Mécanostimulation d’organismes multicellulaires par un système de compression microfluidique à haut débit

Résumé

Le présent protocole décrit la conception, la fabrication et la caractérisation d’un système microfluidique capable d’aligner, d’immobiliser et de comprimer avec précision des centaines d’embryons de Drosophila melanogaster avec une intervention minimale de l’utilisateur. Ce système permet l’imagerie haute résolution et la récupération d’échantillons pour l’analyse post-stimulation et peut être mis à l’échelle pour s’adapter à d’autres systèmes biologiques multicellulaires.

Résumé

Au cours de l’embryogenèse, le mouvement cellulaire coordonné génère des forces mécaniques qui régulent l’expression et l’activité des gènes. Pour étudier ce processus, des outils tels que l’aspiration ou la compression de feuillet de couverture ont été utilisés pour stimuler mécaniquement des embryons entiers. Ces approches limitent la conception expérimentale car elles sont imprécises, nécessitent une manipulation manuelle et ne peuvent traiter que quelques embryons simultanément. Les systèmes microfluidiques ont un grand potentiel pour automatiser de telles tâches expérimentales tout en augmentant le débit et la précision. Cet article décrit un système microfluidique développé pour comprimer avec précision les embryons entiers de Drosophila melanogaster (mouche des fruits). Ce système comporte des microcanaux avec des parois latérales déformables actionnées pneumatiquement et permet l’alignement de l’embryon, l’immobilisation, la compression et la collecte post-stimulation. En parallélisant ces microcanaux en sept voies, des schémas de compression stables ou dynamiques peuvent être appliqués à des centaines d’embryons de drosophile simultanément. La fabrication de ce système sur une lamelle de verre facilite la stimulation mécanique et l’imagerie simultanées d’échantillons avec des microscopes à haute résolution. De plus, l’utilisation de matériaux biocompatibles, tels que le PDMS, et la capacité de faire circuler le fluide dans le système rendent cet appareil capable d’expériences à long terme avec des échantillons dépendants du milieu. Cette approche élimine également la nécessité d’un montage manuel qui sollicite mécaniquement les échantillons. En outre, la possibilité de collecter rapidement des échantillons à partir des microcanaux permet des analyses post-stimulation, y compris des tests -omiques qui nécessitent un grand nombre d’échantillons inaccessible avec les approches de stimulation mécanique traditionnelles. La géométrie de ce système est facilement adaptable à différents systèmes biologiques, ce qui permet à de nombreux champs de bénéficier des caractéristiques fonctionnelles décrites ici, notamment un débit d’échantillon élevé, une stimulation mécanique ou une immobilisation et un alignement automatisé.

Introduction

Les systèmes vivants subissent et répondent constamment à diverses entrées mécaniques tout au long de leur vie¹. La mécanotransduction a été liée à de nombreuses maladies, notamment les troubles du développement, la perte musculaire et osseuse et les neuropathologies par des voies de signalisation directement ou indirectement affectées par l’environnement mécanique². Cependant, les gènes et protéines qui sont régulés par stimulation mécanique³ dans les voies de signalisation mécanosensibles⁴ restent largement inconnus⁵, empêchant l’élucidation des mécanismes de régulation mécanique et l’identification de cibles moléculaires pour les maladies associées à la mécanotransduction pathologique ^6,7 . Un facteur limitant dans la projection des études de mécanobiologie sur les processus physiologiques connexes est l’utilisation de cellules individuelles avec des boîtes de culture conventionnelles au lieu d’organismes multicellulaires intacts. Les organismes modèles, tels que Drosophila melanogaster (mouche des fruits), ont grandement contribué à la compréhension des gènes, des voies de signalisation et des protéines impliquées dans le développement animal ^8,9,10. Néanmoins, l’utilisation de la drosophile et d’autres organismes modèles multicellulaires dans la recherche en mécanobiologie a été entravée par des défis liés aux outils expérimentaux. Les techniques conventionnelles de préparation, de tri, d’imagerie ou d’application de divers stimuli nécessitent principalement une manipulation manuelle; Ces approches prennent beaucoup de temps, nécessitent une expertise, introduisent de la variabilité et limitent le plan expérimental et la taille de l’échantillon¹¹. Les progrès microtechnologiques récents sont une excellente ressource pour permettre de nouveaux essais biologiques avec un débit très élevé et des paramètres expérimentaux hautement contrôlés^12,13,14.

Cet article décrit le développement d’un dispositif microfluidique amélioré pour aligner, immobiliser et appliquer avec précision une stimulation mécanique sous forme de compression uniaxiale à des centaines d’embryons entiers de drosophile ¹⁵ (Figure 1). L’intégration du système microfluidique avec une lamelle de couverture en verre a permis une imagerie confocale haute résolution des échantillons pendant la stimulation. Le dispositif microfluidique a également permis une collecte rapide des embryons après la stimulation pour l’exécution de tests -omiques (Figure 2). Des explications sur les considérations de conception de ce dispositif, ainsi que sur la fabrication par lithographie douce et caractérisation expérimentale, sont décrites ici. Étant donné que la fabrication d’un moule de plaquette de silicium d’un tel dispositif nécessite un revêtement uniforme de résine photosensible épaisse (épaisseur >200 μm) sur de grandes surfaces avec des tranchées à rapport d’aspect élevé (AR >5), cette méthode a considérablement modifié le protocole traditionnel de fabrication de moules photolithographiques. De cette façon, cette méthode a facilité la manipulation, l’adhérence, le revêtement, la structuration et le développement de la résine photosensible. De plus, les pièges potentiels et leurs solutions sont discutés. Enfin, la polyvalence de cette stratégie de conception et de fabrication a été démontrée à l’aide d’autres systèmes multicellulaires tels que les chambres à œufs de drosophile et les organoïdes cérébraux¹⁶.

Protocole

1. Préparation du moule de plaquette de silicium

1. Nettoyez d’abord la plaquette de silicium (voir le tableau des matières) avec de l’acétone, puis avec de l’alcool isopropylique (IPA).
2. Placer la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 250 °C pendant 30 minutes pour la cuisson de déshydratation (figure 3A).
3. Enduire la plaquette de silicium d’hexaméthyldisilazane (HDMS) dans un four à vapeur (voir le tableau des matériaux) (température du procédé : 150 °C, pression du procédé : 2 Torr, temps de traitement : 5 min, volume HDMS : 5 μL) (Figure 3B).
4. Placer une bouteille de résine photosensible SU-8 2100 (voir Tableau des matériaux) dans un four à 60 °C pendant 15 min pour réduire sa viscosité.
   REMARQUE: Lors du chauffage au four, la viscosité de la résine photosensible diminue. Les résines photosensibles avec une viscosité réduite peuvent être manipulées plus facilement et peuvent être versées plus précisément sur le dessus de la plaquette.
5. Placer la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 60 °C et verser 1 mL de la résine photosensible chauffée pour chaque pouce de plaquette jusqu’à ce que la résine photosensible recouvre la majeure partie de la surface (Figure 3C).
6. Transférer la plaquette de silicium revêtue de photorésine dans un enduit d’essorage (voir le tableau des matériaux).
7. Appliquer le pré-spin d’abord à 250 tr/min pendant 30 s, puis à 350 tr/min pendant 30 s supplémentaires, les deux avec une accélération de 100 tr/min (Figure 3D).
8. Retirez l’excès de résine photosensible des bords de la plaquette de silicium à l’aide d’un écouvillon de salle blanche.
9. Appliquer un spin d’abord à 500 tr/min pendant 15 s avec une accélération de 100 tr/min, puis à 1450 tr/min pendant 30 s avec une accélération de 300 tr/min (Figure 3E).
10. Retirez le cordon de bord avec un écouvillon de salle blanche.
11. Placez la plaquette de silicium sur une plaque chauffante à 50 °C et vaporisez de l’acétone sur la plaquette pour éliminer les imperfections et favoriser un revêtement uniforme (Figure 3F).
12. Augmentez lentement la température de la plaque chauffante jusqu’à 95 °C à raison de 2 °C/min.
13. Cuire doucement la plaquette de silicium à 95 °C pendant 50 min (figure 3G).
14. Refroidir lentement la plaque chauffante à température ambiante à une vitesse de 2 °C/min.
15. Placez la plaquette de silicium sur un aligneur de masque (voir le tableau des matériaux) et placez le photomasque par-dessus (reportez-vous à la figure supplémentaire 1 pour la géométrie du photomasque).
16. Exposez la plaquette de silicium à une lumière UV de 350 mJ/cm2 (35 mW/^cm2 pendant 10 s) à travers le photomasque à l’aide de l’aligneur de masque de contact (Figure 3H).
17. Appliquer des cuissons consécutives post-exposition sur la plaquette de silicium en plaçant la plaquette sur une plaque chauffante à 50 °C pendant 5 min, à 65 °C pendant 5 minutes supplémentaires et enfin à 80 °C pendant 20 minutes supplémentaires (figure 3I).
18. Refroidir lentement la plaquette de silicium à température ambiante à une vitesse de 2 °C/min.
19. Placez un agitateur magnétique d’un diamètre légèrement inférieur à celui de la plaquette de silicium dans un bécher. Retournez la plaquette de silicium et placez-la sur le dessus du bécher.
20. Placez le bécher à l’intérieur d’un autre bécher plus grand et remplissez le plus grand bécher avec une nouvelle solution de révélateur (voir le tableau des matériaux). Laissez la plaquette de silicium immergée dans le révélateur pendant 30 minutes avec l’agitateur allumé (Figure 3J).
21. Transférer la plaquette de silicium dans un sonicateur à bain à ultrasons rempli du révélateur frais pendant 1 h à 40 kHz (Figure 3K).
22. Lavez soigneusement la plaquette de silicium avec une solution IPA pour obtenir le moule final de la plaquette de silicium (Figure 3L).

2. Fabrication de la puce microfluidique

1. Placez le moule de plaquette de silicium dans un dessiccateur avec 10 gouttes (~500 μL) de trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS, voir le tableau des matériaux) dans un petit bateau de pesée à proximité.
2. Connectez le dessiccateur à une pompe à vide à environ 200 Torr pendant 30 min.
3. Fermez la vanne de déshydratation et débranchez la pompe à vide pendant la nuit pour le revêtement PFOCTS.
4. Préparer la solution de polydiméthylsiloxane prédurcie (PDMS) en mélangeant la base PDMS avec l’agent de durcissement (voir le tableau des matériaux) dans un rapport de 10:1.
5. Dégazer le mélange en le plaçant dans une centrifugeuse (500 x g pendant 5 min à température ambiante).
   REMARQUE: Cette centrifugation permet aux bulles de migrer vers la surface supérieure et d’être éliminées en peu de temps.
6. Versez la solution PDMS dégazée sur le moule de plaquette de silicium.
7. Dégazez-le à nouveau pour éliminer les bulles d’air piégées sur la surface du moule.
8. Faire durcir le PDMS dans un four à 60 °C pendant 1 h et 50 min (Figure 3M).
9. Utiliser un scalpel pour couper les bordures de la région PDMS durcie correspondant à la géométrie de la puce microfluidique (Figure 3N).
10. Décollez la partie PDMS et placez-la à l’envers sur un tapis de coupe.
11. Utilisez un rasoir pour découper la pièce PDMS dans sa forme finale (Figure 3O).
12. Percez les trous d’entrée et de sortie du PDMS à l’aide d’un poinçon de biopsie (voir le tableau des matériaux) ou d’une aiguille munie d’une pointe émoussée (figure 3P).
    1. Pour le trou d’entrée de l’embryon, utilisez un poinçon de 4 mm de diamètre.
    2. Pour les trous de sortie de l’embryon, utilisez un poinçon de 1,3 mm de diamètre.
    3. Pour le trou d’entrée de gaz, utilisez un poinçon de 2 mm.
13. Utilisez un morceau de scotch pour enlever toute particule qui pourrait rester sur la surface à motifs du PDMS.
14. Nettoyez une lame de verre rectangulaire de 24 mm x 60 mm d’abord avec de l’acétone, puis avec de l’IPA.
15. Sécher la surface vitrée à l’aide d’un pistolet à air comprimé relié à une source d’air filtrée.
16. Appliquez une cuisson de déshydratation sur la lame de verre en la plaçant sur une plaque chauffante à 250 °C pendant 2 h (figure 3Q).
17. Couvrez la lame de verre avec un bécher pour éviter toute contamination de surface.
18. Placez le PDMS, avec son côté à motifs vers le haut, et le verre déshydraté glissez dans un nettoyant plasma (voir le tableau des matériaux).
19. Traiter le PDMS et la lame de verre avec du plasma d’oxygène à 18 W pendant 30 s.
20. Placez le PDMS sur la lame de verre avec sa surface à motifs orientée vers la lame de verre pour sceller les microcanaux via une liaison covalente (Figure 3R).
21. Utilisez une pince à épiler pour pousser doucement la partie PDMS contre la lame de verre afin d’assurer un contact conformationnel complet.
22. Conservez la puce microfluidique terminée à température ambiante pendant la nuit pour permettre à la liaison d’atteindre sa force finale.

3. Préparation des embryons de mouches des fruits

1. Permettre aux mouches adultes de l’Oregon-R de pondre des œufs sur des plaques de gélose au jus de pomme (1,5 % d’agar, 25 % de jus de pomme, 2,5 % de saccharose) et recueillir les plaques au moment de développement souhaité après la ponte pour l’expérience donnée.
   NOTE: Pour les présentes expériences, les plaques ont été collectées à 140 minutes pour préparer et trier les embryons au stade de cellularisation¹⁷.
2. Inonder la gélose de lavage d’œuf embryonnaire (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) et agiter doucement les embryons avec un pinceau pour les déloger de l’agar.
3. Transférer les embryons dans une solution d’eau de Javel à 50% pendant 90 s, en remuant de temps en temps. Filtrer les embryons à travers un tamis à tissus et laver soigneusement la solution d’eau de Javel avec de l’eau.
4. Transférer les embryons dans une boîte de Petri en verre de 90 mm avec suffisamment de lavage d’œufs d’embryons pour couvrir complètement les embryons.
5. Examiner les embryons avec transillumination sur un microscope à dissection et sélectionner les embryons du stade de développement souhaité pour les charger dans le dispositif microfluidique.
   REMARQUE: Dans cette application, les embryons au stade de la cellularisation ont été sélectionnés. Les descriptions détaillées de la façon d’assurer une sélection appropriée des stades de développement se trouvent dans le manuel de laboratoire pour Drosophila¹⁷.

