Mecanoestimulación de organismos multicelulares mediante un sistema de compresión microfluídica de alto rendimiento

Resumen

El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.

Resumen

Durante la embriogénesis, el movimiento celular coordinado genera fuerzas mecánicas que regulan la expresión y la actividad génica. Para estudiar este proceso, se han utilizado herramientas como la aspiración o la compresión de cubreobjetos para estimular mecánicamente embriones enteros. Estos enfoques limitan el diseño experimental, ya que son imprecisos, requieren manipulación manual y pueden procesar solo un par de embriones simultáneamente. Los sistemas microfluídicos tienen un gran potencial para automatizar tales tareas experimentales al tiempo que aumentan el rendimiento y la precisión. Este artículo describe un sistema microfluídico desarrollado para comprimir con precisión embriones enteros de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). Este sistema cuenta con microcanales con paredes laterales deformables accionadas neumáticamente y permite la alineación del embrión, la inmovilización, la compresión y la recolección posterior a la estimulación. Al paralelizar estos microcanales en siete carriles, se pueden aplicar patrones de compresión constantes o dinámicos a cientos de embriones de Drosophila simultáneamente. La fabricación de este sistema en un cubreobjetos de vidrio facilita la estimulación mecánica simultánea y la obtención de imágenes de muestras con microscopios de alta resolución. Además, la utilización de materiales biocompatibles, como PDMS, y la capacidad de fluir fluido a través del sistema hacen que este dispositivo sea capaz de experimentos a largo plazo con muestras dependientes de medios. Este enfoque también elimina el requisito de montaje manual que estresa mecánicamente las muestras. Además, la capacidad de recoger rápidamente muestras de los microcanales permite análisis posteriores a la estimulación, incluidos los ensayos -ómicos que requieren grandes números de muestra inalcanzables utilizando los enfoques tradicionales de estimulación mecánica. La geometría de este sistema es fácilmente escalable a diferentes sistemas biológicos, lo que permite que numerosos campos se beneficien de las características funcionales descritas en este documento, incluido el alto rendimiento de la muestra, la estimulación mecánica o la inmovilización y la alineación automatizada.

Introducción

Los sistemas vivos experimentan y responden constantemente a diversas entradas mecánicas a lo largo de su vida útil¹. La mecanotransducción se ha relacionado con muchas enfermedades, incluyendo trastornos del desarrollo, pérdida muscular y ósea, y neuropatologías a través de vías de señalización directa o indirectamente afectadas por el ambiente mecánico². Sin embargo, los genes y proteínas que están regulados por la estimulación mecánica³ en las vías de señalización mecanosensibles⁴ permanecen en gran parte desconocidos⁵, impidiendo la elucidación de los mecanismos de regulación mecánica y la identificación de dianas moleculares para enfermedades asociadas a la mecanotransducción patológica ^6,7 . Un factor limitante en la proyección de estudios mecanobiológicos sobre los procesos fisiológicos relacionados es el uso de células individuales con placas de cultivo convencionales en lugar de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como Drosophila melanogaster (mosca de la fruta), han contribuido en gran medida a la comprensión de los genes, las vías de señalización y las proteínas involucradas en el desarrollo animal 8,9,10. Sin embargo, el uso de Drosophila y otros organismos modelo multicelulares en la investigación mecanobiológica se ha visto obstaculizado por desafíos con herramientas experimentales. Las técnicas convencionales para preparar, clasificar, obtener imágenes o aplicar diversos estímulos requieren principalmente manipulación manual; Estos enfoques consumen mucho tiempo, requieren experiencia, introducen variabilidad y limitan el diseño experimental y el tamaño de la muestra¹¹. Los recientes avances microtecnológicos son un gran recurso para permitir nuevos ensayos biológicos con un rendimiento muy alto y parámetros experimentales altamente controlados^12,13,14.

Este artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico mejorado para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica en forma de compresión uniaxial a cientos de embriones enteros de Drosophila ¹⁵ (Figura 1). La integración del sistema microfluídico con un cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes confocales de alta resolución de las muestras durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección rápida de los embriones después de la estimulación para ejecutar ensayos -ómicos (Figura 2). Las explicaciones de las consideraciones de diseño de este dispositivo, así como la fabricación utilizando litografía blanda y caracterización experimental, se describen aquí. Dado que la fabricación de un molde de oblea de silicio de un dispositivo de este tipo requiere un recubrimiento uniforme de fotorresistencia gruesa (espesor >200 μm) en grandes áreas con zanjas de alta relación de aspecto (AR) (AR >5), este método modificó considerablemente el protocolo tradicional de fabricación de moldes fotolitográficos. De esta manera, este método facilitó el manejo, adhesión, recubrimiento, modelado y desarrollo de la fotorresistencia. Además, se discuten los peligros potenciales y sus soluciones. Por último, la versatilidad de esta estrategia de diseño y fabricación se demostró utilizando otros sistemas multicelulares como las cámaras de huevos de Drosophila y los organoides cerebrales¹⁶.

