Çok Hücreli Organizmaların Yüksek Verimli Bir Mikroakışkan Sıkıştırma Sistemi Aracılığıyla Mekanostimülasyonu

Özet

Mevcut protokol, yüzlerce Drosophila melanogaster embriyosunu minimum kullanıcı müdahalesiyle hizalayabilen, hareketsiz hale getirebilen ve hassas bir şekilde sıkıştırabilen mikroakışkan bir sistemin tasarımını, üretimini ve karakterizasyonunu açıklamaktadır. Bu sistem, stimülasyon sonrası analiz için numunelerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini ve geri kazanılmasını sağlar ve diğer çok hücreli biyolojik sistemlere uyum sağlayacak şekilde ölçeklendirilebilir.

Özet

Embriyogenez sırasında, koordineli hücre hareketi, gen ekspresyonunu ve aktivitesini düzenleyen mekanik kuvvetler üretir. Bu süreci incelemek için, tüm embriyoları mekanik olarak uyarmak için aspirasyon veya örtü slip sıkıştırma gibi araçlar kullanılmıştır. Bu yaklaşımlar, kesin olmadıkları, manuel kullanım gerektirdikleri ve aynı anda sadece birkaç embriyoyu işleyebildikleri için deneysel tasarımı sınırlar. Mikroakışkan sistemler, verimi ve hassasiyeti artırırken bu tür deneysel görevleri otomatikleştirmek için büyük potansiyele sahiptir. Bu makalede, tüm Drosophila melanogaster (meyve sineği) embriyolarını hassas bir şekilde sıkıştırmak için geliştirilen mikroakışkan bir sistem açıklanmaktadır. Bu sistem, pnömatik olarak çalıştırılan deforme edilebilir yan duvarlara sahip mikro kanallara sahiptir ve embriyo hizalaması, immobilizasyon, sıkıştırma ve stimülasyon sonrası toplanmasını sağlar. Bu mikro kanalları yedi şeride paralel hale getirerek, aynı anda yüzlerce Drosophila embriyosuna sabit veya dinamik sıkıştırma desenleri uygulanabilir. Bu sistemin bir cam kapak parçası üzerinde imal edilmesi, numunelerin yüksek çözünürlüklü mikroskoplarla eşzamanlı mekanik stimülasyonunu ve görüntülenmesini kolaylaştırır. Dahası, PDMS gibi biyouyumlu malzemelerin kullanımı ve sistemden sıvı akıtma yeteneği, bu cihazı medyaya bağımlı numunelerle uzun süreli deneyler yapabilmektedir. Bu yaklaşım aynı zamanda numuneleri mekanik olarak geren manuel montaj gereksinimini de ortadan kaldırır. Ayrıca, mikrokanallardan hızlı bir şekilde numune toplama yeteneği, geleneksel mekanik stimülasyon yaklaşımları kullanılarak elde edilemeyen büyük örneklem sayıları gerektiren -omik testler de dahil olmak üzere stimülasyon sonrası analizlere olanak tanır. Bu sistemin geometrisi, farklı biyolojik sistemlere kolayca ölçeklenebilir ve çok sayıda alanın, yüksek numune verimi, mekanik stimülasyon veya immobilizasyon ve otomatik hizalama dahil olmak üzere burada açıklanan işlevsel özelliklerden yararlanmasını sağlar.

Giriş

Canlı sistemler, yaşamları boyunca çeşitli mekanik girdileri sürekli olarak deneyimlemekte ve bunlara yanıt vermektedir¹. Mekanotransdüksiyon, gelişimsel bozukluklar, kas ve kemik kaybı ve mekanik ortamdan doğrudan veya dolaylı olarak etkilenen sinyal yolları yoluyla nöropatolojiler dahil olmak üzere birçok hastalıkla ilişkilendirilmiştir². Bununla birlikte, mekanosensitif sinyal yolakları^4'te mekanik stimülasyon³ ile düzenlenen genler ve proteinler büyük ölçüde bilinmemektedir⁵, mekanik düzenleme mekanizmalarının aydınlatılmasını ve patolojik mekano....

Protokol

1. Silikon gofret kalıbının hazırlanması

1. Silikon gofreti (bakınız Malzeme Tablosu) önce asetonla, sonra izopropil alkolle (IPA) temizleyin.
2. Silikon gofreti, dehidrasyon fırını için 30 dakika boyunca 250 °C'lik bir sıcak plakaya yerleştirin (Şekil 3A).
3. Silikon gofreti buhar asal fırında hekzametildiilazan (HDMS) ile kaplayın (bkz. Malzeme Tablosu) (proses sıcaklığı: 150 °C, proses basıncı: 2 Torr, işlem süresi: 5 dakika, HDMS hacmi: 5 μL) (Şekil 3B).
4. Viskozitesini azaltmak için bir şişe SU-8 2100 fotorezistini ( ....

Sonuçlar

Mikroakışkan sistem, deforme olabilen PDMS yan duvarları ile ayrılmış iki alt bölmeye ayrılmıştır. İlk bölme, Drosophila embriyolarının tanıtıldığı, otomatik olarak hizalandığı, sıralandığı ve sıkıştırıldığı sıvı sistemdir. İkinci bölme, sıkıştırma kanallarının her iki tarafındaki gaz basıncının, sıkıştırma kanallarının etkin genişliğini hassas bir şekilde kontrol etmek için çıkmaz mikro kanallar aracılığıyla kontrol edildiği bir gaz sist.......

Tartışmalar

Makale, yüzlerce Drosophila embriyosuna mekanik stimülasyonu otomatik olarak hizalamak, hareketsiz hale getirmek ve hassas bir şekilde uygulamak için mikroakışkan bir cihazın geliştirilmesini açıklamaktadır. Mikroakışkan sistemin ince bir cam kapak kayması ile entegrasyonu, stimülasyon sırasında embriyoların yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi ile görüntülenmesini sağlamıştır. Mikroakışkan cihaz ayrıca, aşağı akış biyolojik tahlillerinin çalıştırılması için stim.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes	Fisher	14-955-111B	Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer	University Wafer	452
Biopsy punches	Ted Pella	15110
Bleach			Not brand specific
Blunt needle set	CML Supply	901
Contact Mask Aligner	Quintel	Q4000 MA
Cutting mat	Dahle	Vantage 10670	size: 24" x 36"
Developer	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
Direct Write Lithographer	Heidelberg	MLA100
Dissecting microscope			Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish	Fisher	FB0875713A
Glass slide	Warner Instruments	64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			Not brand specific
Oven	Labnet	I5110A
Paintbrush			Not brand specific
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Photoresist	MicroChem	SU-8 2100
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Portable pressure source	hygger Quietest	HGD946
Pressure gauge	Cole-Parmer	EW-68950-25
Spin Coater	Laurell	WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	Fisher	AAA16046AP
Tubing	Saint-Gobain	02-587-1A
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05
Vacuum Pump	Cole-Parmer	EW-07164-87