons prélevés

1. Quantifier l’ATP dans les échantillons de 100 μL prélevés à l’aide d’une trousse de dosage de la luciférine/luciférase disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant et d’un luminomètre.
   1. Pour quantifier l’ATP, combiner 100 μL d’échantillons de perfusat avec 50 μL du mélange d’essai et les placer dans le luminomètre pour la lecture. Pour convertir les unités de lumière relative (RLU) indiquées par le luminomètre en une concentration d’ATP, effectuer des dilutions en série d’ATP dans une solution de Krebs allant de 1 μM à 10 pM dans des dilutions de 10 fois pour créer une courbe standard et les lire dans le luminomètre. Tracer les lectures résultantes sur un graphique et effectuer une régression non linéaire (quadratique) pour extrapoler les concentrations à partir des échantillons prélevés sur l’animal.
      REMARQUE: Il est important d’établir des normes ATP pour toute solution médicamenteuse testée dans l’expérience, car de nombreux médicaments interfèrent avec la réaction luciférine / luciférase, qui doit être corrigée.

8. Euthanasie des animaux

1. Lorsque l’expérience est terminée et que tous les échantillons sont prélevés, euthanasier l’animal sans cruauté conformément aux directives de l’USDA et au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals du Conseil national de recherches.
   1. Retirez l’animal anesthésié de la configuration expérimentale, placez-le dans une boîte fermée et gazez-le avec 100% de CO₂. Assurez-vous que le taux de remplissage est égal à 30 % à 70 % du volume de la chambre par minute (p. ex., 3 à 7 L/min pour une boîte d’un volume de 10 L). Continuez le flux de CO₂ pendant au moins 1 min après l’arrêt de la respiration.
2. Utilisez une forme secondaire d’euthanasie pour assurer la mort.
   1. Effectuez une thoracotomie comme forme secondaire d’euthanasie en saisissant le petit lambeau de peau à l’extrémité caudale du sternum et en coupant un petit trou dans la peau et la musculature au diaphragme avec une paire de ciseaux tranchants. Complétez la thoracotomie en insérant les ciseaux dans l’ouverture et en coupant rostralement à travers la cage thoracique et en exposant la cavité thoracique.
      REMARQUE : L’animal euthanasié doit être éliminé conformément aux lignes directrices de l’établissement.

Résultats

Le protocole décrit permet de mesurer avec précision la libération d’ATP urothéliale in vivo à partir de la lumière de la vessie, en utilisant une version modifiée de la configuration standard de cystométrie des rongeurs (voir Figure 1). Cela permet au chercheur d’examiner les effets des médicaments sur la libération d’ATP à médiation par étirement dans un contexte physiologique.

Discussion

La majorité des recherches sur la libération d’ATP urothéliale sont menées dans des cellules en culture, en utilisant soit des lignées cellulaires immortalisées, soit des cultures primaires de cellules urothéliales de rongeurs. Bien que ces modèles aient l’avantage d’avoir un débit relativement élevé (c.-à-d. qu’une culture ou un passage peut faire de nombreuses assiettes/boîtes de cellules), leur pertinence physiologique est diminuée en raison : 1) de l’incapacité des cellules urothéliales à s...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose