Im lebenden Organismus Luminale Messung der durch Dehnung hervorgerufenen urothhelialen ATP-Freisetzung bei Nagetieren

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zur Messung von ATP-Konzentrationen im Lumen der Blase bei einem anästhesierten Nagetier.

Zusammenfassung

Es wird angenommen, dass ATP, das als Reaktion auf eine Blasendehnung aus dem Urothel freigesetzt wird, eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt. Daher ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung in einem physiologischen Umfeld ein wichtiger erster Schritt bei der Untersuchung der Mechanismen, die die purinerge Signalübertragung in der Harnblase steuern. Bestehende Techniken zur Untersuchung der mechanisch evozierten Urothel-ATP-Freisetzung verwenden kultivierte Zellen, die auf flexiblen Trägern oder Blasengewebe in Ussing-Kammern fixiert sind. Jede dieser Techniken ahmt jedoch die Bedingungen in der intakten Blase nicht vollständig nach. Daher wurde ein Versuchsaufbau entwickelt, um ATP-Konzentrationen im Lumen der Harnblase von Nagetieren direkt zu messen.

In diesem Aufbau werden die Blasen von anästhesierten Nagetieren durch Katheter sowohl in der Blasenkuppel als auch über die äußere Harnröhrenöffnung perfundiert. Der Druck in der Blase wird erhöht, indem der Harnröhrenkatheter verschlossen wird, während sterile Flüssigkeit durch die Kuppel in die Blase geleitet wird. Die Messung des intravesikalen Drucks erfolgt mit einem Druckwandler, der am Blasendomkatheter befestigt ist, ähnlich dem für die Zystometrie verwendeten Aufbau. Sobald der gewünschte Druck erreicht ist, wird die Kappe des Harnröhrenkatheters entfernt und Flüssigkeit für die ATP-Quantifizierung durch Luciferin-Luciferase-Assay gesammelt. Durch diesen Versuchsaufbau können die Mechanismen, die sowohl die mechanische als auch die chemische Stimulation der Urothel-ATP-Freisetzung steuern, untersucht werden, indem verschiedene Agonisten oder Antagonisten in das Perfusat aufgenommen oder die Ergebnisse zwischen Wildtyp- und genetisch veränderten Tieren verglichen werden.

Einleitung

Es wird angenommen, dass ATP im Urin eine wichtige sensorische Rolle bei der Kontrolle der Miktion spielt¹. Zum Beispiel wird angenommen, dass ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung freigesetzt wird, wo es auf Rezeptoren auf blasenafferente Nerven wirken kann, um ihre Erregbarkeit zu erhöhen, was zu Sättigungsgefühlen führt². Daher wird auch angenommen, dass ATP im Urin ein wichtiger Akteur bei der Entwicklung von Blasenpathologien sein könnte. Zur Unterstützung dieser Hypothese sind die ATP-Konzentrationen im Urin bei Patienten mit überaktiver Blase (OAB)³, Blasenschmerzsyndrom/interstitieller Zystitis (BPS/IC)⁴ oder einer Harnwegsinfektion (UTI)^5,6 signifikant erhöht, alles Zustände, die durch erhöhte Dringlichkeit^, Häufigkeit und manchmal Schmerzen gekennzeichnet sind. Umgekehrt wurde bei Patienten, die an einer Unterfunktion der Blase (UAB) leiden, die durch die Unfähigkeit gekennzeichnet ist, die Blase zu entleeren, und die manchmal eine verminderte Fähigkeit zur Wahrnehmung der Blasenfülle aufweisen kann, eine^verminderte ATP-Konzentration im Urin nachgewiesen 7. Experimentell kann die Manipulation der ATP-Konzentrationen im Urin die Blasenreflexe bei der Ratte verändern. Die Erhöhung der ATP-Konzentrationen durch die Blockierung endogener ATPasen im Blasenlumen kann die Blasenentleerungshäufigkeit erhöhen, während die Verringerung der ATP-Konzentrationen durch Einträufeln exogener ATPasen in die Blase die Blasenentleerungshäufigkeit verringert⁸. Somit ist die Bedeutung von ATP im Urin für die Blasenfunktion klar.

