Meccanostimolazione di organismi pluricellulari attraverso un sistema di compressione microfluidica ad alta produttività

Riepilogo

Il presente protocollo descrive la progettazione, la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in grado di allineare, immobilizzare e comprimere con precisione centinaia di embrioni di Drosophila melanogaster con un intervento minimo da parte dell'utente. Questo sistema consente l'imaging ad alta risoluzione e il recupero di campioni per l'analisi post-stimolazione e può essere scalato per adattarsi ad altri sistemi biologici multicellulari.

Abstract

Durante l'embriogenesi, il movimento cellulare coordinato genera forze meccaniche che regolano l'espressione e l'attività genica. Per studiare questo processo, sono stati utilizzati strumenti come l'aspirazione o la compressione del coverslip per stimolare meccanicamente embrioni interi. Questi approcci limitano la progettazione sperimentale in quanto sono imprecisi, richiedono una manipolazione manuale e possono elaborare solo un paio di embrioni contemporaneamente. I sistemi microfluidici hanno un grande potenziale per automatizzare tali attività sperimentali, aumentando al contempo la produttività e la precisione. Questo articolo descrive un sistema microfluidico sviluppato per comprimere con precisione interi embrioni di Drosophila melanogaster (moscerino della frutta). Questo sistema è dotato di microcanali con pareti laterali deformabili azionate pneumaticamente e consente l'allineamento dell'embrione, l'immobilizzazione, la compressione e la raccolta post-stimolazione. Parallelizzando questi microcanali in sette corsie, i modelli di compressione stazionari o dinamici possono essere applicati a centinaia di embrioni di Drosophila contemporaneamente. La fabbricazione di questo sistema su un vetrino facilita la stimolazione meccanica simultanea e l'imaging di campioni con microscopi ad alta risoluzione. Inoltre, l'utilizzo di materiali biocompatibili, come il PDMS, e la capacità di far fluire il fluido attraverso il sistema rendono questo dispositivo capace di esperimenti a lungo termine con campioni dipendenti dai media. Questo approccio elimina anche la necessità di un montaggio manuale che sollecita meccanicamente i campioni. Inoltre, la capacità di raccogliere rapidamente campioni dai microcanali consente analisi post-stimolazione, compresi i saggi -omici che richiedono grandi numeri di campioni irraggiungibili utilizzando i tradizionali approcci di stimolazione meccanica. La geometria di questo sistema è facilmente scalabile a diversi sistemi biologici, consentendo a numerosi campi di beneficiare delle caratteristiche funzionali qui descritte, tra cui l'elevata produttività del campione, la stimolazione meccanica o l'immobilizzazione e l'allineamento automatico.

Introduzione

I sistemi viventi sperimentano e rispondono costantemente a vari input meccanici per tutta la loro vita¹. La meccanotrasduzione è stata collegata a molte malattie, tra cui disturbi dello sviluppo, perdita muscolare e ossea e neuropatologie attraverso vie di segnalazione direttamente o indirettamente influenzate dall'ambiente meccanico². Tuttavia, i geni e le proteine che sono regolati dalla stimolazione meccanica³ nelle vie di segnalazione meccanosensibili⁴ rimangono in gran parte sconosciuti⁵, impedendo la delucidazione dei meccanismi di regolazione meccanica e l'identificazione di bersagli molecolari per le malattie associate alla meccanotrasduzione patologica ^6,7 . Un fattore limitante nel proiettare gli studi di meccanobiologia sui processi fisiologici correlati è l'utilizzo di singole cellule con piatti di coltura convenzionali invece di organismi multicellulari intatti. Organismi modello, come Drosophila melanogaster (moscerino della frutta), hanno contribuito notevolmente alla comprensione dei geni, delle vie di segnalazione e delle proteine coinvolte nello sviluppo animale 8,9,10. Tuttavia, l'uso di Drosophila e di altri organismi modello multicellulari nella ricerca meccanobiologica è stato ostacolato da sfide con strumenti sperimentali. Le tecniche convenzionali per la preparazione, l'ordinamento, l'imaging o l'applicazione di vari stimoli richiedono principalmente una manipolazione manuale; Questi approcci richiedono tempo, richiedono esperienza, introducono variabilità e limitano il disegno sperimentale e la dimensione del campione¹¹. I recenti progressi microtecnologici sono una grande risorsa per consentire nuovi saggi biologici con un rendimento molto elevato e parametri sperimentali altamente controllati^12,13,14.

