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Resumo

O presente protocolo descreve o projeto, fabricação e caracterização de um sistema microfluídico capaz de alinhar, imobilizar e comprimir com precisão centenas de embriões de Drosophila melanogaster com intervenção mínima do usuário. Este sistema permite imagens de alta resolução e recuperação de amostras para análise pós-estimulação e pode ser dimensionado para acomodar outros sistemas biológicos multicelulares.

Resumo

Durante a embriogênese, o movimento celular coordenado gera forças mecânicas que regulam a expressão e a atividade gênica. Para estudar esse processo, ferramentas como aspiração ou compressão de deslizamento de cobertura têm sido usadas para estimular mecanicamente embriões inteiros. Essas abordagens limitam o projeto experimental, pois são imprecisas, exigem manuseio manual e podem processar apenas alguns embriões simultaneamente. Os sistemas microfluídicos têm um grande potencial para automatizar essas tarefas experimentais e, ao mesmo tempo, aumentar a produtividade e a precisão. Este artigo descreve um sistema microfluídico desenvolvido para comprimir com precisão embriões inteiros de Drosophila melanogaster (mosca da fruta). Este sistema possui microcanais com paredes laterais deformáveis acionadas pneumaticamente e permite o alinhamento embrionário, imobilização, compressão e coleta pós-estimulação. Ao paralelizar esses microcanais em sete faixas, padrões de compressão constantes ou dinâmicos podem ser aplicados a centenas de embriões de Drosophila simultaneamente. A fabricação deste sistema em uma tampa de vidro facilita a estimulação mecânica simultânea e a imagem de amostras com microscópios de alta resolução. Além disso, a utilização de materiais biocompatíveis, como o PDMS, e a capacidade de fluir fluido através do sistema tornam este dispositivo capaz de experimentos de longo prazo com amostras dependentes de mídia. Essa abordagem também elimina a necessidade de montagem manual que tensiona mecanicamente as amostras. Além disso, a capacidade de coletar rapidamente amostras dos microcanais permite análises pós-estimulação, incluindo ensaios -ômicos que exigem um grande número de amostras inatingíveis usando abordagens tradicionais de estimulação mecânica. A geometria deste sistema é facilmente escalável para diferentes sistemas biológicos, permitindo que vários campos se beneficiem das características funcionais aqui descritas, incluindo alto rendimento da amostra, estimulação mecânica ou imobilização e alinhamento automatizado.

Introdução

Os sistemas vivos experimentam e respondem constantemente a várias entradas mecânicas ao longo de suas vidas1. A mecanotransdução tem sido associada a muitas doenças, incluindo distúrbios do desenvolvimento, perda muscular e óssea e neuropatologias através de vias de sinalização direta ou indiretamente afetadas pelo ambiente mecânico2. No entanto, os genes e proteínas regulados pela estimulação mecânica3 nas vias de sinalização mecanossensíveis4 permanecem em grande parte desconhecidos5, impedindo a elucidação dos mecanismos de regulação mecânica e a identificação de alvos moleculares para doenças associadas à mecanotransdução patológica 6,7 . Um fator limitante na projeção de estudos de mecanobiologia nos processos fisiológicos relacionados é o uso de células individuais com placas de cultura convencionais em vez de organismos multicelulares intactos. Organismos modelo, como a Drosophila melanogaster (mosca da fruta), têm contribuído sobremaneira para a compreensão dos genes, vias de sinalização e proteínas envolvidas no desenvolvimento animal 8,9,10. No entanto, o uso de Drosophila e outros organismos modelo multicelulares na pesquisa em mecanobiologia tem sido dificultado por desafios com ferramentas experimentais. Técnicas convencionais para preparar, classificar, fazer imagens ou aplicar vários estímulos requerem principalmente manipulação manual; essas abordagens são demoradas, exigem experiência, introduzem variabilidade e limitam o desenho experimental e o tamanho da amostra11. Os recentes avanços microtecnológicos são um grande recurso para permitir novos ensaios biológicos com rendimento muito alto e parâmetros experimentais altamente controlados12,13,14.

Este artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico aprimorado para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica na forma de compressão uniaxial a centenas de embriões inteiros de Drosophila 15 (Figura 1). A integração do sistema microfluídico com uma tampa de vidro permitiu imagens confocais de alta resolução das amostras durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também possibilitou a coleta rápida dos embriões após a estimulação para ensaios de corrida -ômica (Figura 2). Explicações sobre as considerações de projeto deste dispositivo, bem como a fabricação usando litografia suave e caracterização experimental, são descritas aqui. Uma vez que a fabricação de um molde de wafer de silício de tal dispositivo requer um revestimento uniforme de fotorresistência espessa (espessura >200 μm) em grandes áreas com trincheiras de alta proporção (AR) (AR >5), esse método modificou consideravelmente o protocolo tradicional de fabricação de moldes fotolitográficos. Desta forma, este método facilitou o manuseio, adesão, revestimento, padronização e desenvolvimento do fotorresistente. Além disso, possíveis armadilhas e suas soluções são discutidas. Por fim, a versatilidade dessa estratégia de projeto e fabricação foi demonstrada por meio de outros sistemas multicelulares, como câmaras de ovos de Drosophila e organoides cerebrais16.

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Protocolo

1. Preparação do molde de bolacha de silício

  1. Limpe a bolacha de silício (ver Tabela de Materiais) primeiro com acetona e depois com álcool isopropílico (IPA).
  2. Colocar a bolacha de silício sobre uma placa quente de 250 °C durante 30 minutos para desidratação (figura 3A).
  3. Revestir a bolacha de silício com hexametildisilazano (HDMS) num forno de vapor prime (ver Tabela de Materiais) (temperatura do processo: 150 °C, pressão do processo: 2 Torr, tempo do processo: 5 min, volume do HDMS: 5 μL) (Figura 3B).
  4. Coloque uma garrafa de fotorresistente SU-8 2100 (ver Tabela de Materiais) em um forno a 60 °C por 15 minutos para reduzir sua viscosidade.
    NOTA: Após o aquecimento no forno, a viscosidade do fotorresistente diminui. Fotorresistentes com viscosidade reduzida podem ser manuseados com mais facilidade e podem ser despejados com mais precisão em cima da bolacha.
  5. Colocar a bolacha de silício sobre uma placa quente de 60 °C e deitar 1 ml do fotorresistente aquecido por cada polegada da bolacha até que o fotorresistente cubra a maior parte da superfície (Figura 3C).
  6. Transfira a bolacha de silício revestida com fotorresistência para um revestidor de rotação (consulte Tabela de materiais).
  7. Aplique o pré-spin primeiro a 250 rpm por 30 s e depois a 350 rpm por mais 30 s, ambos com aceleração de 100 rpm/s (Figura 3D).
  8. Remova o excesso de fotorresistência das bordas da bolacha de silício usando um cotonete de sala limpa.
  9. Aplique um giro primeiro a 500 rpm por 15 s com aceleração de 100 rpm/s e depois a 1450 rpm por 30 s com aceleração de 300 rpm/s (Figura 3E).
  10. Remova o talão de borda com um cotonete de sala limpa.
  11. Coloque a bolacha de silício sobre uma placa quente de 50 °C e pulverize acetona na bolacha para remover imperfeições e promover um revestimento uniforme (Figura 3F).
  12. Aumentar lentamente a temperatura da placa quente para 95 °C à velocidade de 2 °C/min.
  13. Asse suavemente a bolacha de silício a 95 °C durante 50 minutos (Figura 3G).
  14. Arrefecer lentamente a placa quente até à temperatura ambiente a uma taxa de 2°C/min.
  15. Coloque a bolacha de silício em um alinhador de máscara (consulte Tabela de materiais) e coloque a fotomáscara em cima dela (consulte a Figura 1 Suplementar para a geometria da fotomáscara).
  16. Expor a bolacha de silício a 350 mJ/cm 2 de luz UV (35 mW/cm2 por 10 s) através da fotomáscara usando o alinhador de máscara de contato (Figura 3H).
  17. Aplicar cozimentos consecutivos pós-exposição na bolacha de silício, colocando-a numa placa quente a 50 °C durante 5 minutos, a 65 °C durante mais 5 minutos e, por último, a 80 °C durante mais 20 minutos (Figura 3I).
  18. Arrefecer lentamente a bolacha de silício até à temperatura ambiente a uma velocidade de 2 °C/min.
  19. Coloque um agitador magnético com um diâmetro ligeiramente menor do que a bolacha de silício em um béquer. Vire a bolacha de silicone de cabeça para baixo e coloque-a em cima do béquer.
  20. Coloque o copo dentro de outro copo maior e encha o copo maior com uma nova solução de revelador (consulte Tabela de materiais). Deixe a bolacha de silício submersa na incorporadora por 30 minutos com o agitador ligado (Figura 3J).
  21. Transfira o wafer de silício para um sonicator de banho ultrassônico preenchido com o revelador fresco por 1 h a 40 kHz (Figura 3K).
  22. Lavar bem a bolacha de silício com uma solução IPA para obter o molde final da bolacha de silício (Figura 3L).