4. Application d’une stimulation mécanique aux embryons de mouches des fruits à l’aide de la puce microfluidique

1. Amorcez les sept microcanaux embryonnaires en les remplissant d’IPA filtrée de 0,4 μm par l’orifice d’entrée principal de l’embryon.
2. Remplacer l’IPA par de l’eau désionisée filtrée (DI) de 0,4 μm.
3. Remplacez l’eau DI par une solution de lavage d’œufs d’embryons.
4. Prélever environ 100 embryons présélectionnés dans la boîte de Petri en verre à l’aide d’une pipette en verre.
5. Pipeter les embryons dans l’orifice d’entrée de l’embryon (Figure 4A).
6. Appliquer une pression négative d’environ 3 PSI (c.-à-d. vide) à l’entrée de gaz à l’aide d’une pompe à vide portative pour ouvrir les microcanaux embryonnaires.
7. Inclinez la puce microfluidique vers le bas pour que les embryons s’alignent automatiquement et s’installent dans les microcanaux embryonnaires (Figure 4B).
8. Si les entrées du microcanal embryonnaire sont obstruées par plusieurs embryons entrant simultanément, inclinez la puce microfluidique vers le haut, puis à nouveau vers le bas pour éliminer le colmatage.
9. En fonction du débit requis, introduisez jusqu’à 300 embryons dans les microcanaux embryonnaires.
10. Une fois le chargement embryonnaire terminé, retirez le vide pour immobiliser les embryons.
11. Inclinez la puce microfluidique vers l’arrière en position horizontale (figure 4C).
12. Connectez une source portative à pression positive (voir le tableau des matériaux) munie d’un manomètre à l’entrée de gaz pour appliquer une compression de 3 PSI (figure 4D).
13. Vérifiez continuellement le manomètre pour vous assurer qu’un niveau de compression constant est appliqué.
14. Si des expériences d’imagerie en direct doivent être menées sur les embryons stimulés mécaniquement, placez la puce microfluidique sur un support de lame en verre standard au stade du microscope avec l’entrée de gaz connectée à la source de pression.
15. Une fois l’expérience de compression terminée, les embryons peuvent être collectés pour une analyse en aval. Pour ce faire, appliquez d’abord le vide à l’entrée de gaz pour libérer les embryons.
16. Ensuite, inclinez la puce microfluidique vers le haut pour que les embryons se déplacent vers le port d’introduction de l’embryon (Figure 4E).
17. Recueillir les embryons de la puce microfluidique à l’aide d’une pipette en verre.
    REMARQUE : Lors de la collecte, les effets de la compression sur le développement embryonnaire et la viabilité peuvent être étudiés en cultivant les mouches des fruits jusqu’à l’âge adulte. La capacité de traitement à haut débit du dispositif microfluidique permet également d’utiliser des embryons dans des tests omiques en aval qui nécessitent un grand nombre d’échantillons (Figure 2).

Résultats

Le système microfluidique est divisé en deux sous-compartiments séparés par des parois latérales PDMS déformables. Le premier compartiment est le système liquide où les embryons de drosophile sont introduits, automatiquement alignés, alignés et comprimés. Le deuxième compartiment est un système de gaz où la pression du gaz de chaque côté des canaux de compression est contrôlée via des microcanaux en cul-de-sac pour contrôler avec précision la largeur effective des canaux de compressi...

Discussion

L’article décrit le développement d’un dispositif microfluidique pour aligner, immobiliser et appliquer avec précision une stimulation mécanique à des centaines d’embryons entiers de drosophile . L’intégration du système microfluidique avec une fine lamelle de verre a permis l’imagerie d’embryons avec une microscopie confocale à haute résolution pendant la stimulation. Le dispositif microfluidique a également permis la collecte des embryons juste après la stimulation pour des tests biologi...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishes	Fisher	14-955-111B	Perferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si Wafer	University Wafer	452
Biopsy punches	Ted Pella	15110
Bleach			Not brand specific
Blunt needle set	CML Supply	901
Contact Mask Aligner	Quintel	Q4000 MA
Cutting mat	Dahle	Vantage 10670	size: 24" x 36"
Developer	Kayaku Advance Materials	SU-8 2000
Direct Write Lithographer	Heidelberg	MLA100
Dissecting microscope			Any commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dish	Fisher	FB0875713A
Glass slide	Warner Instruments	64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime Oven	Yes Engineering	YES-3TA
NaCl			Not brand specific
Oven	Labnet	I5110A
Paintbrush			Not brand specific
PDMS	Dow Corning	Sylgard 184
Photoresist	MicroChem	SU-8 2100
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-32G
Portable pressure source	hygger Quietest	HGD946
Pressure gauge	Cole-Parmer	EW-68950-25
Spin Coater	Laurell	WS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)	Sigma-Aldrich	448931-10G
Triton-X 100	Fisher	AAA16046AP
Tubing	Saint-Gobain	02-587-1A
Ultrasonic Cleaner	Cole-Parmer	UX-08895-05
Vacuum Pump	Cole-Parmer	EW-07164-87