Angesichts der offensichtlichen Bedeutung von ATP im Urin für die Pathologie der Blase ist die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung ein wichtiger Schritt zum Verständnis der Mechanismen, die die Freisetzung kontrollieren. Viele Studien wurden mit verschiedenen experimentellen Modellen durchgeführt, um die Urothel-ATP-Freisetzung zu messen. An erster Stelle stehen dabei Zellkulturen, entweder Primärkulturen oder Zelllinien. Die Verwendung von kultivierten Urothelzellen wird jedoch durch die Tatsache erschwert, dass Urothelzellen ihre physiologisch polarisierte Morphologie nur annehmen, wenn sie auf speziellen durchlässigen Membranen gezüchtet werden (z. B. Transwell-Technologie [Well-Inserts])⁹. Daher ist es schwierig, eine gemessene ATP-Freisetzung mit der Physiologie in Verbindung zu bringen. Urothelzellen, die auf Well-Inserts gezüchtet werden, können polarisieren und eine Barriere bilden, die dem ähnelt, was in vivo beobachtet wird. Das Wachstum eines vollständig differenzierten Urothels kann jedoch Tage oder Wochen dauern. Während es möglich ist, gut eingesetzte Einsätze in einer Ussing-Kammer zu montieren und Druck auf die apikale Seite auszuüben, um eine Dehnung zu verursachen, ist es schwierig, genügend Druck auszuüben, um die Bedingungen in der Blase während der Pathologie nachzuahmen (d.h. Drücke von 30 cm H₂O oder höher). Ganzes Blasengewebe kann auch in einer Ussing-Kammer für Dehnungsexperimente montiert werden, aber dies entfernt die Blase aus dem Organismus zusammen mit den trophischen Faktoren, die die Gesundheit der Urothelzellen und damit die Funktion der Urothelbarriere aufrechterhalten. Daher ist der physiologisch relevanteste Weg, um die Freisetzung von ATP aus dem Urothel als Reaktion auf Dehnung oder Druck zu untersuchen, in vivo. Die chirurgischen Techniken, die für den Aufbau des Experiments erforderlich sind, sind identisch mit denen, die üblicherweise in der Zystometrie bei Tieren verwendet werden, und sollten daher von jedem, der mit dieser Technik vertraut ist, leicht durchgeführt werden können.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Technik, die zur Untersuchung von luminalem ATP bei weiblichen Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 200-250 g verwendet wird, da die unten beschriebene transurethrale Katheterisierung bei Weibchen viel einfacher ist. Die transurethrale Katheterisierung kann jedoch auch bei männlichen Nagetieren^{durchgeführt werden 10}. Da nun auch bei Mäusen beiderlei Geschlechts eine transurethrale Katheterisierung durchgeführt wurde¹¹, können diese Experimente leicht an Mäuse oder Ratten beiderlei Geschlechts oder unterschiedlicher Größe angepasst werden, je nach den Bedürfnissen des Forschungsteams.

Protokoll

Alle Verfahren, die an Nagetieren durchgeführt werden, müssen den geltenden Richtlinien entsprechen und von der lokalen institutionellen Ethikkommission genehmigt werden. Die Experimente, die für dieses Manuskript durchgeführt wurden, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden des National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Pittsburgh School of Medicine genehmigt. In Abbildung 1 sehen Sie eine modifizierte Version des Standard-Zystometrie-Setups für Nagetiere, das in diesem Protokoll verwendet wird.

1. Versuchstiere

1. Halten Sie die Ratten in Sozialwohnungen (mehrere Nagetiere in einem Käfig) mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und ad libitum Zugang zu Wasser und Futterpellets.

