JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает проектирование, изготовление и характеристику микрофлюидной системы, способной выравнивать, обездвиживать и точно сжимать сотни эмбрионов Drosophila melanogaster с минимальным вмешательством пользователя. Эта система позволяет получать изображения с высоким разрешением и восстанавливать образцы для постстимуляционного анализа и может быть масштабирована для размещения других многоклеточных биологических систем.

Аннотация

Во время эмбриогенеза скоординированное движение клеток генерирует механические силы, которые регулируют экспрессию и активность генов. Для изучения этого процесса были использованы такие инструменты, как аспирация или компрессия чехла, для механической стимуляции целых эмбрионов. Эти подходы ограничивают экспериментальное проектирование, поскольку они неточны, требуют ручного обращения и могут обрабатывать только пару эмбрионов одновременно. Микрофлюидные системы имеют большой потенциал для автоматизации таких экспериментальных задач при одновременном повышении пропускной способности и точности. В этой статье описывается микрофлюидная система, разработанная для точного сжатия целых эмбрионов Drosophila melanogaster (плодовой мухи). Эта система оснащена микроканалами с пневматически приводимыми деформируемыми боковыми стенками и обеспечивает выравнивание эмбриона, иммобилизацию, компрессию и сбор постстимуляции. Распараллеливая эти микроканалы в семь полос, устойчивые или динамические схемы сжатия могут быть применены к сотням эмбрионов дрозофилы одновременно. Изготовление этой системы на стеклянном крышке облегчает одновременную механическую стимуляцию и визуализацию образцов с помощью микроскопов высокого разрешения. Более того, использование биосовместимых материалов, таких как PDMS, и способность пропускать жидкость через систему делают это устройство способным к долгосрочным экспериментам с образцами, зависящими от среды. Такой подход также устраняет необходимость ручного монтажа, который механически напрягает образцы. Кроме того, возможность быстрого сбора образцов с микроканалов позволяет проводить постстимуляционный анализ, включая омические анализы, которые требуют больших количеств образцов, недостижимых с использованием традиционных подходов механической стимуляции. Геометрия этой системы легко масштабируется для различных биологических систем, что позволяет многочисленным полям извлекать выгоду из функциональных особенностей, описанных в настоящем описании, включая высокую пропускную способность образца, механическую стимуляцию или иммобилизацию и автоматическое выравнивание.

Введение

Живые системы постоянно испытывают и реагируют на различные механические входы на протяжении всей своей жизни1. Механотрансдукция была связана со многими заболеваниями, включая нарушения развития, потерю мышечной и костной массы, а также невропатологии через сигнальные пути, прямо или косвенно затронутые механической средой2. Однако гены и белки, которые регулируются механической стимуляцией3 в механочувствительных сигнальных путях4, остаются в значительной степени неизвестными5, препятствуя выяснению механизмов механической регуляции и идентификации молекулярных мишеней для заболеваний, связанных с патологической механотрансдукцией 6,7 . Одним из ограничивающих факторов в проецировании механобиологических исследований на связанные физиологические процессы является использование отдельных клеток с обычными культуральными блюдами вместо интактных многоклеточных организмов. Модельные организмы, такие как Drosophila melanogaster (плодовая муха), внесли большой вклад в понимание генов, сигнальных путей и белков, участвующих в развитии животных 8,9,10. Тем не менее, использование дрозофилы и других многоклеточных модельных организмов в механобиологических исследованиях было затруднено проблемами с экспериментальными инструментами. Традиционные методы подготовки, сортировки, визуализации или применения различных стимулов требуют в основном ручных манипуляций; эти подходы отнимают много времени, требуют специальных знаний, вносят вариативность и ограничивают экспериментальный дизайн и размер выборки11. Последние достижения в области микротехнологий являются отличным ресурсом для создания новых биологических анализов с очень высокой пропускной способностью и строго контролируемыми экспериментальными параметрами 12,13,14.