Protocolo

1. Preparación del molde de oblea de silicio

1. Limpie la oblea de silicio (consulte la Tabla de materiales) primero con acetona y luego con alcohol isopropílico (IPA).
2. Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 250 °C durante 30 minutos para la deshidratación (Figura 3A).
3. Cubra la oblea de silicio con hexametildisilazano (HDMS) en un horno de vapor principal (consulte la Tabla de materiales) (temperatura de proceso: 150 °C, presión de proceso: 2 Torr, tiempo de proceso: 5 min, volumen de HDMS: 5 μL) (Figura 3B).
4. Coloque una botella de fotorresistencia SU-8 2100 (consulte la tabla de materiales) en un horno a 60 °C durante 15 minutos para reducir su viscosidad.
   NOTA: Al calentar en el horno, la viscosidad de la fotorresistencia disminuye. Los fotorresistentes con viscosidad reducida se pueden manejar más fácilmente y se pueden verter con mayor precisión sobre la oblea.
5. Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 60 °C y vierta 1 ml de fotorresistencia calentada por cada pulgada de la oblea hasta que la fotorresistencia cubra la mayor parte de la superficie (Figura 3C).
6. Transfiera la oblea de silicio recubierta de fotorresistencia a una recubridora de centrifugado (consulte la Tabla de materiales).
7. Aplicar el precentrifugado primero a 250 rpm durante 30 s y luego a 350 rpm durante otros 30 s, ambos con una aceleración de 100 rpm/s (Figura 3D).
8. Retire el exceso de fotorresistencia de los bordes de la oblea de silicio con un hisopo de sala limpia.
9. Aplique un giro primero a 500 rpm durante 15 s con una aceleración de 100 rpm/s y luego a 1450 rpm durante 30 s con una aceleración de 300 rpm/s (Figura 3E).
10. Retire la cuenta del borde con un hisopo de sala limpia.
11. Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 50 °C y rocíe acetona sobre la oblea para eliminar las imperfecciones y promover un recubrimiento uniforme (Figura 3F).
12. Aumente lentamente la temperatura de la placa caliente a 95 °C a razón de 2 °C/min.
13. Hornear suavemente la oblea de silicio a 95 °C durante 50 min (Figura 3G).
14. Enfríe lentamente la placa caliente a temperatura ambiente a una velocidad de 2 ° C / min.
15. Coloque la oblea de silicio en un alineador de máscara (consulte la Tabla de materiales) y coloque la fotomáscara encima de ella (consulte la Figura complementaria 1 para la geometría de la fotomáscara).
16. Exponga la oblea de silicio a 350 mJ/^cm2 de luz UV (35 mW/^cm2 durante 10 s) a través de la fotomáscara utilizando el alineador de máscara de contacto (Figura 3H).
17. Aplique horneados consecutivos posteriores a la exposición en la oblea de silicio colocando la oblea en una placa caliente a 50 °C durante 5 min, a 65 °C durante 5 min adicionales y, finalmente, a 80 °C durante otros 20 min (Figura 3I).
18. Enfriar lentamente la oblea de silicio a temperatura ambiente a una velocidad de 2 °C/min.
19. Coloque un agitador magnético con un diámetro ligeramente más pequeño que la oblea de silicio en un vaso de precipitados. Gire la oblea de silicio al revés y colóquela encima del vaso de precipitados.
20. Coloque el vaso de precipitados dentro de otro vaso de precipitados más grande y llene el vaso de precipitados más grande con una nueva solución de revelador (consulte la Tabla de materiales). Deje la oblea de silicio sumergida en el revelador durante 30 minutos con el agitador encendido (Figura 3J).
21. Transfiera la oblea de silicio a un sonicador de baño ultrasónico lleno con el revelador fresco durante 1 h a 40 kHz (Figura 3K).
22. Lave bien la oblea de silicio con una solución IPA para obtener el molde final de oblea de silicio (Figura 3L).