Questo articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico potenziato per allineare, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica sotto forma di compressione uniassiale a centinaia di embrioni interi di Drosophila ¹⁵ (Figura 1). L'integrazione del sistema microfluidico con un vetrino di vetro ha permesso l'imaging confocale ad alta risoluzione dei campioni durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso una rapida raccolta degli embrioni dopo la stimolazione per l'esecuzione di saggi -omici (Figura 2). Le spiegazioni delle considerazioni di progettazione di questo dispositivo, nonché la fabbricazione mediante litografia morbida e caratterizzazione sperimentale, sono descritte nel presente documento. Poiché la realizzazione di uno stampo per wafer di silicio di tale dispositivo richiede un rivestimento uniforme di fotoresist spesso (spessore >200 μm) su ampie aree con trincee ad alto rapporto di aspetto (AR) (AR >5), questo metodo ha modificato considerevolmente il tradizionale protocollo di fabbricazione di stampi fotolitografici. In questo modo, questo metodo ha facilitato la manipolazione, l'adesione, il rivestimento, il pattern e lo sviluppo del fotoresist. Inoltre, vengono discusse le potenziali insidie e le loro soluzioni. Infine, la versatilità di questa strategia di progettazione e fabbricazione è stata dimostrata utilizzando altri sistemi multicellulari come camere d'uovo di Drosophila e organoidi cerebrali¹⁶.

Protocollo

1. Preparazione dello stampo per wafer di silicio

1. Pulire il wafer di silicio (vedi tabella dei materiali) prima con acetone e poi con alcool isopropilico (IPA).
2. Posizionare il wafer di silicio su una piastra calda a 250 °C per 30 minuti per la disidratazione (Figura 3A).
3. Rivestire il wafer di silicio con esametildisilazano (HDMS) in un forno a vapore (vedere la tabella dei materiali) (temperatura di processo: 150 °C, pressione di processo: 2 Torr, tempo di processo: 5 min, volume HDMS: 5 μL) (Figura 3B).
4. Mettere una bottiglia di SU-8 2100 photoresist (vedi Tabella dei materiali) in un forno a 60 °C per 15 minuti per ridurne la viscosità.
   NOTA: Dopo il riscaldamento nel forno, la viscosità del fotoresist diminuisce. I fotoresist con viscosità ridotta possono essere maneggiati più facilmente e possono essere versati con maggiore precisione sulla parte superiore del wafer.
5. Posizionare il wafer di silicio su una piastra riscaldante a 60 °C e versare 1 mL di fotoresist riscaldato per ogni pollice del wafer fino a quando il fotoresist copre la maggior parte della superficie (Figura 3C).
6. Trasferire il wafer di silicio rivestito con fotoresist su uno spin coater (vedere Tabella dei materiali).
7. Applicare il pre-spin prima a 250 giri/min per 30 s e poi a 350 giri/min per altri 30 s, entrambi con accelerazione di 100 giri/min (Figura 3D).
8. Rimuovere il fotoresist in eccesso dai bordi del wafer di silicio utilizzando un tampone per camera bianca.
9. Applicare una rotazione prima a 500 giri/min per 15 s con accelerazione di 100 giri/min e poi a 1450 giri/min per 30 giri/min con accelerazione di 300 giri/min (Figura 3E).
10. Rimuovere il bordo con un tampone per camera bianca.
11. Posizionare il wafer di silicio su una piastra riscaldante a 50 °C e spruzzare acetone sul wafer per rimuovere le imperfezioni e promuovere un rivestimento uniforme (Figura 3F).
12. Aumentare lentamente la temperatura della piastra riscaldante a 95 °C alla velocità di 2°C/min.
13. Cuocere morbidamente il wafer di silicio a 95 °C per 50 minuti (Figura 3G).
14. Raffreddare lentamente la piastra calda a temperatura ambiente ad una velocità di 2°C/min.
15. Posizionare il wafer di silicio su un allineatore per maschera (vedere la tabella dei materiali) e posizionare la fotomaschera sopra di esso (fare riferimento alla Figura supplementare 1 per la geometria della maschera fotografica).
16. Esporre il wafer di silicio a 350 mJ/cm 2 di luce UV (35 mW/cm² per 10 s) attraverso la fotomaschera utilizzando l'allineatore della maschera di contatto (Figura 3H).
17. Applicare cuocere consecutivamente post-esposizione sul wafer di silicio posizionando il wafer su una piastra calda a 50 °C per 5 minuti, a 65 °C per altri 5 minuti e infine a 80 °C per altri 20 minuti (Figura 3I).
18. Raffreddare lentamente il wafer di silicio a temperatura ambiente alla velocità di 2 °C/min.
19. Posizionare un agitatore magnetico con un diametro leggermente inferiore rispetto al wafer di silicio in un becher. Capovolgere il wafer di silicio e posizionarlo sopra il becher.
20. Posizionare il becher all'interno di un altro becher più grande e riempire il becher più grande con una nuova soluzione di sviluppo (vedere Tabella dei materiali). Lasciare il wafer di silicio immerso nello sviluppatore per 30 minuti con l'agitatore acceso (Figura 3J).
21. Trasferire il wafer di silicio in un sonicatore a bagno ad ultrasuoni riempito con lo sviluppatore fresco per 1 ora a 40 kHz (Figura 3K).
22. Lavare accuratamente il wafer di silicio con una soluzione IPA per ottenere lo stampo finale del wafer di silicio (Figura 3L).

2. Fabbricazione del chip microfluidico

1. Posizionare lo stampo per wafer di silicio in un essiccatore insieme a 10 gocce (~ 500 μL) di tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluoroottil)silano (PFOCTS, vedi tabella dei materiali) in una piccola barca di pesatura nelle vicinanze.
2. Collegare l'essiccatore a una pompa per vuoto a circa 200 Torr per 30 minuti.
3. Spegnere la valvola dell'essiccatore e scollegare la pompa per vuoto durante la notte per il rivestimento PFOCTS.
4. Preparare la soluzione di polidimetilsilossano (PDMS) prepolimerizzato mescolando la base PDMS con l'agente di polimerizzazione (vedere la tabella dei materiali) con un rapporto di 10:1.
5. Degasare la miscela mettendola in una centrifuga (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente).
   NOTA: Questa centrifugazione consente alle bolle di migrare verso la superficie superiore e di conseguenza di essere rimosse in un breve periodo di tempo.
6. Versare la soluzione PDMS degassata sullo stampo del wafer di silicio.
7. Degasarlo nuovamente per rimuovere le bolle d'aria intrappolate sulla superficie dello stampo.
8. Polimerizzare il PDMS in un forno a 60 °C per 1 ora e 50 minuti (Figura 3M).
9. Utilizzare un bisturi per tagliare i bordi della regione PDMS polimerizzata corrispondente alla geometria del chip microfluidico (Figura 3N).
10. Sbucciare la parte PDMS e posizionarla capovolta su un tappetino da taglio.
11. Utilizzare un rasoio per tagliare la parte PDMS nella sua forma finale (Figura 3O).
12. Pugni i fori di ingresso e uscita sul PDMS usando un punzone bioptico (vedi Tabella dei materiali) o un ago con una punta smussata (Figura 3P).
    1. Per il foro di ingresso dell'embrione, utilizzare un punzone di 4 mm di diametro.
    2. Per i fori di uscita dell'embrione, utilizzare un punzone di 1,3 mm di diametro.
    3. Per il foro di ingresso del gas, utilizzare un punzone da 2 mm.
13. Utilizzare un pezzo di scotch per rimuovere eventuali particelle che potrebbero rimanere sulla superficie modellata del PDMS.
14. Pulire un vetrino rettangolare di vetro 24 mm x 60 mm prima con acetone e poi con alcool isopropilico.
15. Asciugare la superficie del vetro con una pistola ad aria compressa collegata a una fonte d'aria filtrata.
16. Applicare un forno per disidratazione sul vetrino posizionandolo su una piastra calda a 250 °C per 2 ore (Figura 3Q).
17. Coprire il vetrino con un becher per evitare la contaminazione superficiale.
18. Posizionare il PDMS, con il suo lato modellato verso l'alto, e il vetro disidratato scivolare in un detergente al plasma (vedere Tabella dei materiali).
19. Trattare il PDMS e il vetrino con plasma di ossigeno a 18 W per 30 s.
20. Posizionare il PDMS sul vetrino con la superficie modellata rivolta verso il vetrino per sigillare i microcanali tramite legame covalente (Figura 3R).
21. Utilizzare una pinzetta per spingere delicatamente la parte PDMS contro il vetrino per garantire un contatto conformazionale completo.
22. Conservare il chip microfluidico completato a temperatura ambiente durante la notte per consentire al legame di raggiungere la sua forza finale.

3. Preparazione degli embrioni di moscerino della frutta

1. Consentire alle mosche adulte Oregon-R di deporre le uova su piastre di agar al succo di mela (1,5% di agar, 25% di succo di mela, 2,5% di saccarosio) e raccogliere le piastre al momento di sviluppo desiderato dopo la deposizione delle uova per l'esperimento dato.
   NOTA: Per i presenti esperimenti, le piastre sono state raccolte a 140 minuti per preparare e ordinare gli embrioni nella fase di cellularizzazione¹⁷.
2. Inondare l'agar con il lavaggio dell'ovulo embrionale (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) e agitare delicatamente gli embrioni con un pennello per rimuoverli dall'agar.
3. Trasferire gli embrioni in una soluzione di candeggina al 50% per 90 s, mescolando di tanto in tanto. Filtrare gli embrioni attraverso un setaccio tissutale e lavare accuratamente la soluzione di candeggina con acqua.
4. Trasferire gli embrioni in una capsula di Petri di vetro da 90 mm con un lavaggio sufficiente a coprire completamente gli embrioni.
5. Esaminare gli embrioni con transilluminazione su un microscopio da dissezione e selezionare gli embrioni della fase di sviluppo desiderata per il caricamento nel dispositivo microfluidico.
   NOTA: In questa applicazione sono stati selezionati embrioni in fase di cellularizzazione. Le descrizioni dettagliate di come garantire una corretta selezione della fase di sviluppo sono disponibili nel manuale di laboratorio per Drosophila¹⁷.

4. Applicare la stimolazione meccanica agli embrioni di moscerino della frutta utilizzando il chip microfluidico

1. Innesca tutti e sette i microcanali embrionali riempiendoli con alcool isopropilico filtrato da 0,4 μm attraverso la porta principale di ingresso dell'embrione.
2. Sostituire l'alcool isopropilico con acqua deionizzata (DI) filtrata da 0,4 μm.
3. Sostituire l'acqua DI con la soluzione di lavaggio dell'uovo embrionale.
4. Raccogliere circa 100 embrioni preselezionati dalla capsula di Petri di vetro utilizzando una pipetta di vetro.
5. Pipettare gli embrioni nella porta di ingresso dell'embrione (Figura 4A).
6. Applicare una pressione negativa di circa 3 PSI (cioè vuoto) all'ingresso del gas utilizzando una pompa per vuoto portatile per aprire i microcanali dell'embrione.
7. Inclinare il chip microfluidico verso il basso in modo che gli embrioni si allineino automaticamente e si depositino nei microcanali dell'embrione (Figura 4B).
8. Se le entrate dei microcanali dell'embrione vengono ostruite da più embrioni che entrano contemporaneamente, inclinare il chip microfluidico verso l'alto e poi di nuovo verso il basso per eliminare l'intasamento.
9. In base alla produttività richiesta, introdurre fino a 300 embrioni nei microcanali embrionali.
10. Una volta completato il carico dell'embrione, rimuovere il vuoto per immobilizzare gli embrioni.
11. Inclinare il chip microfluidico in posizione orizzontale (Figura 4C).
12. Collegare una sorgente di pressione positiva portatile (vedere la tabella dei materiali) con un manometro all'ingresso del gas per applicare una compressione di 3 PSI (Figura 4D).
13. Controllare continuamente il manometro per garantire che venga applicato un livello di compressione costante.
14. Se verranno condotti esperimenti di imaging dal vivo sugli embrioni stimolati meccanicamente, posizionare il chip microfluidico su un supporto per vetrino da palcoscenico standard per microscopio con l'ingresso del gas collegato alla sorgente di pressione.
15. Una volta completato l'esperimento di compressione, gli embrioni possono essere raccolti per l'analisi a valle. Per fare ciò, in primo luogo, applicare il vuoto all'ingresso del gas per liberare gli embrioni.
16. Quindi, inclinare il chip microfluidico verso l'alto in modo che gli embrioni si muovano verso la porta di introduzione dell'embrione (Figura 4E).
17. Raccogliere gli embrioni dal chip microfluidico usando una pipetta di vetro.
    NOTA: Al momento della raccolta, gli effetti della compressione sullo sviluppo embrionale e sulla vitalità possono essere studiati facendo crescere i moscerini della frutta nell'età adulta. La capacità di elaborazione ad alta produttività del dispositivo microfluidico consente inoltre di utilizzare gli embrioni in saggi basati su omiche a valle che richiedono un gran numero di campioni (Figura 2).

Risultati

Il sistema microfluidico è diviso in due sottocompartimenti separati da pareti laterali PDMS deformabili. Il primo compartimento è il sistema liquido in cui vengono introdotti gli embrioni di Drosophila , automaticamente allineati, allineati e compressi. Il secondo compartimento è un sistema a gas in cui la pressione del gas su entrambi i lati dei canali di compressione è controllata tramite microcanali senza uscita per controllare con precisione la larghezza effettiva dei canali di compressione. Il...

Discussione

L'articolo descrive lo sviluppo di un dispositivo microfluidico per allineare automaticamente, immobilizzare e applicare con precisione la stimolazione meccanica a centinaia di embrioni interi di Drosophila . L'integrazione del sistema microfluidico con un sottile vetrino di copertura ha permesso l'imaging degli embrioni con microscopia confocale ad alta risoluzione durante la stimolazione. Il dispositivo microfluidico ha anche permesso la raccolta degli embrioni subito dopo la stimolazione per l'esecuzione di s...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes	Fisher	14-955-111B	Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer	University Wafer	452
Biopsy punches	Ted Pella	15110
Bleach			Not brand specific
Blunt needle set	CML Supply	901
Contact Mask Aligner	Quintel	Q4000 MA
Cutting mat	Dahle	Vantage 10670	size: 24" x 36"
Developer	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
Direct Write Lithographer	Heidelberg	MLA100
Dissecting microscope			Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish	Fisher	FB0875713A
Glass slide	Warner Instruments	64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			Not brand specific
Oven	Labnet	I5110A
Paintbrush			Not brand specific
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Photoresist	MicroChem	SU-8 2100
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Portable pressure source	hygger Quietest	HGD946
Pressure gauge	Cole-Parmer	EW-68950-25
Spin Coater	Laurell	WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	Fisher	AAA16046AP
Tubing	Saint-Gobain	02-587-1A
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05
Vacuum Pump	Cole-Parmer	EW-07164-87