В этой статье описывается разработка усовершенствованного микрофлюидного устройства для выравнивания, иммобилизации и точного применения механической стимуляции в виде одноосного сжатия к сотням целых эмбрионов дрозофилы 15 (рисунок 1). Интеграция микрофлюидной системы со стеклянным чехлом позволила получить конфокальную визуализацию образцов с высоким разрешением во время стимуляции. Микрофлюидное устройство также позволило быстро собирать эмбрионы после стимуляции для проведения анализов -омики (рисунок 2). Объяснения конструктивных соображений этого устройства, а также изготовления с использованием мягкой литографии и экспериментальной характеристики описаны в настоящем документе. Поскольку изготовление силиконовой пластинчатой формы такого устройства требует равномерного покрытия толстого фоторезиста (толщина >200 мкм) на больших площадях с высоким соотношением сторон (AR) траншей (AR >5), этот метод значительно изменил традиционный протокол изготовления фотолитографической формы. Таким образом, этот метод облегчил обработку, адгезию, покрытие, рисунок и развитие фоторезиста. Кроме того, обсуждаются потенциальные подводные камни и их решения. Наконец, универсальность этой стратегии проектирования и изготовления была продемонстрирована с использованием других многоклеточных систем, таких как камеры яйцеклеток дрозофилы и органоиды мозга16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка силиконовой пластинчатой формы

  1. Очистите кремниевую пластину (см. Таблицу материалов) сначала ацетоном, а затем изопропиловым спиртом (IPA).
  2. Поместите кремниевую пластину на конфорку при температуре 250 °C в течение 30 минут для обезвоживания (рисунок 3A).
  3. Покройте кремниевую пластину гексаметилдисилазаном (HDMS) в паровой прайм-печи (см. Таблицу материалов) (температура процесса: 150 °C, рабочее давление: 2 Torr, время процесса: 5 мин, объем HDMS: 5 мкл) (рисунок 3B).
  4. Поместите бутылку фоторезиста СУ-8 2100 (см. Таблицу материалов) в духовку с температурой 60 °C на 15 мин, чтобы уменьшить ее вязкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При нагревании в духовке вязкость фоторезиста уменьшается. Фоторезисты с пониженной вязкостью могут быть обработаны легче и могут быть более точно налиты поверх пластины.
  5. Поместите кремниевую пластину на конфорку при температуре 60 °C и налейте 1 мл нагретого фоторезиста на каждый дюйм пластины, пока фоторезист не покроет большую часть поверхности (рисунок 3C).
  6. Перенесите кремниевую пластину с фоторезистичным покрытием на спин-коатер (см. Таблицу материалов).
  7. Применяйте предварительное вращение сначала при 250 об/мин в течение 30 с, а затем при 350 об/мин в течение еще 30 с, оба с ускорением 100 об/с (рисунок 3D).
  8. Удалите лишний фоторезист с краев кремниевой пластины с помощью тампона из чистой комнаты.
  9. Примените вращение сначала при 500 об/мин в течение 15 с ускорением 100 об/с, а затем при 1450 об/мин в течение 30 с ускорением 300 об/с (рисунок 3E).
  10. Удалите бусину края тампоном из чистой комнаты.
  11. Поместите кремниевую пластину на конфорку с температурой 50 °C и распылите ацетон на пластину, чтобы устранить недостатки и обеспечить равномерное покрытие (рисунок 3F).
  12. Медленно повышайте температуру конфорки до 95 °C со скоростью 2 °C/мин.
  13. Мягко запекайте кремниевую пластину при 95 °C в течение 50 мин (рисунок 3G).
  14. Медленно охлаждайте конфорку до комнатной температуры со скоростью 2°C/мин.
  15. Поместите кремниевую пластину на выравниватель маски (см. Таблицу материалов) и поместите фотомаску поверх нее (см. Дополнительный рисунок 1 для геометрии фотомаски).
  16. Подвергайте кремниевую пластину воздействию ультрафиолетового света 350 мДж/см2 (35 мВт/см2 в течение 10 с) через фотомаску с помощью выравнивателя контактной маски (рисунок 3H).
  17. Нанесите последовательные выпекания после воздействия на кремниевую пластину, поместив пластину на горячую плиту при 50 °C в течение 5 мин, при 65 °C в течение дополнительных 5 мин и, наконец, при 80 °C еще на 20 мин (рисунок 3I).
  18. Медленно охлаждайте кремниевую пластину до комнатной температуры со скоростью 2 °C/мин.
  19. Поместите магнитную мешалку с немного меньшим диаметром, чем силиконовая пластина, в стакан. Поверните кремниевую пластину вверх дном и поместите ее поверх стакана.
  20. Поместите стакан внутрь другого более крупного стакана и заполните большой стакан свежим решением для разработчиков (см. Таблицу материалов). Оставьте кремниевую пластину погруженной в разработчика на 30 минут с включенной мешалкой (рисунок 3J).
  21. Перенесите кремниевую пластину в ультразвуковую ванну соникатора, заполненную свежим разработчиком, в течение 1 ч при 40 кГц (рисунок 3K).
  22. Тщательно промойте кремниевую пластину раствором IPA для получения окончательной формы кремниевой пластины (рисунок 3L).

2. Изготовление микрофлюидного чипа

  1. Поместите силиконовую пластинчатую форму в осушитель вместе с 10 каплями (~ 500 мкл) трихлора (1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктил)силана (PFOCTS, см. Таблицу материалов) в небольшой весовой лодке поблизости.
  2. Подключите осушитель к вакуумному насосу при температуре около 200 торр в течение 30 минут.
  3. Выключите клапан осушителя и отсоедините вакуумный насос на ночь для покрытия PFOCTS.
  4. Готовят предварительно отвержденный раствор полидиметилсилоксана (PDMS), смешивая основание PDMS с отверждающим агентом (см. Таблицу материалов) в соотношении 10:1.
  5. Дегазировать смесь, поместив ее в центрифугу (500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта центрифугирование позволяет пузырькам мигрировать на верхнюю поверхность и, следовательно, удаляться в течение короткого периода времени.
  6. Вылейте дегазированный раствор PDMS на форму кремниевой пластины.
  7. Дегазируйте его снова, чтобы удалить пузырьки воздуха, попавшие на поверхность плесени.
  8. Отверните PDMS в духовке с температурой 60 °C в течение 1 ч и 50 мин (рисунок 3M).
  9. Используйте скальпель, чтобы вырезать границы отвержденной области PDMS, соответствующей микрофлюидной геометрии чипа (рисунок 3N).
  10. Очистите деталь PDMS и поместите ее вверх дном на режущий коврик.
  11. Используйте бритву, чтобы разрезать деталь PDMS в ее окончательную форму (рисунок 3O).
  12. Пробивайте входные и выпускные отверстия на PDMS с помощью биопсийного перфоратора (см. Таблицу материалов) или иглы с тупым наконечником (рисунок 3P).
    1. Для отверстия для входа эмбриона используйте перфоратор диаметром 4 мм.
    2. Для выходных отверстий эмбриона используйте перфоратор диаметром 1,3 мм.
    3. Для отверстия для впускного отверстия газа используйте перфоратор 2 мм.
  13. Используйте кусок скотча, чтобы удалить любые частицы, которые могут остаться на узорчатой поверхности PDMS.
  14. Очистите прямоугольный стеклянный затвор размером 24 мм x 60 мм сначала ацетоном, а затем IPA.
  15. Высушите поверхность стекла пневматическим пистолетом, подключенным к источнику фильтрованного воздуха.
  16. Нанесите обезвоживающую выпечку на стеклянный предметный предмет, поместив его на конфорку при температуре 250 °C в течение 2 ч (рисунок 3Q).
  17. Накройте стеклянную горку стаканом, чтобы предотвратить загрязнение поверхности.
  18. Поместите PDMS с узорчатой стороной вверх, и обезвоженное стекло скользит в плазменный очиститель (см. Таблицу материалов).
  19. Обработайте PDMS и стеклянный слайд кислородной плазмой при 18 Вт в течение 30 с.
  20. Поместите PDMS на стеклянный слайд с его узорчатой поверхностью, обращенной к стеклянному слайду, чтобы запечатать микроканалы с помощью ковалентного склеивания (рисунок 3R).
  21. Используйте пинцет, чтобы осторожно прижать деталь PDMS к стеклянному слайду, чтобы обеспечить полный конформационный контакт.
  22. Храните готовый микрофлюидный чип при комнатной температуре в течение ночи, чтобы склеивание достигло своей конечной прочности.

3. Подготовка эмбрионов плодовой мухи

  1. Позвольте взрослым мухам Oregon-R отложить яйца на тарелках с агаром из яблочного сока (1,5% агара, 25% яблочного сока, 2,5% сахарозы) и собрать пластины в нужное время развития после откладки яиц для данного эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для настоящих экспериментов пластины собирали через 140 мин для подготовки и сортировки эмбрионов на стадии клеточности17.
  2. Насыпьте агар яйцом эмбриона (0,12 M NaCl, 0,04% Triton-X 100) и осторожно перемешайте эмбрионы кистью, чтобы выбить их из агара.
  3. Перенесите эмбрионы в 50% раствор отбеливателя в течение 90 с, периодически помешивая. Процедите эмбрионы через тканевое сито и тщательно смойте раствор отбеливателя водой.
  4. Перенесите эмбрионы в стеклянную чашку Петри толщиной 90 мм с достаточным количеством яиц эмбрионов, чтобы полностью покрыть эмбрионы.
  5. Исследуем эмбрионы с трансиллюминкацией на рассекающем микроскопе и отбираем эмбрионы нужной стадии развития для загрузки в микрофлюидное устройство.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этой заявке были отобраны эмбрионы на стадии клеточности. Подробное описание того, как обеспечить правильный выбор стадии развития, можно найти в лабораторном справочнике по дрозофиле17.

4. Применение механической стимуляции к эмбрионам плодовой мухи с использованием микрофлюидного чипа

  1. Праймируйте все семь микроканалов эмбриона, заполнив их 0,4 мкм отфильтрованным IPA через главный входной порт эмбриона.
  2. Замените IPA фильтрованной деионизированной (DI) водой толщиной 0,4 мкм.
  3. Замените воду DI раствором для мытья яиц эмбриона.
  4. Соберите около 100 предварительно отобранных эмбрионов из стеклянной чашки Петри с помощью стеклянной пипетки.
  5. Пипетка эмбрионов в входной порт эмбриона (рисунок 4А).
  6. Примените отрицательное давление приблизительно 3 PSI (т.е. вакуум) к входу газа с помощью портативного вакуумного насоса, чтобы открыть микроканалы эмбриона.
  7. Наклоните микрофлюидный чип вниз, чтобы эмбрионы автоматически выровнялись и осели в микроканалах эмбриона (рисунок 4B).
  8. Если микроканальные входы эмбриона забиваются несколькими эмбрионами, входящими одновременно, наклоните микрофлюидный чип вверх, а затем снова вниз, чтобы очистить засорение.
  9. Исходя из требуемой пропускной способности, введите до 300 эмбрионов в микроканалы эмбрионов.
  10. Как только загрузка эмбриона будет завершена, удалите вакуум, чтобы обездвижить эмбрионы.
  11. Наклоните микрофлюидный чип обратно в горизонтальное положение (рисунок 4C).
  12. Подключите портативный источник положительного давления (см. Таблицу материалов) с манометром к входному отверстию газа для применения сжатия 3 PSI (рисунок 4D).
  13. Непрерывно проверяйте манометр, чтобы обеспечить постоянный уровень сжатия.
  14. Если эксперименты с визуализацией в реальном времени будут проводиться на механически стимулированных эмбрионах, поместите микрофлюидный чип на стандартный стеклянный слайд-держатель для микроскопа с газовым входом, соединенным с источником давления.
  15. Как только эксперимент по сжатию завершен, эмбрионы могут быть собраны для последующего анализа. Для этого сначала приложите вакуум к входному отверстию газа, чтобы освободить эмбрионы.
  16. Затем наклоните микрофлюидный чип вверх, чтобы эмбрионы двигались к порту введения эмбриона (рисунок 4E).
  17. Соберите эмбрионы из микрофлюидного чипа с помощью стеклянной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора, влияние сжатия на эмбриональное развитие и жизнеспособность может быть исследовано путем выращивания плодовых мушек во взрослую жизнь. Высокая пропускная способность микрофлюидного устройства обработки также позволяет использовать эмбрионы в последующих анализах на основе омики, которые требуют большого количества образцов (рисунок 2).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Микрофлюидная система разделена на два подотсека, разделенных деформируемыми боковыми стенками PDMS. Первый отсек представляет собой жидкую систему, в которую вводятся эмбрионы дрозофилы , автоматически выравниваются, выстраиваются и сжимаются. Второй отсек представляет собой га?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В статье описывается разработка микрофлюидного устройства для автоматического выравнивания, обездвиживания и точного применения механической стимуляции к сотням целых эмбрионов дрозофилы . Интеграция микрофлюидной системы с тонким стеклянным покровом позволила во время стиму...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют финансовых интересов в продуктах, описанных в этой рукописи, и им больше нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (CMMI-1946456), Управлением научных исследований ВВС (FA9550-18-1-0262) и Национальным институтом здравоохранения (R01AG06100501A1; Р21АР08105201А1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mL tri-cornered perforated plastic beakers with 60 mm Petri dishesFisher14-955-111BPerferate with air holes
100 mm P B <100> 0-100 500um SSP Test Grade Si WaferUniversity Wafer452
Biopsy punchesTed Pella15110
BleachNot brand specific
Blunt needle setCML Supply901
Contact Mask AlignerQuintelQ4000 MA
Cutting matDahleVantage 10670size: 24" x 36"
DeveloperKayaku Advance MaterialsSU-8 2000
Direct Write LithographerHeidelbergMLA100
Dissecting microscopeAny commericailly availble dissecting microscope with transmitted light
Glass petri dishFisherFB0875713A
Glass slideWarner Instruments64-0710  (CS-24/60)
HMDS Vapor Prime OvenYes EngineeringYES-3TA
NaClNot brand specific
OvenLabnetI5110A
PaintbrushNot brand specific
PDMSDow CorningSylgard 184
PhotoresistMicroChemSU-8 2100
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32G
Portable pressure sourcehygger QuietestHGD946
Pressure gaugeCole-ParmerEW-68950-25
Spin CoaterLaurellWS-650-8B
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane (PFOCTS)Sigma-Aldrich448931-10G
Triton-X 100FisherAAA16046AP
TubingSaint-Gobain02-587-1A
Ultrasonic CleanerCole-ParmerUX-08895-05
Vacuum PumpCole-ParmerEW-07164-87

Ссылки

  1. Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
  2. Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
  3. Nims, R. J., Pferdehirt, L., Guilak, F. Mechanogenetics: Harnessing mechanobiology for cellular engineering. Current Opinion in Biotechnology. 73, 374-379 (2022).
  4. Bellin, R. M., et al. Defining the Role of Syndecan-4 in Mechanotransduction using Surface-Modification Approaches. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106, 22102-22107 (2009).
  5. Simpson, L. J., Reader, J. S., Tzima, E. Mechanical regulation of protein translation in the cardiovascular system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 34(2020).
  6. Humphrey, J. D., Schwartz, M. A. Vascular mechanobiology: Homeostasis, adaptation, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 1-27 (2021).
  7. Maurer, M., Lammerding, J. The driving force: Nuclear mechanotransduction in cellular function, fate, and disease. Annual Review of Biomedical Engineering. 21, 443-468 (2019).
  8. Jennings, B. H. Drosophila-A versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  9. Konno, M., et al. State-of-the-art technology of model organisms for current human medicine. Diagnostics. 10 (6), 392(2020).
  10. Morgan, T. H. Sex limited inheritance in Drosophila. Science. 32 (812), 120-122 (1910).
  11. Wu, Q., Kumar, N., Velagala, V., Zartman, J. J. Tools to reverse-engineer multicellular systems: Case studies using the fruit fly. Journal of Biological Engineering. 13 (1), 1-16 (2019).
  12. Jayamohan, H., et al. Chapter 11 - Advances in Microfluidics and Lab-on-a-Chip Technologies. Molecular Diagnostics. Patrinos, G., et al. , Academic Press. Cambridge, MA. 197-217 (2017).
  13. Scheler, O., Postek, W., Garstecki, P. Recent developments of microfluidics as a tool for biotechnology and microbiology. Current Opinion in Biotechnology. 55, 60-67 (2019).
  14. Mohammed, D., et al. Innovative tools for mechanobiology: Unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 162(2019).
  15. Shorr, A. Z., Sönmez, U. M., Minden, J. S., LeDuc, P. R. High-throughput mechanotransduction in Drosophila embryos with mesofluidics. Lab on a Chip. 19 (7), 1141-1152 (2019).
  16. Kim, Y. T., et al. Mechanochemical Actuators of Embryonic Epithelial Contractility. Proceedings of the National Academy of Sciences. 40, 14366-14371 (2014).
  17. Ashburner, M. Drosophila. A Laboratory Handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Long Island, NY. (1989).
  18. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro-and nanoscale patterning. Nature Protocols. 5 (3), 491(2010).
  19. Lee, H., et al. A new fabrication process for uniform SU-8 thick photoresist structures by simultaneously removing edge bead and air bubbles. Journal of Micromechanics and Microengineering. 21 (12), 125006(2011).
  20. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography. Annual Review of Materials Science. 28 (1), 153-184 (1998).
  21. Sonmez, U. M., Coyle, S., Taylor, R. E., LeDuc, P. R. Polycarbonate heat molding for soft lithography. Small. 16 (16), 2000241(2020).
  22. Levario, T. J., Zhan, M., Lim, B., Shvartsman, S. Y., Lu, H. Microfluidic trap array for massively parallel imaging of Drosophila embryos. Nature Protocols. 8 (4), 721-736 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

190

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены