In vivo Medição Luminal da Liberação de ATP Urotelial Evocado por Distensão em Roedores

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para medir as concentrações de ATP no lúmen da bexiga em um roedor anestesiado.

Resumo

Acredita-se que o ATP, liberado do urotélio em resposta à distensão da bexiga, desempenhe um papel sensorial significativo no controle da micção. Portanto, a medição precisa da liberação de ATP urotelial em um ambiente fisiológico é um primeiro passo importante no estudo dos mecanismos que controlam a sinalização purinérgica na bexiga urinária. As técnicas existentes para estudar a liberação de ATP urotelial evocado mecanicamente utilizam células cultivadas banhadas em suportes flexíveis ou tecido vesical fixado em câmaras de Ussing; no entanto, cada uma dessas técnicas não emula totalmente as condições na bexiga intacta. Portanto, uma configuração experimental foi desenvolvida para medir diretamente as concentrações de ATP no lúmen da bexiga urinária de roedores.

Nesta configuração, as bexigas de roedores anestesiados são perfundidas através de cateteres tanto na cúpula da bexiga quanto através do orifício uretral externo. A pressão na bexiga é aumentada tampando o cateter uretral enquanto perfunde fluido estéril na bexiga através da cúpula. A medição da pressão intravesical é obtida usando um transdutor de pressão ligado ao cateter da cúpula da bexiga, semelhante à configuração usada para cistometria. Uma vez atingida a pressão desejada, a tampa do cateter uretral é removida e o líquido coletado para quantificação de ATP pelo ensaio de luciferina-luciferase. Através desta configuração experimental, os mecanismos que controlam a estimulação mecânica e química da liberação de ATP urotelial podem ser interrogados pela inclusão de vários agonistas ou antagonistas no perfusato ou comparando os resultados entre animais selvagens e geneticamente modificados.

Introdução

Acredita-se que o ATP urinário desempenhe um papel sensorial significativo no controle da micção¹. Por exemplo, pensa-se que o ATP é liberado do urotélio em resposta à distensão, onde pode atuar sobre os receptores nos nervos aferentes da bexiga para aumentar sua excitabilidade, levando a sensações de plenitude². Assim, pensa-se também que o ATP urinário poderia ser um ator importante no desenvolvimento de patologias da bexiga. Em apoio a essa hipótese, as concentrações urinárias de ATP estão significativamente aumentadas em pacientes que sofrem de bexiga hiperativa (OAB)³, síndrome da dor vesical/cistite intersticial (BPS/IC)⁴ ou infecção do trato urinário (ITU)^5,6, todas as condições caracterizadas pelo aumento da urgência, frequência e, às vezes^, dor. Por outro lado, pacientes que sofrem de bexiga hipoativa (BAU), que é caracterizada por uma incapacidade de esvaziar a bexiga e às vezes pode incluir uma diminuição da capacidade de sentir a plenitude da bexiga, demonstraram ter diminuído as concentrações urinárias de ATP⁷. Experimentalmente, a manipulação das concentrações urinárias de ATP pode alterar os reflexos da bexiga no rato; o aumento das concentrações de ATP pelo bloqueio de ATPases endógenas no lúmen vesical pode aumentar a frequência miccional, enquanto a diminuição das concentrações de ATP pela instilação de ATPases exógenas na bexiga reduz a frequência de micção⁸. Assim, a importância do ATP urinário para a função da bexiga é clara.

Dada a aparente importância do ATP urinário para a patologia da bexiga, a medição precisa da liberação de ATP urotelial é um passo importante na compreensão dos mecanismos que controlam a liberação. Muitos estudos foram concluídos usando diferentes modelos experimentais para medir a liberação de ATP urotelial. A principal delas são as culturas celulares, sejam culturas primárias ou linhagens celulares. No entanto, o uso de células uroteliais cultivadas é complicado pelo fato de que as células uroteliais não assumem sua morfologia polarizada fisiológica, a menos que sejam cultivadas em membranas permeáveis especiais (como a tecnologia Transwell [inserções de poço])⁹. Assim, é difícil relacionar qualquer liberação de ATP medida com a fisiologia. As células uroteliais cultivadas em inserções de poços podem polarizar e formar uma barreira semelhante ao que é visto in vivo; no entanto, o crescimento de um urotélio totalmente diferenciado pode levar dias ou semanas. Além disso, embora seja possível montar inserções de poço em uma câmara de Ussing e aplicar pressão no lado apical para causar estiramento, é difícil aplicar pressão suficiente para imitar condições dentro da bexiga durante a patologia (ou seja, pressões de 30 cm H₂O ou acima). O tecido da bexiga inteira também pode ser montado em uma câmara de Ussing para experimentos de alongamento, mas isso remove a bexiga do organismo, juntamente com os fatores tróficos que mantêm a saúde das células uroteliais e, portanto, a função de barreira urotelial. Portanto, a maneira fisiologicamente mais relevante de estudar a liberação de ATP do urotélio em resposta ao estiramento ou pressão é in vivo. As técnicas cirúrgicas necessárias para a montagem do experimento são idênticas às comumente utilizadas na cistometria animal e, portanto, devem ser facilmente realizadas por qualquer pessoa familiarizada com essa técnica.

Neste protocolo, descreveremos a técnica utilizada para examinar o ATP luminal em ratas Sprague Dawley com peso aproximado de 200-250 g, pois o cateterismo transuretral descrito a seguir é muito mais fácil em fêmeas; no entanto, o cateterismo transuretral também pode ser realizado em roedores machos¹⁰. Como o cateterismo transuretral já foi realizado em camundongos de ambos os sexos também¹¹, esses experimentos podem ser facilmente adaptados para camundongos ou ratos de ambos os sexos ou de tamanhos variados, dependendo das necessidades da equipe de pesquisa.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em roedores devem seguir as diretrizes aplicáveis e ser aprovados pelo comitê de revisão de ética institucional local. Os experimentos realizados para este manuscrito foram realizados de acordo com o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh. Consulte a Figura 1 para obter uma versão modificada da configuração padrão de cistometria de roedores usada neste protocolo.

1. Animais de laboratório

1. Manter os ratos em habitação social (vários roedores em uma gaiola) com um ciclo claro/escuro de 12 horas e acesso ad libitum a pellets de água e alimentos.

2. Anestesia e bloqueio ganglionar

1. Induzir a anestesia inicial colocando o animal em uma caixa fechada gaseificada com isoflurano a 4%-5% em O₂ (1 L/min).
2. Anestesiar o animal usando uretano.
   1. Injetar uretano por via subcutânea bilateral (dose de 1/2 em cada lado do animal) na dose de 1,2 g/kg. Coloque o animal em uma gaiola para permitir que o uretano faça efeito, o que geralmente leva 2 h.
   2. Alternativamente, administrar uretano por via intraperitoneal (i.p.) injetando a dose completa em duas doses separadas ~ 10 min de intervalo.
3. Depois de aguardar o tempo apropriado para que o uretano entre em vigor (s.c.: 2 h, i.p.: 30 min), teste um plano adequado de anestesia apertando o pé do animal usando fórceps. Se um reflexo for observado, administrar uma dose adicional de uretano (0,05-0,1 mL i.p.), aguarde 15 minutos e teste novamente. Continue a monitorar o animal quanto ao plano adequado de anestesia durante todo o procedimento.
4. Para evitar uma contração da bexiga durante a distensão, injete no animal um agente bloqueador ganglionar, como o hexametônio (20 mg/kg, i.p.).
5. Aplique pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar a secagem durante o experimento.

3. Procedimento cirúrgico-cateterismo vesical suprapúbico

1. Raspe o abdômen do animal e realize uma laparotomia na linha média para expor a bexiga urinária.
2. Prepare um cateter queimando uma extremidade de um comprimento curto (~ 10-15 cm) de tubo intramédico PE50 usando uma chama. Coloque uma agulha de 22 G na outra extremidade da tubulação e encha com solução de Krebs (consulte a Tabela de Materiais para a composição).
3. Coloque uma pequena alça de sutura de seda 3-0 sobre a cúpula da bexiga e realize uma pequena cistostomia (usando uma tesoura fina ou uma agulha de 18 G) grande o suficiente para inserir a extremidade inflamada do cateter feito acima. Com uma mão segurando o cateter no lugar, use a outra mão para apertar a alça da sutura para prender o cateter no lugar. Termine de prender o cateter amarrando dois nós na sutura e puxando o cateter para trás até que a cabeça inflamada esteja em contato com a parede da bexiga.
   1. Alternativamente, prenda o cateter usando uma técnica clássica de sutura com corda de bolsa, conforme descrito anteriormente para cistometria¹².
      NOTA: É imperativo não introduzir bolhas de ar na bexiga durante este procedimento.
4. Teste a configuração para vazamentos infundindo uma pequena quantidade de solução de Krebs através do cateter. Se o fluido vazar para fora da cistostomia, proteja novamente o cateter com sutura adicional ao redor da cistostomia.

4. Cateterismo transuretral

1. Mergulhe a extremidade de um cateter IV de 20 G x 1" (com a agulha removida) no lubrificante cirúrgico.
2. Segure o meato uretral externo suavemente com um par de pinças e insira a ponta do cateter no orifício uretral na direção da cauda até que a ponta faça com que a parede da abertura vaginal adjacente se deforme. Gire o cateter 90° (trazendo a extremidade Luer-Lock do cateter em direção à cauda) e avance suavemente. Insira totalmente o cateter até que o cubo Luer-Lock esteja aproximadamente 5 mm distal da abertura uretral externa.
   NOTA: Não insira o cateter muito longe, o que pode fazer com que a ponta cutuque a parede interna da bexiga. Se a resistência for sentida durante o avanço do cateter, pare e comece novamente ou corra o risco de perfurar a uretra. Veja a seção de discussão sobre dicas para aumentar o cateterismo bem-sucedido.
3. Prenda o cateter e evite o vazamento ao redor do cateter enrolando um curto comprimento de sutura de seda 3-0 ao redor do meato uretral externo e amarre-o com força. Prenda o cateter à cauda com fita adesiva para evitar que ele seja acidentalmente retirado.
4. Uma vez cateterizado, infundir suavemente a solução de Krebs na bexiga através do cateter da bexiga suprapúbica e confirmar que o fluido flui para fora do cateter uretral e não em torno dele. Se necessário, retire a sutura ao redor do orifício uretral externo.
5. Feche a incisão abdominal sobre a bexiga usando uma sutura de seda 3-0.

5. Configuração experimental

1. Prenda o animal em uma prancha capaz de ser inclinado para auxiliar na drenagem do líquido intravesical através do cateter uretral. Coloque uma almofada de aquecimento e uma almofada absorvente entre o animal e a placa para manter o calor do corpo e absorver o fluido que drena do cateter uretral.
2. Conecte o cateter suprapúbico a uma torneira de três vias, que conecta o cateter a uma bomba de seringa e a um transdutor de pressão. Conecte o transdutor de pressão a um computador por meio de um amplificador e um sistema de aquisição de dados.
   NOTA: Deve-se tomar cuidado para evitar que bolhas de ar se formem na tubulação que conecta a bomba da seringa, o transdutor e o cateter vesical.
3. Calibre o registro da pressão da bexiga usando o procedimento sugerido pelo fabricante do transdutor de pressão e/ou software de aquisição de dados.
4. Infundir a solução de Krebs através do cateter suprapúbico a uma taxa de 0,1 mL/min e permitir que o fluido escorra do cateter uretral por 1 h para lavar qualquer ATP residual liberado durante o implante do cateter.
5. Após este período de lavagem, tampe o cateter uretral usando um plugue Luer-Lock e meça a pressão na bexiga. Procure um aumento lento da pressão intravesical para uma pressão de 30 cm H 2 O sem umaumento acentuado da pressão, o que indicaria uma contração da bexiga (ver Figura 2). Remova o tampão do cateter uretral quando a pressão atingir 30 cm H₂O para evitar danos à bexiga.
   NOTA: Se as contrações da bexiga continuarem a ocorrer após 1 h, administrar uma dose adicional de hexametónio (dose i.p. de 5 mg/kg).

6. Recolha de amostras

1. Infundir a bexiga a 0,1 mL/min e recolher o eluato do cateter uretral. Testar imediatamente as alíquotas de 100 μL do eluato para o ATP (ver infra) ou congelar para posterior quantificação do lote.
2. Para testar o efeito da distensão da bexiga nas concentrações luminais de ATP, tampe o cateter uretral com o plugue e monitore a pressão da bexiga até atingir o nível desejado. Em seguida, destampe o cateter uretral e colete o eluato para medição ou congelamento do ATP, conforme descrito acima.
3. Após cada distensão, deixe a bexiga descansar e lavar por 10-15 minutos antes de colher amostras adicionais. Tome um total de 3-5 amostras de predistensão e 3-5 amostras a cada pressão de distensão desejada para demonstrar repetibilidade.
4. Para testar o efeito das drogas na liberação de ATP, mude a solução de Krebs que infunde a bexiga para Krebs contendo a droga de escolha. Perfundir a 0,1 mL/min por 10-15 min para que a droga tenha um efeito e, em seguida, coletar as amostras de bexigas não distendidas e distendidas, conforme descrito nas etapas 6.1 e 6.2.