2. Fabricação do chip microfluídico

  1. Coloque o molde de bolacha de silício em um exsicador juntamente com 10 gotas (~ 500 μL) de Tricloro (1H,1H,2H,2H-perfluorooctil)silano (PFOCTS, ver Tabela de Materiais) em um pequeno barco de pesagem nas proximidades.
  2. Ligue o exsicador a uma bomba de vácuo a aproximadamente 200 Torr durante 30 minutos.
  3. Desligue a válvula exsicadora e desconecte a bomba de vácuo durante a noite para o revestimento PFOCTS.
  4. Preparar a solução de polidimetilsiloxano (PDMS) pré-curada misturando a base PDMS com o agente de cura (ver Tabela de Materiais) numa proporção de 10:1.
  5. Desgaseifique a mistura colocando-a numa centrífuga (500 x g durante 5 min à temperatura ambiente).
    NOTA: Esta centrifugação permite que as bolhas migrem para a superfície superior e, consequentemente, sejam removidas em um curto período de tempo.
  6. Despeje a solução PDMS desgaseificada no molde de wafer de silício.
  7. Desgaseifique-o novamente para remover as bolhas de ar presas na superfície do molde.
  8. Curar o PDMS em forno a 60 °C por 1 h e 50 min (Figura 3M).
  9. Use um bisturi para cortar as bordas da região do PDMS curada correspondente à geometria do chip microfluídico (Figura 3N).
  10. Descasque a parte do PDMS e coloque-a de cabeça para baixo em um tapete de corte.
  11. Use uma navalha para cortar a peça do PDMS em sua forma final (Figura 3O).
  12. Perfure os orifícios de entrada e saída no PDMS usando um punch de biópsia (ver Tabela de materiais) ou uma agulha com uma ponta contundente (Figura 3P).
    1. Para o orifício de entrada do embrião, use um punção de 4 mm de diâmetro.
    2. Para os orifícios de saída do embrião, use um punção de 1,3 mm de diâmetro.
    3. Para o orifício de entrada de gás, use um punção de 2 mm.
  13. Use um pedaço de fita adesiva para remover qualquer partícula que possa permanecer na superfície padronizada do PDMS.
  14. Limpe uma lâmina de vidro retangular de 24 mm x 60 mm primeiro com acetona e depois com IPA.
  15. Seque a superfície de vidro com uma pistola de ar conectada a uma fonte de ar filtrada.
  16. Aplique um cozimento de desidratação na lâmina de vidro, colocando-a em uma placa quente de 250 °C por 2 h (Figura 3Q).
  17. Cubra a lâmina de vidro com um copo para evitar a contaminação da superfície.
  18. Coloque o PDMS, com o seu lado padronizado para cima, e o vidro desidratado deslize para um limpador de plasma (ver Tabela de Materiais).
  19. Trate o PDMS e a lâmina de vidro com plasma de oxigênio a 18 W por 30 s.
  20. Coloque o PDMS na lâmina de vidro com sua superfície padronizada voltada para a lâmina de vidro para selar os microcanais via colagem covalente (Figura 3R).
  21. Use uma pinça para empurrar suavemente a parte do PDMS contra a lâmina de vidro para garantir o contato conformacional completo.
  22. Armazene o chip microfluídico completo à temperatura ambiente durante a noite para permitir que a ligação atinja sua resistência final.

3. Preparação dos embriões da mosca da fruta

  1. Permita que as moscas adultas Oregon-R coloquem ovos em placas de ágar suco de maçã (1,5% de ágar, 25% de suco de maçã, 2,5% de sacarose) e colete as placas no momento de desenvolvimento desejado após a postura dos ovos para o experimento dado.
    NOTA: Para os presentes experimentos, as placas foram coletadas aos 140 min para preparação e classificação dos embriões no estádio de celularização17.
  2. Inundar o ágar com lavagem de ovos embrionários (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) e agitar suavemente os embriões com um pincel para desalojá-los do ágar.
  3. Transfira os embriões para uma solução de água sanitária a 50% por 90 s, mexendo ocasionalmente. Coe os embriões através de uma peneira de tecido e lave bem a solução de água sanitária com água.
  4. Transfira os embriões para uma placa de Petri de vidro de 90 mm com lavagem de ovos embrionária suficiente para cobrir totalmente os embriões.
  5. Examine os embriões com transiluminação em um microscópio de dissecação e selecione embriões do estágio de desenvolvimento desejado para carregamento no dispositivo microfluídico.
    NOTA: Nesta aplicação, foram selecionados embriões em estágio de celularização. As descrições detalhadas de como garantir a seleção adequada do estágio de desenvolvimento podem ser encontradas no manual de laboratório da Drosophila17.

4. Aplicação de estimulação mecânica a embriões de moscas da fruta usando o chip microfluídico

  1. Prepare todos os sete microcanais embrionários preenchendo-os com IPA filtrada de 0,4 μm através da porta de entrada principal do embrião.
  2. Substitua o IPA por 0,4 μm de água filtrada deionizada (DI).
  3. Substitua a água DI por uma solução de lavagem de ovos embrionários.
  4. Colete aproximadamente 100 embriões pré-selecionados da placa de Petri de vidro usando uma pipeta de vidro.
  5. Pipetar os embriões para a porta de entrada do embrião (Figura 4A).
  6. Aplique uma pressão negativa de aproximadamente 3 PSI (ou seja, vácuo) na entrada de gás usando uma bomba de vácuo portátil para abrir os microcanais embrionários.
  7. Incline o chip microfluídico para baixo para que os embriões se alinhem e se instalem automaticamente nos microcanais embrionários (Figura 4B).
  8. Se as entradas do microcanal do embrião ficarem entupidas por vários embriões que entram simultaneamente, incline o chip microfluídico para cima e depois para baixo novamente para limpar o entupimento.
  9. Com base no rendimento necessário, introduza até 300 embriões nos microcanais embrionários.
  10. Uma vez que o carregamento do embrião esteja concluído, remova o vácuo para imobilizar os embriões.
  11. Incline o chip microfluídico de volta à posição horizontal (Figura 4C).
  12. Conecte uma fonte de pressão positiva portátil (consulte Tabela de materiais) com um manômetro à entrada de gás para aplicar 3 PSI de compressão (Figura 4D).
  13. Verifique continuamente o manômetro para garantir que um nível de compressão consistente seja aplicado.
  14. Se experimentos de imagem ao vivo forem conduzidos nos embriões estimulados mecanicamente, coloque o chip microfluídico em um suporte de lâmina de vidro de estágio de microscópio padrão com a entrada de gás conectada à fonte de pressão.
  15. Uma vez que o experimento de compressão é concluído, os embriões podem ser coletados para análise a jusante. Para fazer isso, primeiro, aplique o vácuo na entrada de gás para liberar os embriões.
  16. Em seguida, incline o chip microfluídico para cima para que os embriões se movam em direção à porta de introdução do embrião (Figura 4E).
  17. Recolha os embriões do chip microfluídico utilizando uma pipeta de vidro.
    NOTA: Após a coleta, os efeitos da compressão no desenvolvimento embrionário e na viabilidade podem ser investigados pelo crescimento das moscas da fruta até a idade adulta. A capacidade de processamento de alto rendimento do dispositivo microfluídico também permite que embriões sejam usados em ensaios baseados em ômica a jusante que exigem um grande número de amostras (Figura 2).

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Resultados

O sistema microfluídico é dividido em dois subcompartimentos separados por paredes laterais PDMS deformáveis. O primeiro compartimento é o sistema líquido onde os embriões de Drosophila são introduzidos, automaticamente alinhados, alinhados e comprimidos. O segundo compartimento é um sistema de gás onde a pressão do gás em ambos os lados dos canais de compressão é controlada através de microcanais sem saída para controlar com precisão a largura efetiva dos canais de compressão. O dispos...

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Discussão

O artigo descreve o desenvolvimento de um dispositivo microfluídico para alinhar, imobilizar e aplicar com precisão estimulação mecânica a centenas de embriões inteiros de Drosophila . A integração do sistema microfluídico com uma fina tampa de vidro permitiu a imagem de embriões com microscopia confocal de alta resolução durante a estimulação. O dispositivo microfluídico também permitiu a coleta dos embriões logo após a estimulação para ensaios biológicos a jusante. As considerações de de...

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Divulgações

Os autores não têm interesses financeiros nos produtos descritos neste manuscrito e não têm mais nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela National Science Foundation (CMMI-1946456), pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea (FA9550-18-1-0262) e pelo Instituto Nacional de Saúde (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishesFisher14-955-111BPerferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si WaferUniversity Wafer452
Biopsy punchesTed Pella15110
BleachNot brand specific
Blunt needle setCML Supply901
Contact Mask AlignerQuintelQ4000 MA
Cutting matDahleVantage 10670size: 24" x 36"
DeveloperKayaku Advance MaterialsSU-8 2000
Direct Write LithographerHeidelbergMLA100
Dissecting microscopeAny commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dishFisherFB0875713A
Glass slideWarner Instruments64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime OvenYes EngineeringYES-3TA
NaClNot brand specific
OvenLabnetI5110A
PaintbrushNot brand specific
PDMSDow CorningSylgard 184
PhotoresistMicroChemSU-8 2100
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Portable pressure sourcehygger QuietestHGD946
Pressure gaugeCole-ParmerEW-68950-25
Spin CoaterLaurellWS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)Sigma-Aldrich448931-10G
Triton-X 100FisherAAA16046AP
TubingSaint-Gobain02-587-1A
Ultrasonic CleanerCole-ParmerUX-08895-05
Vacuum PumpCole-ParmerEW-07164-87

Referências

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