2. Anästhesie und Ganglienblock

1. Induzieren Sie eine Erstanästhesie, indem Sie das Tier in eine geschlossene Box legen, die mit 4%-5% Isofluran in_O2 (1 l/min) begast ist.
2. Betäuben Sie das Tier mit Urethan.
   1. Urethan wird subkutan beidseitig (1/2 Dosis auf jeder Seite des Tieres) in einer Dosis von 1,2 g/kg injiziert. Legen Sie das Tier in einen Käfig, damit das Urethan wirken kann, was in der Regel 2 Stunden dauert.
   2. Alternativ können Sie Urethan intraperitoneal (i.p.) verabreichen, indem Sie die volle Dosis in zwei separaten Dosen im Abstand von ~ 10 Minuten injizieren.
3. Nachdem Sie auf die entsprechende Zeit gewartet haben, bis das Urethan seine Wirkung entfaltet (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), prüfen Sie, ob die Anästhesie richtig ist, indem Sie den Fuß des Tieres mit einer Pinzette einklemmen. Wenn ein Reflex beobachtet wird, verabreichen Sie eine zusätzliche Dosis Urethan (0,05-0,1 ml i.p.), warten Sie 15 Minuten und testen Sie erneut. Überwachen Sie das Tier während des gesamten Eingriffs weiterhin auf die richtige Anästhesieebene.
4. Um eine Kontraktion der Blase während der Blähung zu verhindern, injizieren Sie dem Tier einen ganglionären Blocker wie Hexamethonium (20 mg/kg, i.p.).
5. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen während des Versuchs zu verhindern.

3. Chirurgischer Eingriff - suprapubische Blasenkatheterisierung

1. Rasieren Sie den Bauch des Tieres und führen Sie eine Mittellinien-Laparotomie durch, um die Harnblase freizulegen.
2. Bereiten Sie einen Katheter vor, indem Sie ein Ende eines kurzen (~ 10-15 cm) langen PE50-Intramedic-Schlauchs mit einer Flamme aufblitzen. Setzen Sie eine 22-g-Nadel in das andere Ende des Schlauchs ein und füllen Sie sie mit Krebs-Lösung (siehe Materialtabelle für die Zusammensetzung).
3. Legen Sie eine kleine Schleife aus 3-0 Seidennaht über die Blasenkuppel und führen Sie eine kleine Zystostomie (mit einer feinen Schere oder einer 18-G-Nadel) durch, die groß genug ist, um das ausgestellte Ende des oben gemachten Katheters einzuführen. Halten Sie mit einer Hand den Katheter an Ort und Stelle und ziehen Sie mit der anderen Hand die Schlaufe der Naht fest, um den Katheter an Ort und Stelle zu fixieren. Beenden Sie die Sicherung des Katheters, indem Sie zwei Knoten in die Naht binden und den Katheter zurückziehen, bis der ausgestellte Kopf in Kontakt mit der Blasenwand ist.
   1. Alternativ können Sie den Katheter mit einer klassischen Verschlusstechnik sichern, wie sie zuvor für die Zystometrie¹² beschrieben wurde.
      HINWEIS: Es ist unbedingt erforderlich, während dieses Verfahrens keine Luftblasen in die Blase einzuführen.
4. Testen Sie das Setup auf Lecks, indem Sie eine kleine Menge Krebslösung durch den Katheter injizieren. Wenn die Flüssigkeit aus der Zystostomie austritt, sichern Sie den Katheter mit zusätzlicher Naht um die Zystostomie.

4. Transurethrale Katheterisierung

1. Tauchen Sie das Ende eines 20 g x 1" Infusionskatheters (mit entfernter Nadel) in chirurgisches Gleitmittel.
2. Halten Sie den äußeren Meatus urethralis vorsichtig mit einer Pinzette fest und führen Sie die Spitze des Katheters in Richtung Schwanz in die Harnröhrenöffnung ein, bis sich die Wand der angrenzenden Scheidenöffnung verformt. Drehen Sie den Katheter um 90° (bringen Sie das Luer-Lock-Ende des Katheters in Richtung Schwanz) und bewegen Sie ihn vorsichtig vor. Führen Sie den Katheter vollständig ein, bis die Luer-Lock-Nabe etwa 5 mm von der äußeren Harnröhrenöffnung entfernt ist.
   HINWEIS: Führen Sie den Katheter nicht zu weit ein, da dies dazu führen kann, dass die Spitze in die Innenwand der Blase stößt. Wenn beim Vorschieben des Katheters ein Widerstand zu spüren ist, stoppen Sie und beginnen Sie erneut oder riskieren Sie, die Harnröhre zu punktieren. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsabschnitt mit Tipps zur Steigerung der erfolgreichen Katheterisierung.
3. Sichern Sie den Katheter und verhindern Sie ein Auslaufen um den Katheter, indem Sie eine kurze 3-0-Seidennaht um den äußeren Harnröhrenfleisch schlingen und fest abbinden. Befestigen Sie den Katheter mit Klebeband am Schwanz, um zu verhindern, dass er versehentlich herausgezogen wird.
4. Nach der Katheterisierung wird die Krebslösung vorsichtig durch den suprapubischen Blasenkatheter in die Blase infundiert und bestätigt, dass die Flüssigkeit aus dem Harnröhrenkatheter und nicht um ihn herum fließt. Falls erforderlich, binden Sie die Naht um die äußere Harnröhrenöffnung.
5. Schließen Sie den Bauchschnitt über der Blase mit einer 3-0 Seidennaht.