7. Quantificação do ATP a partir de amostras colhidas

1. Quantificar o ATP nas amostras de 100 μL recolhidas utilizando um kit de ensaio de luciferina/luciferase comercialmente disponível, seguindo as instruções do fabricante e um luminómetro.
   1. Para quantificar o ATP, combinar amostras de 100 μL de perfusato com 50 μL da mistura de ensaio e colocá-las no luminômetro para leitura. Para converter as Unidades de Luz Relativa (RLUs) relatadas pelo luminômetro em uma concentração de ATP, faça diluições seriais de ATP em solução de Krebs variando de 1 μM a 10 pM em diluições de 10 vezes para criar uma curva padrão e lê-las no luminômetro. Plotar as leituras resultantes em um gráfico e realizar uma regressão não linear (quadrática) para extrapolar as concentrações das amostras retiradas do animal.
      NOTA: É importante fazer padrões de ATP para qualquer solução medicamentosa testada no experimento, pois muitos medicamentos interferem na reação luciferina/luciferase, que deve ser corrigida.

8. Eutanásia de animais

1. Quando o experimento estiver concluído e todas as amostras forem coletadas, eutanasie humanamente o animal de acordo com as diretrizes do USDA e o Guia do Conselho Nacional de Pesquisa para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório.
   1. Retire o animal anestesiado da instalação experimental, coloque-o em uma caixa fechada e gaseifique-o com 100% de CO₂. Certifique-se de que a taxa de enchimento seja igual a 30%-70% do volume da câmara por minuto (por exemplo, 3-7 L/min para uma caixa com um volume de 10 L). Continue o fluxo de CO₂ por pelo menos 1 minuto após a respiração cessar.
2. Use uma forma secundária de eutanásia para garantir a morte.
   1. Realizar uma toracotomia como uma forma secundária de eutanásia, agarrando o pequeno retalho de pele na extremidade caudal do esterno e cortando um pequeno orifício na pele e musculatura no diafragma com um par afiado de tesouras. Complete a toracotomia inserindo a tesoura na abertura e cortando rostralmente através da caixa torácica e expondo a cavidade torácica.
      NOTA: O animal eutanasiado deve ser descartado de acordo com as diretrizes institucionais.

Resultados

O protocolo descrito permite a medição precisa da liberação de ATP urotelial in vivo do lúmen da bexiga, usando uma versão modificada da configuração padrão de cistometria de roedores (ver Figura 1). Isso permite que o pesquisador examine os efeitos das drogas na liberação de ATP mediada por estiramento em um ambiente fisiológico.

Discussão

A maioria das pesquisas sobre a liberação de ATP urotelial é conduzida em células cultivadas, usando linhagens celulares imortalizadas ou culturas primárias de células uroteliais de roedores. Embora esses modelos tenham o benefício de ter um rendimento relativamente alto (ou seja, uma cultura/passagem pode produzir muitas placas/pratos de células), sua relevância fisiológica é diminuída devido: 1) à incapacidade das células uroteliais de crescer polarizadas a menos que sejam cultivadas em suportes especiais...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
amplifier	World Precision Instruments (WPI)	SYS-TBM4M
ATP assay kit	Sigma-Aldrich, Inc.	FLAA-1KT
data acquisition system/ software	DataQ Instruments	DI-1100	Software included, requires Windows-based computer
Hexamethonium bromide	Sigma-Aldrich, Inc.	H0879	20 mg/kg dose
Isoflurane	Covetrus North America	29404
lidocaine	Covetrus North America	2468
Luer Lock plugs	Fisher Scientific	NC0455253
luminometer (GloMax 20/20)	Promega	E5311
Polyethylene (PE50) tubing	Fisher Scientific	14-170-12B
Pump 33 DDS syringe pump	Harvard Apparatus	703333
pressure transducers	World Precision Instruments (WPI)	BLPR2
surgical instruments (scissors, hemostats, forceps, etc.)	Fine Science Tools	multiple numbers
surgical lubricant	Fisher Scientific	10-000-694
Sur-Vet I.V. catheter	Covetrus North America	50603	20 G x 1 inch
tiltable surgical table (Plas Labs)	Fisher Scientific	01-288-30A
Tubing connectors	Fisher Scientific	14-826-19E	allows Luer-Lock connectors to attach to tubing
Urethane	Sigma-Aldrich, Inc.	U2500	0.5 g/mL conc., 1.2 g/kg dose