2. Fabricación del chip microfluídico

1. Coloque el molde de oblea de silicio en un desecador junto con 10 gotas (~500 μL) de tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano (PFOCTS, consulte la Tabla de materiales) en un pequeño bote de pesaje cercano.
2. Conecte el desecador a una bomba de vacío a aproximadamente 200 Torr durante 30 min.
3. Apague la válvula desecador y desconecte la bomba de vacío durante la noche para el recubrimiento PFOCTS.
4. Prepare la solución de polidimetilsiloxano precurado (PDMS) mezclando la base de PDMS con el agente de curado (consulte la Tabla de materiales) en una proporción de 10:1.
5. Desgasifique la mezcla colocándola en una centrífuga (500 x g durante 5 min a temperatura ambiente).
   NOTA: Esta centrifugación permite que las burbujas migren a la superficie superior y, en consecuencia, se eliminen en un corto período de tiempo.
6. Vierta la solución PDMS desgasificada en el molde de oblea de silicio.
7. Desgasifique de nuevo para eliminar las burbujas de aire atrapadas en la superficie del molde.
8. Curar el PDMS en un horno a 60 °C durante 1 h y 50 min (Figura 3M).
9. Utilice un bisturí para cortar los bordes de la región de PDMS curada correspondiente a la geometría del chip microfluídico (Figura 3N).
10. Despegue la pieza PDMS y colóquela boca abajo sobre una estera de corte.
11. Utilice una navaja de afeitar para cortar la pieza PDMS en su forma final (Figura 3O).
12. Perfore los orificios de entrada y salida del PDMS con un punzón de biopsia (consulte la Tabla de materiales) o una aguja con una punta roma (Figura 3P).
    1. Para el orificio de entrada del embrión, use un punzón de 4 mm de diámetro.
    2. Para los orificios de salida del embrión, utilice un punzón de 1,3 mm de diámetro.
    3. Para el orificio de entrada de gas, utilice un punzón de 2 mm.
13. Use un trozo de cinta adhesiva para eliminar cualquier partícula que pueda quedar en la superficie estampada del PDMS.
14. Limpie un portaobjetos de vidrio rectangular de 24 mm x 60 mm primero con acetona y luego con IPA.
15. Seque la superficie de vidrio con una pistola de aire conectada a una fuente de aire filtrado.
16. Aplique un horno de deshidratación al portaobjetos de vidrio colocándolo en una placa caliente a 250 °C durante 2 h (Figura 3Q).
17. Cubra el portaobjetos de vidrio con un vaso de precipitados para evitar la contaminación de la superficie.
18. Coloque el PDMS, con su lado estampado hacia arriba, y el vidrio deshidratado se desliza en un limpiador de plasma (consulte la Tabla de materiales).
19. Tratar el PDMS y el portaobjetos de vidrio con plasma de oxígeno a 18 W durante 30 s.
20. Coloque el PDMS en el portaobjetos de vidrio con su superficie estampada mirando hacia el portaobjetos de vidrio para sellar los microcanales mediante unión covalente (Figura 3R).
21. Utilice pinzas para empujar suavemente la pieza PDMS contra el portaobjetos de vidrio para garantizar un contacto conformacional completo.
22. Almacene el chip microfluídico completo a temperatura ambiente durante la noche para permitir que la unión alcance su fuerza final.

3. Preparación de los embriones de mosca de la fruta

1. Permita que las moscas adultas de Oregon-R pongan huevos en placas de agar jugo de manzana (1.5% de agar, 25% de jugo de manzana, 2.5% de sacarosa) y recoja las placas en el momento de desarrollo deseado después de la puesta de huevos para el experimento dado.
   NOTA: Para los presentes experimentos, las placas se recolectaron a los 140 min para preparar y clasificar embriones en la etapa de celularización¹⁷.
2. Inundar el agar con el lavado de huevos de embrión (0.12 M NaCl, 0.04% Triton-X 100) y agitar suavemente los embriones con un pincel para desalojarlos del agar.
3. Transfiera los embriones a una solución de lejía al 50% durante 90 s, revolviendo ocasionalmente. Cuele los embriones a través de un tamiz de tejido y lave bien la solución de lejía con agua.
4. Transfiera los embriones a una placa de Petri de vidrio de 90 mm con suficiente lavado de huevos de embriones para cubrir completamente los embriones.
5. Examine los embriones con transiluminación en un microscopio de disección y seleccione embriones de la etapa de desarrollo deseada para cargarlos en el dispositivo microfluídico.
   NOTA: En esta aplicación, se seleccionaron embriones en la etapa de celularización. Las descripciones detalladas de cómo garantizar la selección adecuada de la etapa de desarrollo se pueden encontrar en el manual de laboratorio para Drosophila¹⁷.

4. Aplicación de estimulación mecánica a embriones de mosca de la fruta utilizando el chip microfluídico

1. Prepare los siete microcanales embrionarios llenándolos con IPA filtrada de 0,4 μm a través del puerto de entrada principal del embrión.
2. Reemplace el IPA con agua desionizada filtrada (DI) de 0,4 μm.
3. Reemplace el agua DI con una solución de lavado de huevos embrionarios.
4. Recolectar aproximadamente 100 embriones preseleccionados de la placa de Petri de vidrio usando una pipeta de vidrio.
5. Pipetear los embriones en el puerto de entrada del embrión (Figura 4A).
6. Aplique una presión negativa de aproximadamente 3 PSI (es decir, vacío) a la entrada de gas utilizando una bomba de vacío portátil para abrir los microcanales del embrión.
7. Incline el chip microfluídico hacia abajo para que los embriones se alineen automáticamente y se asienten en los microcanales embrionarios (Figura 4B).
8. Si las entradas del microcanal embrionario se obstruyen por múltiples embriones que entran simultáneamente, incline el chip microfluídico hacia arriba y luego hacia abajo nuevamente para despejar la obstrucción.
9. Según el rendimiento requerido, introduzca hasta 300 embriones en los microcanales embrionarios.
10. Una vez completada la carga embrionaria, retire el vacío para inmovilizar los embriones.
11. Incline el chip microfluídico de nuevo a la posición horizontal (Figura 4C).
12. Conecte una fuente de presión positiva portátil (consulte la Tabla de materiales) con un manómetro a la entrada de gas para aplicar una compresión de 3 PSI (Figura 4D).
13. Revise continuamente el manómetro para asegurarse de que se aplica un nivel de compresión constante.
14. Si se van a realizar experimentos de imágenes en vivo en los embriones estimulados mecánicamente, coloque el chip microfluídico en un portaobjetos de vidrio de etapa de microscopio estándar con la entrada de gas conectada a la fuente de presión.
15. Una vez que se completa el experimento de compresión, los embriones se pueden recolectar para el análisis posterior. Para hacer esto, primero, aplique el vacío a la entrada de gas para liberar los embriones.
16. Luego, incline el chip microfluídico hacia arriba para que los embriones se muevan hacia el puerto de introducción de embriones (Figura 4E).
17. Recoger los embriones del chip microfluídico utilizando una pipeta de vidrio.
    NOTA: Tras la recolección, los efectos de la compresión en el desarrollo embrionario y la viabilidad pueden investigarse mediante el crecimiento de las moscas de la fruta hasta la edad adulta. La capacidad de procesamiento de alto rendimiento del dispositivo microfluídico también permite que los embriones se utilicen en ensayos basados en ómicas posteriores que requieren un gran número de muestras (Figura 2).

Resultados

El sistema microfluídico se divide en dos subcompartimentos separados por paredes laterales PDMS deformables. El primer compartimento es el sistema líquido donde se introducen los embriones de Drosophila , se alinean, alinean y comprimen automáticamente. El segundo compartimento es un sistema de gas donde la presión del gas a ambos lados de los canales de compresión se controla a través de microcanales sin salida para controlar con precisión el ancho efectivo de los canales de compresión. El dis...

Discusión

El artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica automáticamente a cientos de embriones completos de Drosophila . La integración del sistema microfluídico con un delgado cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes de embriones con microscopía confocal de alta resolución durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección de los embriones justo después de la estimulaci...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes	Fisher	14-955-111B	Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer	University Wafer	452
Biopsy punches	Ted Pella	15110
Bleach			Not brand specific
Blunt needle set	CML Supply	901
Contact Mask Aligner	Quintel	Q4000 MA
Cutting mat	Dahle	Vantage 10670	size: 24" x 36"
Developer	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
Direct Write Lithographer	Heidelberg	MLA100
Dissecting microscope			Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish	Fisher	FB0875713A
Glass slide	Warner Instruments	64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			Not brand specific
Oven	Labnet	I5110A
Paintbrush			Not brand specific
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Photoresist	MicroChem	SU-8 2100
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Portable pressure source	hygger Quietest	HGD946
Pressure gauge	Cole-Parmer	EW-68950-25
Spin Coater	Laurell	WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	Fisher	AAA16046AP
Tubing	Saint-Gobain	02-587-1A
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05
Vacuum Pump	Cole-Parmer	EW-07164-87