5. Versuchsaufbau

1. Sichern Sie das Tier auf einem Brett, das geneigt werden kann, um den Abfluss von intravesikärer Flüssigkeit durch den Harnröhrenkatheter zu unterstützen. Platzieren Sie ein Heizkissen und eine saugfähige Unterlage zwischen dem Tier und dem Brett, um die Körperwärme aufrechtzuerhalten und die aus dem Harnröhrenkatheter abfließende Flüssigkeit aufzunehmen.
2. Verbinden Sie den suprapubischen Katheter mit einem Dreiwegehahn, der den Katheter mit einer Spritzenpumpe und einem Druckaufnehmer verbindet. Schließen Sie den Druckmessumformer über einen Verstärker und ein Datenerfassungssystem an einen Computer an.
   HINWEIS: Es sollte darauf geachtet werden, dass sich keine Luftblasen in dem Schlauch bilden, der die Spritzenpumpe, den Schallkopf und den Blasenkatheter verbindet.
3. Kalibrieren Sie die Blasendruckaufzeichnung mit dem vom Hersteller des Druckaufnehmers und/oder der Datenerfassungssoftware empfohlenen Verfahren.
4. Infusion der Krebslösung durch den suprapubischen Katheter mit einer Geschwindigkeit von 0,1 ml/min und 1 h aus dem Harnröhrenkatheter abfließen lassen, um das bei den Katheterimplantationen freigesetzte restliche ATP auszuwaschen.
5. Nach dieser Auswaschphase verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit einem Luer-Lock-Stopfen und messen den Druck in der Blase. Achten Sie auf einen langsamen Anstieg des intravesikanischen Drucks auf einen Druck von 30 cm_H2Oohne starken Druckanstieg, was auf eine Blasenkontraktion hindeuten würde (siehe Abbildung 2). Entfernen Sie den Pfropfen aus dem Harnröhrenkatheter, wenn der Druck 30 cm H₂O erreicht, um eine Schädigung der Blase zu vermeiden.
   HINWEIS: Wenn die Blasenkontraktionen nach 1 Stunde anhalten, ist eine zusätzliche Dosis Hexamethonium (5 mg/kg Dosis i.p.) zu verabreichen.

6. Entnahme von Proben

1. Infusion der Blase mit 0,1 ml/min und Entnehmen Sie das Eluat aus dem Harnröhrenkatheter. Testen Sie 100 μL Aliquots des Eluats sofort auf ATP (siehe unten) oder frieren Sie es für die spätere Chargenquantifizierung ein.
2. Um die Wirkung der Blasendehnung auf luminale ATP-Konzentrationen zu testen, verschließen Sie den Harnröhrenkatheter mit dem Stöpsel und überwachen Sie den Blasendruck, bis er das gewünschte Niveau erreicht. Dann entdeckeln Sie den Harnröhrenkatheter und sammeln Sie das Eluat für die ATP-Messung oder das Einfrieren, wie oben beschrieben.
3. Lassen Sie die Blase nach jeder Dehnung 10-15 Minuten ruhen und auswaschen, bevor Sie weitere Proben entnehmen. Nehmen Sie insgesamt 3-5 Vordehnungsproben und 3-5 Proben bei jedem gewünschten Dehndruck, um die Wiederholbarkeit nachzuweisen.
4. Um die Wirkung von Medikamenten auf die Freisetzung von ATP zu testen, wechseln Sie die Krebslösung, die die Blase infundiert, auf Krebs, der das Medikament der Wahl enthält. Perfundiert bei 0,1 ml/min für 10-15 Minuten, damit das Arzneimittel eine Wirkung entfaltet, und sammeln Sie dann die Proben aus nicht aufgeblähten und aufgeblähten Blasen, wie in den Schritten 6.1 und 6.2 beschrieben.

7. Quantifizierung von ATP aus gesammelten Proben

1. Quantifizieren Sie ATP in den entnommenen 100-μl-Proben mit einem handelsüblichen Luciferin/Luciferase-Assay-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und einem Luminometer.
   1. Um ATP zu quantifizieren, kombinieren Sie 100 μL-Proben Perfusat mit 50 μL der Assay-Mischung und legen Sie sie zum Ablesen in das Luminometer. Um die vom Luminometer gemeldeten relativen Lichteinheiten (RLUs) in eine ATP-Konzentration umzuwandeln, führen Sie serielle Verdünnungen von ATP in Krebs-Lösung im Bereich von 1 μM bis 10 pM in 10-fachen Verdünnungen durch, um eine Standardkurve zu erstellen und sie im Luminometer zu lesen. Zeichnen Sie die resultierenden Messwerte in einem Diagramm auf und führen Sie eine nichtlineare (quadratische) Regression durch, um die Konzentrationen aus den Proben des Tieres zu extrapolieren.
      HINWEIS: Es ist wichtig, ATP-Standards für jede im Experiment getestete Arzneimittellösung festzulegen, da viele Medikamente die Luciferin / Luciferase-Reaktion stören, die korrigiert werden muss.

8. Euthanasie von Tieren

1. Wenn das Experiment abgeschlossen ist und alle Proben gesammelt sind, wird das Tier gemäß den USDA-Richtlinien und dem Leitfaden des National Research Council für die Pflege und Verwendung von Labortieren auf humane Weise eingeschläfert.
   1. Nehmen Sie das betäubte Tier aus dem Versuchsaufbau, legen Sie es in eine geschlossene Box und begasen Sie es mit 100%_CO2. Stellen Sie sicher, dass die Füllrate 30%-70% des Kammervolumens pro Minute beträgt (z. B. 3-7 l/min für eine Box mit einem Volumen von 10 l). Setzen Sie den CO₂ -Fluss für mindestens 1 Minute fort, nachdem die Atmung aufgehört hat.
2. Verwenden Sie eine sekundäre Form der Euthanasie, um den Tod zu gewährleisten.
   1. Führen Sie eine Thorakotomie als sekundäre Form der Sterbehilfe durch, indem Sie den kleinen Hautlappen am kaudalen Ende des Brustbeins ergreifen und mit einer scharfen Schere ein kleines Loch in die Haut und die Muskulatur am Zwerchfell schneiden. Schließen Sie die Thorakotomie ab, indem Sie die Schere in die Öffnung einführen und rostral durch den Brustkorb schneiden und die Brusthöhle freilegen.
      HINWEIS: Das eingeschläferte Tier sollte gemäß den institutionellen Richtlinien entsorgt werden.

Ergebnisse

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die genaue Messung der Urothel-ATP-Freisetzung in vivo aus dem Lumen der Blase unter Verwendung einer modifizierten Version des Standard-Nagetier-Zystometrie-Setups (siehe Abbildung 1). Dies ermöglicht es dem Forscher, die Auswirkungen von Medikamenten auf die dehnungsvermittelte ATP-Freisetzung in einem physiologischen Umfeld zu untersuchen.

Diskussion

Der Großteil der Forschung zur Urothel-ATP-Freisetzung wird in kultivierten Zellen durchgeführt, wobei entweder immortalisierte Zelllinien oder Primärkulturen von Nagetier-Urothelzellen verwendet werden. Während diese Modelle den Vorteil haben, dass sie einen relativ hohen Durchsatz haben (d.h. eine Kultur / Passage kann viele Platten / Schalen von Zellen bilden), wird ihre physiologische Relevanz verringert durch: 1) die Unfähigkeit von Urothelzellen, polarisiert zu wachsen, es sei denn, sie werden auf speziellen T...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose